Name: measuring hypopharyngeal gland acinus size in honey bee (apis mellifera) workers
Uploaded: 2018-09-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Hypopharyngeal Gland Acinus Size in Honey Bee Apis mellifera Workers at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par des fonds internes de l’USDA-ARS (numéro de projet : 2022-21000-017-00-D). L’ARS/USDA est un employeur d’égalité des chances et le fournisseur.

1. dissection et coloration des glandes hypopharyngiennes des travailleurs de l’infirmière
<ol><li>Faire une plaque de dissection de cire de fondre la cire de réglage froid dans un petit (60 mm x 15 mm) ou un verre de grande taille (100 mm x 15 mm) boîte de Pétri. Laisser refroidir complètement la cire avant d’utiliser la plaque pour les dissections.</li>
	<li>Pour chaque abeille à traiter, préparer 20 µL d’une 01:20 Giemsa solution de travail (01:20 v/v de préparé la coloration de Giemsa dans une solut...

<ol>
	<li>Kulhanek, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+national+survey+of+managed+honey+bee+2015-2016+annual+colony+losses+in+the+USA.">A national survey of managed honey bee 2015-2016 annual colony losses in the USA.</a> Journal of Apicultural Research. 56 (4), 328-340 (2017).</li><li>Jacques, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pan-European+epidemiological+study+reveals+honey+bee+colony+survival+depends+on+beekeeper+education+and+disease+control.">A pan-European epidemiological study reveals honey bee colony survival depends on beekeeper education and disease control.</a> PLoS One. 12 (3), e0172591 (2017).</li><li>Zee, R. v. d., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Results+of+international+standardised+beekeeper+surveys+of+colony+losses+for+winter+2012-2013:+analysis+of+winter+loss+rates+and+mixed+effects+modelling+of+risk+factors+for+winter+loss.">Results of international standardised beekeeper surveys of colony losses for winter 2012-2013: analysis of winter loss rates and mixed effects modelling of risk factors for winter loss.</a> Journal of Apicultural Research. 53 (1), 19-34 (2014).</li><li>Decourtye, A., Mader, E., Desneux, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Landscape+enhancement+of+floral+resources+for+honey+bees+in+agro-ecosystems.">Landscape enhancement of floral resources for honey bees in agro-ecosystems.</a> Apidologie. 41 (3), 264-277 (2010).</li><li>Vaudo, A. 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M., Walton, A., Schwan, M. R., Anderson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+markers+of+sub-optimal+nutrition+in+developing+Apis+mellifera+nurse+workers.">Transcriptional markers of sub-optimal nutrition in developing Apis mellifera nurse workers.</a> BMC Genomics. 15, 134 (2014).</li><li>Sagili, R. R., Pankiw, T., Zhu-Salzman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+soybean+trypsin+inhibitor+on+hypopharyngeal+gland+protein+content,+total+midgut+protease+activity+and+survival+of+the+honey+bee+(Apis+mellifera+L).">Effects of soybean trypsin inhibitor on hypopharyngeal gland protein content, total midgut protease activity and survival of the honey bee (Apis mellifera L).</a> Journal of Insect Physiology. 51 (9), 953-957 (2005).</li><li>Sagili, R. R., Pankiw, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+protein-constrained+brood+food+on+honey+bee+(Apis+mellifera+L.)+pollen+foraging+and+colony+growth.">Effects of protein-constrained brood food on honey bee (Apis mellifera L.) pollen foraging and colony growth.</a> Behavioral Ecology and Sociobiology. 61 (9), 1471-1478 (2007).</li><li>Hrassnigg, N., Crailsheim, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+hypopharyngeal+gland+development+to+the+brood+status+of+honeybee+(Apis+mellifera+L.)+colonies.">Adaptation of hypopharyngeal gland development to the brood status of honeybee (Apis mellifera L.) colonies.</a> Journal of Insect Physiology. 44 (10), 929-939 (1998).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9, 671 (2012).</li><li>Jack, C. J., Uppala, S. S., Lucas, H. M., Sagili, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+pollen+dilution+on+infection+of+Nosema+ceranae+in+honey+bees.">Effects of pollen dilution on infection of Nosema ceranae in honey bees.</a> Journal of Insect Physiology. 87, 12-19 (2016).</li><li>Crailsheim, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+balance+of+the+honey+bee+worker.">The protein balance of the honey bee worker.</a> Apidologie. 21, 417-429 (1990).</li></ol>

Taille des glandes hypopharyngiennes est sensible à la quantité de protéines et de pollen dans le régime alimentaire et est un marqueur essentiel de l’alimentation chez les jeunes abeilles adultes. Nous démontrons ici, de façon reproductible et peu coûteuse, de disséquer et de mesurer ce tissu. Ces tissus peuvent être difficiles à disséquer, mais avec la pratique, on peut obtenir les dissections nettoyeur de plus en plus avec le tissu relativement intacte. Le principal avantage de la méthode présentée ici...

