Name: humanized nod/scid/il2r&#947;null (hu-nsg) mouse model for hiv replication and latency studies
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Humanized NOD/SCID/IL2rÃŽÂ³null hu-NSG Mouse Model for HIV Replication and Latency Studies at JoVE.com

Este trabajo fue financiado por los institutos nacionales de salud [otorgar números R01AI29329, R01AI42552 y R01HL07470 a J.J.R.] y el Instituto Nacional del cáncer de los institutos nacionales de salud [número de licencia P30CA033572 para la ciudad de esperanza genómica Integrativa Farmacología analítica y núcleos de citometría analítica]. El siguiente reactivo se obtuvo a través de los NIH NIH SIDA programa de investigación y referencia reactivo, División de SIDA del NIAID,: virus VIH BaL.

Todos los procedimientos y cuidado de los animales se han realizado según protocolos revisado y aprobado por la ciudad de esperanza Animal atención institucional y Comité de uso (IACUC) llevó a cabo por el investigador principal de este estudio (Dr. John Rossi, IACUC #12034). Tejido hepático fetal humano se obtuvo de recursos avanzados de biociencias (Alameda, CA), una organización sin fines de lucro, conforme a las regulaciones federales y estatales. El vendedor tiene su propia Junta de revisión institucional (IR...

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Immunocompromised ratones engrafted con células y tejidos humanos presentan características fisiológicas humanas y son un enorme valor para los estudios de patología, Fisiopatología e Inmunología sobre enfermedades específicas de humanos. Entre las múltiples cepas de ratones immunocompromised, el visto bueno. CG -PrkdcscidIl2rgtm1Wji (NSG) el modelo es el más inmunodeficientes debido a su falta de inmunidad innata y adaptativa, así como del cytokine de ratón específicos seccion...

