Name: measuring hypopharyngeal gland acinus size in honey bee (apis mellifera) workers
Uploaded: 2018-09-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Hypopharyngeal Gland Acinus Size in Honey Bee Apis mellifera Workers at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por fondos internos de la USDA-ARS (número del proyecto: 2022-21000-017-00-D). ARS/USDA es un proveedor y empleador de igual oportunidad.

1. disección y tinción de las glándulas hipofaríngeas de trabajadores de la enfermera
<ol><li>Hacer una placa de disección cera derritiendo cera ajuste cool en un pequeño (60 mm x 15 mm) o placa de Petri de vidrio grande (100 x 15 mm). Enfríe la cera antes de usar la placa para disecciones.</li>
	<li>Para que cada abeja a procesar, preparar 20 μl de una 1:20 solución Giemsa diluida (1:20 v/v del preparado mancha de Giemsa en solución salina tamponada con fosfato (PBS: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM de Na...

<ol>
	<li>Kulhanek, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+national+survey+of+managed+honey+bee+2015-2016+annual+colony+losses+in+the+USA.">A national survey of managed honey bee 2015-2016 annual colony losses in the USA.</a> Journal of Apicultural Research. 56 (4), 328-340 (2017).</li><li>Jacques, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pan-European+epidemiological+study+reveals+honey+bee+colony+survival+depends+on+beekeeper+education+and+disease+control.">A pan-European epidemiological study reveals honey bee colony survival depends on beekeeper education and disease control.</a> PLoS One. 12 (3), e0172591 (2017).</li><li>Zee, R. v. d., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Results+of+international+standardised+beekeeper+surveys+of+colony+losses+for+winter+2012-2013:+analysis+of+winter+loss+rates+and+mixed+effects+modelling+of+risk+factors+for+winter+loss.">Results of international standardised beekeeper surveys of colony losses for winter 2012-2013: analysis of winter loss rates and mixed effects modelling of risk factors for winter loss.</a> Journal of Apicultural Research. 53 (1), 19-34 (2014).</li><li>Decourtye, A., Mader, E., Desneux, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Landscape+enhancement+of+floral+resources+for+honey+bees+in+agro-ecosystems.">Landscape enhancement of floral resources for honey bees in agro-ecosystems.</a> Apidologie. 41 (3), 264-277 (2010).</li><li>Vaudo, A. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Division+of+labor+in+honeybees:+form,+function,+and+proximate+mechanisms.">Division of labor in honeybees: form, function, and proximate mechanisms.</a> Behavioral Ecology and Sociobiology. 64 (3), 305-316 (2010).</li><li>Crailsheim, K., Stolberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+diet,+age+and+colony+condition+upon+intestinal+proteolytic+activity+and+size+of+the+hypopharyngeal+glands+in+the+honeybee+(Apis+mellifera+L).">Influence of diet, age and colony condition upon intestinal proteolytic activity and size of the hypopharyngeal glands in the honeybee (Apis mellifera L).</a> Journal of Insect Physiology. 35 (8), 595-602 (1989).</li><li>Pernal, S. F., Currie, R. 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M., Walton, A., Schwan, M. R., Anderson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+markers+of+sub-optimal+nutrition+in+developing+Apis+mellifera+nurse+workers.">Transcriptional markers of sub-optimal nutrition in developing Apis mellifera nurse workers.</a> BMC Genomics. 15, 134 (2014).</li><li>Sagili, R. R., Pankiw, T., Zhu-Salzman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+soybean+trypsin+inhibitor+on+hypopharyngeal+gland+protein+content,+total+midgut+protease+activity+and+survival+of+the+honey+bee+(Apis+mellifera+L).">Effects of soybean trypsin inhibitor on hypopharyngeal gland protein content, total midgut protease activity and survival of the honey bee (Apis mellifera L).</a> Journal of Insect Physiology. 51 (9), 953-957 (2005).</li><li>Sagili, R. R., Pankiw, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+protein-constrained+brood+food+on+honey+bee+(Apis+mellifera+L.)+pollen+foraging+and+colony+growth.">Effects of protein-constrained brood food on honey bee (Apis mellifera L.) pollen foraging and colony growth.</a> Behavioral Ecology and Sociobiology. 61 (9), 1471-1478 (2007).</li><li>Hrassnigg, N., Crailsheim, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+hypopharyngeal+gland+development+to+the+brood+status+of+honeybee+(Apis+mellifera+L.)+colonies.">Adaptation of hypopharyngeal gland development to the brood status of honeybee (Apis mellifera L.) colonies.</a> Journal of Insect Physiology. 44 (10), 929-939 (1998).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9, 671 (2012).</li><li>Jack, C. J., Uppala, S. S., Lucas, H. M., Sagili, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+pollen+dilution+on+infection+of+Nosema+ceranae+in+honey+bees.">Effects of pollen dilution on infection of Nosema ceranae in honey bees.</a> Journal of Insect Physiology. 87, 12-19 (2016).</li><li>Crailsheim, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+balance+of+the+honey+bee+worker.">The protein balance of the honey bee worker.</a> Apidologie. 21, 417-429 (1990).</li></ol>

Tamaño de la glándula hipofaríngea es sensible a la cantidad de proteínas y polen en la dieta y es un marcador importante de alimentación en abejas adultas jóvenes. Aquí, demostramos una forma económica y reproducible para analizar y medir este tejido. Estos tejidos pueden ser difíciles de disecar, pero con la práctica, se pueden obtener cada vez más limpiador disecciones con el tejido relativamente intacta. La principal ventaja del método presentado aquí es que el tejido se tiñe, que permite al investigado...