Abeilles à miel sont essentielles pour l’agriculture car ils pollinisent une variété de cultures qui sont consommés par les humains et les animaux. Beaucoup d’attention a été payé au déclin des populations d’abeilles de miel comme stationnaire de pertes de colonies autour de 30-40 % chaque année dans les États-Unis d’Amérique1 et 10 à 15 % en Europe2,3. Plusieurs facteurs, y compris la réduction de l’accès à la haute qualité de fourrage, probable acte ensemble pour nuire à la santé des abeilles miel. Monoculture, la sécheresse, les pratiques non durables de l’apiculture et autres facteurs diminuent la diversité et la quantité de pollen naturel disponible aux colonies4,5. Parce que les abeilles la quasi-totalité de leurs protéines alimentaires et lipides dérivent de pollen, accès réduit au pollen peut limiter sévèrement santé individuelle et de la colonie.
Les glandes hypopharyngiennes sont des structures sécrétrices situés en tête de l’abeille entre les yeux et le cerveau6. Dans des circonstances normales, la trajectoire développementale et fonctionnelle des glandes refléter celle de l’abeille se trouvent bien dans. Environ 5 à 10 jours après la naissance, l’abeille effectue des comportements de soins infirmiers dans la ruche. Dans ce même temps, les glandes hypopharyngiennes atteignent leur taille maximale et la capacité sécrétoire, produisant la fraction de protéine majeure de la couvée alimentaire ou la gelée nourri au développement des larves et autres adultes, tels que la Reine. À cette taille maximale, les glandes ressemblent à une grappe de raisin où chaque raisin est une structure discrète lobe appelée l’acinus (pluriel : acini). Comme l’abeille d’ouvrier ages et prend sur les différentes tâches dans la ruche, les glandes hypopharyngiennes rétrécissement et assumer des fonctions différentes, comme faire tomber les sucres dans le nectar7,8. Les glandes hypopharyngiennes sont donc en corrélation avec l’âge de l’abeille et leur tâche liée à l’âge.
Taille de glandes hypopharyngiennes infirmière est sensible à la quantité et la qualité des protéines dans leur alimentation9,10,11. Lorsque l’infirmière abeilles sont bien nourris, leurs glandes sont grandes. Considérant que les glandes sont petites quand l’abeille est privée de pollen, en particulier dans la première semaine de développement adulte. Afin de déterminer l’état nutritionnel d’une abeille d’infirmière, les chercheurs mesurent généralement les glandes hypopharyngiennes, soit en mesurant directement la glande acinus taille11,12,13,14 ou protéine contenu15,16 ou par la mesure de la protéine contenu11 ou poids frais17 de la tête entière où ils se trouvent. Chaque méthode a ses propres avantages et inconvénients. Nous préférons la résolution obtenue de mesurer les acini des glandes, bien que cette méthode peut être difficile de deux manières principales. Le premier défi consiste à identifier correctement et de disséquer la glande. La seconde est d’obtenir une mesure exacte de chaque acinus. Sous un microscope photonique dissection, les glandes apparaissent blanc transparent ou laiteux et des frontières des acini peuvent être difficiles à définir. Avoir des outils pour mieux définir le bord des acini et d’augmenter la probabilité d’obtenir des mesures précises de la glande est bénéfique à quiconque étudie miel abeille nutrition.
Ici, nous montrons les chercheurs intéressés comment disséquer, Angiome, image et mesurer les glandes hypopharyngiennes afin que des mesures précises de la taille de l’acinus est possible. La méthode que nous décrivons offre aux chercheurs une méthode facile, précise et reproductible pour la réalisation de multiples mesures de glande dans une période relativement courte de temps une fois que l’expérimentateur est suffisamment pratiqué. On pourrait en toute confiance mesurer les glandes de près de 10 personnes en un peu plus d’une heure. Nous offrons des détails sur la méthode et le matériel nécessaire à l’obtention de ces mesures. Les aspects les plus importants des méthodes décrites ci-dessous sont la bonne dissection et coloration des glandes. Bien que nous capturer les images grossies et mesurer les acini avec des logiciels commerciaux, les méthodes que nous présentons peuvent facilement être adaptés à d’autres plates-formes18.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cool setting wax</td>
			<td>Grobet USA</td>
			<td>21.450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass petri dish, small</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89000-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass petri dish, large</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89000-314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Max Wax Pen</td>
			<td>Eurotool</td>
			<td>PEN-520.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breakable razor blades</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pin vise</td>
			<td>BioQuip</td>
			<td>4845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2A-SA flat/rounded tip forceps</td>
			<td>Rubis/BioQuip</td>
			<td>4522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine point forceps</td>
			<td>Rubis/BioQuip</td>
			<td>4523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5A-SA super fine point forceps</td>
			<td>Rubis/BioQuip</td>
			<td>4525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mm micro spring scissors</td>
			<td>BioQuip</td>
			<td>4715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mm micro spring Vannas scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Depression Slides, Single Cavity</td>
			<td>GSC International</td>
			<td>4-13057-DZ-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS tablets</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Giemsa stain, modified solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>32884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect pins</td>
			<td>ENTO SPHINX S.R.O.</td>
			<td>02.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Applications Suite measurement software</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>any measurement software, including free software, can be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring hypopharyngeal gland acinus size in honey bee (apis mellifera) workers