Porque el establecimiento de adecuados modelos animales para enfermedades humanas, es clave para encontrar una cura, modelos animales apropiados durante mucho tiempo han sido perseguidos y mejorado con el tiempo. Se han desarrollado múltiples variedades de modelos murinos immunocompromised que permitan el engraftment de células humanas o de los tejidos y la posterior ejecución de funciones humanizado1,2. Estos modelos de ratón humanizado son críticos para la investigación de enfermedades específicas de humanos3,4,5.
Síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) resultando de la infección con el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) es un ejemplo. Antes del establecimiento de modelos de ratón humanizado, limitaciones éticas y técnicas limitan estudios animales preclínicos de VIH/SIDA a primates no humanos3. Sin embargo, los altos gastos y requisitos para la atención especializada para tal animal dificultan estudios de VIH/SIDA en entornos académicos típicos. VIH principalmente infecta células humanas CD4 + T y afecta el desarrollo y la respuesta inmune de otras células humanas como células B, macrófagos y células dendríticas6; por lo tanto, pequeños modelos animales trasplantados con un sistema inmunológico humano funcional están en alta demanda.
Un avance se produjo en 1988, cuando CB17 -scid ratones con una mutación de Prkdcscid se desarrolló y demostró engraftment acertado del sistema inmunológico humano1. Los resultados de la mutación de Prkdcscid en funciones de las células T y B defectuosa y un sistema inmune adaptante seccionado en ratones, permitiendo el engraftment de humanos periféricos de la sangre las células mononucleares (PBMCs), las células madre hematopoyéticas (HSCs), y los tejidos hematopoyéticos fetales7,8. Sin embargo, niveles bajos del engraftment se observan con frecuencia en este modelo; las causas posibles son 1) residual actividad inmunológica innata modulada por natural killer (NK)-células y 2) el desarrollo de la etapa tardía de ratón (filtración) células T y B5. El desarrollo posterior de los diabéticos no obesos (cabeceo)-modelo de ratónscid logra dramático abajo-regulación de la actividad de células NK; así, es capaz de soportar un nivel más elevado y más sostenible engraftment del sistema inmunológico humano componentes9. Más suprimir o impedir el desarrollo de la inmunidad innata, modelos de ratón teniendo el truncamiento o el agujero ciego total de interleukin-2 receptor γ-cadena (Il2rg) en el (NOD) - Fondo descid fueron establecidos. Il2rg, también conocido como receptor del cytokine γ-cadena, es un componente indispensable de varios receptores de cytokine10,11,de12,13. Cepas como GUIÑO. CG -PrkdcscidIl2rgtm1Wji (NSG) y NODShi.Cg -PrkdcscidIl2rgtm1Sug (NOG) presentan robusta interrupción de ratón señalización de citoquinas y la ablación completa de desarrollo de la NK-célula, en Además de deterioro severo de la inmunidad adaptativa14,15,16.
Tres modelos de ratón humanizado teniendo un scid mutación y Il2rg nocaut con frecuencia se emplean en la investigación del VIH/SIDA: el modelo BLT (médula ósea/hígado/timo), el modelo de ABP (leucocitos de sangre periférica) y el modelo de la fuente (SCID repoblación celular) 3. BLT el modelo se crea vía quirúrgico trasplante de hígado fetal humano y timo bajo la cápsula del riñón de ratón acompañada con la inyección intravenosa del hígado fetal HSCs3,17,18. El modelo de ratón de BLT ofrece eficacia alta engraftment, desarrollo de las células hematopoyéticas humanas en todos los linajes y el establecimiento de un fuerte sistema inmune humano; Además, las células T son educadas en un timo humano autólogo y exhiben respuestas inmunitarias restricción HLA4,5,17,19. Sin embargo, la necesidad de procedimientos quirúrgicos sigue siendo el mayor inconveniente del modelo BLT. El modelo de ratón PBL se establece por la inyección intravenosa con linfocitos periféricos humanos. El modelo ABP ofrece comodidad y rendimientos engraftment acertado de la célula de T, pero su aplicación es limitada debido a la insuficiente de la célula de B y engraftment de células mieloides, engraftment bajo niveles general y el inicio de la severa injerto - versus - host disease (GVHD)3 ,20. El modelo de ratón de fuente se establece mediante inyección de HSCs humanas en ratones SCID de adultos jóvenes o recién nacidos. Exhibe el engraftment promedio eficiencia por encima del 25% (evaluado como sangre periférica CD45 porcentaje) y apoya el desarrollo de múltiple-linaje de HSCs inyectados y la elaboración de un sistema inmune humano innato. Sin embargo, la limitación del modelo de fuente es que la respuesta de células T es ratón H2-restringido en lugar de humanos HLA restringida14,21.
El modelo de ratón de la fuente se considera un modelo fácil y confiable para el VIH/SIDA pequeño animal estudios preclínicos, ejemplificado por el engraftment consistente de un sistema inmunológico humano y acertado desarrollo hematopoyético. Previamente informó de la creación de un modelo de ratón de NSG Hu-fuente-SCID (hu-NSG) y se describe su aplicación en la replicación del VIH y latencia estudios22,23,24. Este modelo de ratón de hu-NSG exhibe altos niveles de la médula ósea autoguiado hacia el blanco, susceptibilidad a la infección por el VIH y recapitulación de la infección por VIH y la patogénesis. Además, el modelo de ratón de hu-GSN responde adecuadamente a la terapia combinatoria antirretroviral (carro) y recapitula rebote viral del plasma sobre el retiro del carro, confirmando el establecimiento de un VIH latencia depósito25,26 ,27. Este embalse de latencia del VIH es más justificada por la producción de virus VIH réplica-competente ex vivo inducida por humanos CD4 + células T aisladas de ratones infectados y tratados con carro hu-NSG de descanso.
Adjunto, describimos el protocolo detallado para el establecimiento del modelo de ratón de hu-NSG de ratones neonatales de NSG, incluyendo procedimientos relacionados con el tratamiento del VIH infección y carro para el desarrollo de la latencia. Esperamos que este protocolo para ofrecer un nuevo conjunto de enfoques en los estudios animales sobre Virología VIH, latencia y tratamiento VIH.