Les glandes hypopharyngiennes infirmière produisent la fraction protéique du travailleur et la gelée royale qui est alimentée au développement des larves et des reines. Ces glandes jumelés qui sont trouvent dans la tête de l’abeille sont très sensibles à la quantité et qualité de pollen et de pollen suppléants que l’infirmière abeille consomme. Les glandes deviennent plus petits quand les infirmières sont nourris avec une alimentation déficiente et sont grands lorsqu’ils sont nourris avec une alimentation complète. Taille de glandes hypopharyngiennes infirmière étant un indicateur robuste de nutrition de l’infirmière, il est essentiel que ceux qui étudient le miel abeille nutrition savent comment mesurer ces glandes. Ici, nous fournissons des méthodes détaillées pour disséquer, coloration, imagerie et mesurer les glandes hypopharyngiennes d’infirmière abeille. Nous présentons des comparaisons des tissus incolores et colorées et les données qui ont été utilisées pour étudier l’impact du pollen sur la taille de la glande. Cette méthode a été utilisée pour tester comment alimentation impact sur la taille des glandes hypopharyngiennes mais a utilisation ultérieure pour comprendre le rôle de ces glandes en santé de la ruche.

Glandes hypopharyngiennes ont été disséquées de travailleurs de l’infirmière et visualisées avec et sans tache un grossissement de X 60 à 80 (Figure 1). Dans les tissus sans tache, il est difficile de trouver le bon contraste de pleinement se concentrer et de définir les bords des acini. Le tissu taché, les bords des acini sont affûtées en raison du contraste amélioré entre les tissus colorés et le fond blanc.
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Measuring Hypopharyngeal Gland Acinus Size in Honey Bee Apis mellifera Workers

Mesure taille de Acinus glandes hypopharyngiennes chez les travailleurs de l’abeille à miel (Apis mellifera)

Taille d’acinus glandes hypopharyngiennes est une mesure fiable d’infirmière nutrition de miel abeille. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour la dissection, coloration, imagerie et mesurer les acini de glande infirmière abeille laryngée.

The nurse hypopharyngeal glands produce the protein fraction of the worker and royal jelly that is fed to developing larvae and queens. These paired ...

Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine de la nutrition des abeilles mellifeuales, sur le lien entre une mauvaise nutrition et la croissance et le développement hypopharyngéels des glandes. Le principal avantage de cette technique est que l’on peut l’utiliser pour tacher, visualiser et mesurer facilement les glandes hypopharyngéales des abeilles. En général, les individus nouveaux à cette méthode auront du mal parce que les glandes hypopharyngéales peuvent être difficiles à localiser et à disséquer sans guidage visuel.Avant de commencer l’intervention, verser la cire de réglage fraîche fondue dans une boîte de Pétri en verre. Ajouter 20 microlitres de taches giemsa fraîchement préparées dans un puits, et 50 à 100 microlitres de solution saline dans un puits adjacent d’une lame de microscope, par abeille infirmière ouvrière à traiter. Lorsque la cire est réglée, utilisez des ciseaux micro ressorts de 10 millimètres pour enlever la tête de la première abeille et utiliser des forceps, un microscope dissection et un stylo à découper en cire pour intégrer la tête sur le côté avant dans la plaque de dissection de cire.Insérez des épingles dans les yeux et la bouche pour fixer la tête à la plaque, et utilisez une lame de rasoir tranchante et cassante fixée dans un étau à broches pour faire une incision de deux à trois millimètres entre les yeux et les mandibules de chaque côté de la plaque du visage. Exécutez doucement les micro ciseaux sous la plaque du visage et coupez le nerf antenne qui court entre l’antenne et le cerveau. À l’aide de forceps fins, saisir la plaque du visage par la bouche, et épingler le tissu face vers le bas à la cire avec des forceps point fin et une épingle.Ensuite, pipette 20 microlitres de PBS sur la section ouverte de la tête. Les glandes hypopharyngéales ressemblent à une chaîne de perles et sont situées sur le dessus du cerveau si elles sont intactes. À l’aide de forceps de pointe super fins, récoltez doucement l’une des glandes pour une immersion immédiate dans la tache de Giemsa sur la glissière de microscopie.Après une incubation de cinq minutes, transférer la glande à la piscine de solution saline sur la même diapositive, en coupant la glande en petits morceaux sous le microscope avec les micro ciseaux si nécessaire. Pour mesurer les glandes, ouvrez le programme de mesure pour le microscope léger, et sélectionnez le grossissement 10 fois. Placez la lame sur le stade du microscope et localisez manuellement les glandes à travers le morceau d’oeil.Augmentez le grossissement à 60 à 80 fois et ajustez manuellement l’orientation des glandes au nouveau grossissement. Ajustez davantage la mise au point des glandes sur l’image en direct sur le moniteur et entrez le nom de l’image et la description de l’échantillon dans la boîte de nom de l’image. Cliquez sur Acquérir l’image pour obtenir une image des glandes et sous l’onglet Analyse, sélectionnez l’outil Zone et désélectrez la valeur sous les onglets Display.l’unité ne sera pas sélectionnée. Définissez tous les autres paramètres par défaut. Pour mesurer l’acini, cliquez ou maintenez continuellement le bouton de la souris gauche tout en traçant un périmètre d’acinus à la fois aussi soigneusement que possible.Une fois que tous les acini à partir d’une seule image ont été mesurés sélectionnez Créer rapport, confirmant que les options appropriées sont sélectionnées, et cliquez sur Exportation. Ensuite, enregistrez le rapport dans un format approprié et nettoyez la zone de travail et les matériaux, le cas échéant. Il est difficile de trouver un contraste approprié et des bords définis de l’acini dans les tissus non tachés.Dans les glandes hypopharyngéales tachées, les bords de l’acini sont pointus en raison du contraste amélioré entre le tissu taché et le fond blanc. Les glandes hypopharyngéales poussent au fil du temps chez les abeilles qui sont nourries au miel mélangé avec du pollen, par rapport aux abeilles qui sont nourries au miel seul. La taille hypopharyngéale de glande est également sensible au type de pollen fourni.Par exemple, les abeilles nourries au pollen de désert ou d’amandes démontrent des glandes d’une taille équivalente, tandis que les abeilles nourries au pollen du sud-est présentent des glandes plus grandes que le miel seules nourries aux abeilles, mais plus petites que les glandes des abeilles nourries aux amandes ou au pollen du désert. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de disséquer soigneusement les glandes et de ne pas les trop ou sous-tacher. N’oubliez pas que le travail avec la tache de Giemsa peut être dangereux et que des précautions, telles que garder la tache loin des flammes, en utilisant l’élimination appropriée, et le port de gants et de protection oculaire doit toujours être prise lors de l’exécution de cette procédure.

Research

JoVE Journal

Environment

Measuring Hypopharyngeal Gland Acinus Size in Honey Bee (Apis mellifera) Workers

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Recherche

Environnement

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