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		<tr>
			<td>CD34 MicroBead Kit, human</td>
			<td>MiltenyiBiotec</td>
			<td>130-046-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoStor CS2</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>07932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wji </td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>005557</td>
			<td>Order breeders instead of experimental mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IsoFlo</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07-806-3204</td>
			<td>Order through animal facility, restricted item</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clidox disinfectant</td>
			<td>Fisher Sicentific</td>
			<td>NC9189926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wescodyne</td>
			<td>Fisher Sicentific</td>
			<td>19-818-419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton 80508 syringe/needle</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80508</td>
			<td>Custom made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood collection tube (K2EDTA)</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>367843</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood collection tube (Heparin)</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>365965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary tube (Heparinized)</td>
			<td>Fisher Sicentific</td>
			<td>22-362574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11814389001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp Viral RNA mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>52906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Fast VIrus 1-step Master Mix</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>4444434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-1 P24 ELISA (5 Plate kit)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEK050B001KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG from human serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I4506-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG from mouse serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I5381-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BB515 Mouse Anti-Human CD45 (clone HI30)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564586</td>
			<td>RRID: AB_2732068, LOT 6347696</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD3 (Clone SK7)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557851</td>
			<td>RRID: AB_396896, LOT 6021877</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue Mouse Anti-Human CD4 (Clone RPA-T4)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>558116</td>
			<td>RRID: AB_397037, LOT 6224744</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BUV395 Mouse Anti-Human CD8 (Clone RPA-T8)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563795</td>
			<td>RRID: AB_2722501, LOT 6210668</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-Alexa Fluor 750 Mouse Anti-Human CD14 (TuK4)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>MHCD1427</td>
			<td>RRID: AB_10373536, LOT 1684947A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse Anti-Human CD19 (SJ25-C1)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>MHCD1904</td>
			<td>RRID: AB_10373382, LOT 1725304B</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

humanized nod/scid/il2r&#947;null (hu-nsg) mouse model for hiv replication and latency studies

Normas éticas y desafíos técnicos para la investigación en patología humana, Inmunología y desarrollo terapéutico han colocado pequeños modelos animales en alta demanda. Con un genético y de comportamiento parecido a los seres humanos, pequeños animales como el ratón son buenos candidatos para los modelos de enfermedades humanas, a través del cual se recapitulan respuestas y humano-como síntomas. Además, el fondo genético del ratón puede modificarse para dar cabida a diversas demandas. El ratónnulo (NSG) NOD/SCID/IL2rγ es una de las cepas más ampliamente utilizado de ratón inmunocomprometidos; permite engraftment de células madre hematopoyéticas humanas o tejidos humanos y el desarrollo subsecuente de un sistema inmune humano funcional. Este es un hito fundamental en la comprensión del pronóstico y la fisiopatología de enfermedades humanos específicos como el VIH/SIDA y ayudar a la búsqueda de una cura. Adjunto, Divulgamos un protocolo detallado para generar un modelo de ratón humanizado de NSG (hu-NSG) por trasplante de células madre hematopoyéticas en un ratón NSG neonatal radiación-condicionada. El modelo de ratón de hu-NSG muestra desarrollo multilineal de trasplantado células madre humanas y susceptibilidad a la infección viral por VIH-1. También recoge características biológicas en respuesta a la terapia combinatoria antirretroviral (carro).

Análisis de citometría de flujo se realiza con frecuencia para validar la pureza de HSCs aisladas, evaluar niveles de engraftment, perfil respuestas inmunes a la infección viral y encuesta sobre eficacia del carro. Un panel de anticuerpos típica contiene anticuerpos fluorescente etiquetados cada 4-6; así, un citómetro de flujo con láser múltiples y una amplia selección de filtros es fundamental para lograr resultados precisos.
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Humanized NOD/SCID/IL2rÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³null hu-NSG Mouse Model for HIV Replication and Latency Studies

Este protocolo proporciona un método para crear ratones humanizados (hu-NSG) vía intrahepática inyección de células madre hematopoyéticas humanas en ratones NSG neonatales radiación-condicionada. El ratón hu-NSG es susceptible a la infección por VIH y la terapia combinatoria antirretroviral (carro) y sirve como un modelo fisiopatológico adecuado para investigaciones de replicación y latencia del VIH.

(Hu-NSG) ratón humanizado del NOD/SCID/IL2rγnull modelo para estudios de latencia y replicación del VIH

Ethical regulations and technical challenges for research in human pathology, immunology, and therapeutic development have placed small animal models in ...

Estos asuntos pueden ayudar a responder preguntas clave en la investigación sobre el VIH/SIDA, como el mecanismo molecular y el pronóstico de la infección por el VIH, y cómo y dónde se establece el reservorio de latencia. La ventaja de esta técnica es que no es invasiva, y estableció un hu-NSG ratones que deben tratar un desarrollo multilínea sobre células madre humanas trasplantadas que son susceptibles a la infección por VIH y son receptivas al CART. Comience filtrando una muestra digerida, humana, fetal, de lodo, a través de una muestra estéril de 70 micrómetros, nylon, malla para obtener una suspensión de una sola célula, y enriquecer para CD34+ HSCs mediante la clasificación de células activadas magnéticas de acuerdo con las instrucciones del fabricante.Después de contar, vuelva a suspender el HSC en una concentración de dos veces-diez-a-seventh células viables por mililitro en DPBS fresco en hielo. A continuación, coloque toda una camada de ratón noD/SCID/gamma o NSG humana neonatal en una jaula de irradiación estéril, en forma de pastel, y trate a los animales con 200 a 250 centígrados de rayos gamma de una fuente de radiación de cesio-137. A continuación, cargue las células en una jeringa de 50 microlitro de 50 microlitros de Hamilton 80508 equipada con una aguja de calibre 30 e inyecte a cada animal neonatal directamente en el hígado con cinco veces diez a la quinta CD34+HSC humano viable y 25 microlitros de DPBS.De diez a doce semanas después de la infección, girar retro-orbital, periférico, muestras de sangre de cada ratón por centrifugación, y transferir los supernatos de plasma a tubos de microcentrífuga para un almacenamiento negativo de 80 grados Celsius según sea experimentalmente apropiado. Para la validación de injertos de HSC, vuelva a suspender los gránulos con 200 microlitros de tampón de lysis de glóbulos rojos, y tire de las suspensiones celulares en un tubo de microcentrífuga de 1,5 milímetros para una incubación de diez minutos a temperatura ambiente. Luego recoja los glóbulos blancos restantes por centrifugación para dos lavados en 0.5 mililitros de albúmina sérica fresca, 0.01 por ciento bovino, o BSA, en DPBS por lavado.Después del segundo lavado, bloquee las células con 100 microlitros de cóctel de bloqueo durante veinte minutos a 4 grados Centígrados seguidos de etiquetado con el cóctel anticuo adecuado de interés a 2 microlitros de anticuos por concentración de una a la sexta célula. Después de 30 minutos a 4 grados celsius, lave las células dos veces en DPBS fresco más BSA, y evalúe las muestras de sangre periférica por citometría de flujo de acuerdo con los protocolos estándar para cuantificar el porcentaje de células CD45+CD3+CD14+ o CD19+ humanas por muestra. A continuación, calcule la relación de las células CD4+a CD8+T y evalúe la carga viral en las muestras de plasma de acuerdo con los protocolos estándar, cuantitativos, transcriptasa inversa, PCR.Para evaluar los efectos de la infección por el VIH, entregue el virus de las pacas del VIH a ratones sin garantía fúngica, humanos y anestesiados con una población de CD45+células humanas superiores al 20 por ciento en su sangre periférica, a una proporción de 200 nanogramos de P24 por concentración de ratón a través de la administración intraperitoneal, recogiendo muestras de sangre a través de sangrado retro-orbital cada dos semanas, y analizar tanto la relación CD4-CD8 como la carga plasmática , como se ha demostrado. Para la validación de la supresión viral, suministra a los animales NSG humanos infectados un tratamiento fresco, combinatorio, antirretroviral o cART, en agua edulcorada cada semana durante 4 semanas, recogiendo muestras de sangre a través de sangrado retro-orbital cada dos semanas y analizar tanto la relación CD4-CD8 como la carga viral plasmática como se ha demostrado. Para evaluar el rebote viral cuando las cargas virales plasmáticas están por debajo del límite de detección y la relación CD4-CD8 se restaura entre 1,5 y 2,5 recoger muestras de sangre periférica a través de sangrado retro-orbital cada 2 semanas después de la extracción de cART y evaluar las muestras como se ha demostrado.Durante la validación inicial del injerto, el recuento humano de células CD45+deben oscilar entre el 20 y el 80 por ciento, y los subconjuntos de leucocitos humanos deben aparecer como poblaciones discretas mediante el análisis citométrico de flujo. La proporción de células CD4+a CD8+ se mantiene entre 1,5 y 2,5 en individuos sanos, mientras que el agotamiento significativo de las células CD4+T se observa típicamente tras la infección viral. En particular, la proporción saludable se restaura en respuesta al tratamiento con cART.La detección de cargas virales plasmáticas por PCR RT cuantitativa a lo largo de la infección y el régimen de cART se puede trazar y utilizar para evaluar la eficiencia de la administración viral y el tratamiento antiviral, respectivamente. Aunque este método puede proporcionar información sobre los estudios de vitología del VIH/SIDA y el desarrollo terapéutico, también se puede aplicar a otros estudios relacionados con enfermedades humanas, como el cáncer, la diabetes y las enfermedades autoinmunes. El desarrollo del modelo de ratón hu-NSG allanó el camino para que los investigadores de inmunología y oncología exploraran una nueva disfunción y patología en humanos, particularmente estudios mecánicos y terapéuticos dirigidos a la infección crónica por VIH y el reservorio de latencia.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Humanized NOD/SCID/IL2r&#947;null (hu-NSG) Mouse Model for HIV Replication and Latency Studies

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Inferencia genotípica del VIH-1 tropismo utilizando la población basada en la secuencia de V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Investigación

Inmunología e Infección

Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

Disección de Host-virus Interacción en la replicación lítica de un Herpesvirus Modelo

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral ...

Using the BLT Humanized Mouse as a Stem Cell based Gene Therapy Tumor Model

Uso del ratón humanizado BLT como un modelo de células madre del tumor Terapia génica basada en

Small animal models such as mice have been extensively used to study human  disease and to develop new therapeutic interventions. Despite the wealth of  ...

Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

Humanizado modelo de ratón para el Estudio de Infecciones Bacterianas Targeting la microvasculatura

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Detección rápida de la transcriptasa inversa del VIH y inhibidores de la integrasa

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses

Crecimiento por parejas Ensayo de competición para determinar la aptitud de replicación de virus de inmunodeficiencia Humanos

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to ...

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Un modelo de tejido 3D Pulmón humano de Estudios funcionales en<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Infección

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

Medida de<em&gt; In Vitro</em&gt; Integración Actividad del VIH-1 preintegration Complejos

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...

Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection

Estudios de Virus de influenza A en un modelo murino de infección

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone ...

Establishment of the Dual Humanized TK-NOG Mouse Model for HIV-associated Liver Pathogenesis

Establecimiento del modelo de ratón TK-NOG humanizado dual para la patogénesis hepática asociada al VIH

Despite the increased life expectancy of patients infected with human immunodeficiency virus-1 (HIV-1), liver disease has emerged as a common cause of ...