Miel de abejas es esenciales para la agricultura porque ellos polinizan una variedad de cultivos que son consumidos por los seres humanos y animales. Mucha atención se ha pagado a la declinación de las poblaciones de abejas como suspender las pérdidas de Colonia alrededor del 30-40% cada año en los Estados Unidos1 y 10 – 15% en Europa2,3. Múltiples factores, incluyendo el reducido acceso a la alta calidad de forraje, probable ley para afectar negativamente la salud de abejas de miel. Monocultivo, la sequía, las prácticas insostenibles de la apicultura y otros factores disminución de la diversidad y cantidad de polen natural disponible para las colonias4,5. Porque abejas derivan casi todos su dieta proteínas y lípidos de polen, acceso reducido al polen puede limitar severamente la salud individual y Colonia.
Las glándulas de la hipofaringe son estructuras secretoras situadas en cabeza de la abeja entre los ojos y el cerebro6. En circunstancias normales, la trayectoria del desarrollo y funcional de las glándulas de la abeja se encuentran en espejo. En aproximadamente 5 – 10 días de edad, la abeja realiza comportamientos de enfermería en la colmena. En este mismo tiempo, las glándulas hipofaríngeas alcanzan su máximo tamaño y capacidad secretora, produciendo la fracción de la proteína importante del alimento de cría o alimentada al desarrollo de las larvas y otros adultos, como la reina de la jalea. En este tamaño de pico las glándulas se asemejan a un racimo de uvas donde cada uva es una estructura discreta lóbulo conocida como los acinos (plural: acinos). Como la abeja del trabajador envejece y adquiere diferentes tareas en la colmena, las glándulas de la hipofaringe se encogerán y asumir diferentes funciones, como romper azúcares en el néctar7,8. Por lo tanto, las glándulas hipofaríngeas se correlacionan con la edad de la abeja y su tarea relacionado con la edad.
Tamaño de la glándula hipofaríngea enfermera es sensible a la cantidad y la calidad de la proteína en su dieta9,10,11. Cuando las abejas de la enfermera están bien alimentadas, sus glándulas son grandes. Mientras que las glándulas son pequeñas cuando la abeja carece de polen, especialmente en la primera semana del desarrollo adulto. Para determinar el estado nutricional de una abeja de la enfermera, los investigadores suelen medir las glándulas hipofaríngeas, ya sea por medición directa de la glándula acino tamaño11,12,13,14 o proteína15,16 de contenido fresco peso17 de toda la cabeza donde se encuentran o midiendo la proteína contenido11 . Cada método tiene sus propios pros y contras. Preferimos la resolución de la medición de los acinos de la glándula, aunque este método puede ser un desafío en dos formas principales. El primer desafío es identificar y disecar la glándula. La segunda es obtener una medida exacta de cada acino. Con un microscopio de disección ligero, las glándulas aparecen blanco claro o lechoso y las fronteras de los acinos pueden ser difíciles de definir. Tener herramientas para definir mejor el borde de los acinos y para aumentar la probabilidad de obtener mediciones precisas de la glándula es beneficioso para nadie estudiando nutrición de abejas de miel.
Aquí, mostramos investigadores interesados cómo diseccionar, mancha, imagen y medir glándulas hipofaríngeas por lo que pueden lograr mediciones precisas del tamaño de acinos. El método que describimos ofrece a los investigadores un método fácil, preciso y reproducible para la consecución de varias mediciones de la glándula en un período relativamente corto de tiempo una vez que el experimentador se practica lo suficiente. Uno podría medir con confianza las glándulas de casi 10 personas en poco más de una hora. Ofrecemos información sobre el método y los materiales necesarios para obtener estas medidas. Los aspectos más importantes de los métodos descritos a continuación son la adecuada disección y tinción de las glándulas. Aunque capturar las imágenes magnificadas y medimos los acinos con software comercial, los métodos que presentamos pueden ser fácilmente adaptados a otras plataformas18.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cool setting wax</td>
			<td>Grobet USA</td>
			<td>21.450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass petri dish, small</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89000-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass petri dish, large</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89000-314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Max Wax Pen</td>
			<td>Eurotool</td>
			<td>PEN-520.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breakable razor blades</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pin vise</td>
			<td>BioQuip</td>
			<td>4845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2A-SA flat/rounded tip forceps</td>
			<td>Rubis/BioQuip</td>
			<td>4522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine point forceps</td>
			<td>Rubis/BioQuip</td>
			<td>4523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5A-SA super fine point forceps</td>
			<td>Rubis/BioQuip</td>
			<td>4525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mm micro spring scissors</td>
			<td>BioQuip</td>
			<td>4715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mm micro spring Vannas scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Depression Slides, Single Cavity</td>
			<td>GSC International</td>
			<td>4-13057-DZ-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS tablets</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Giemsa stain, modified solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>32884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect pins</td>
			<td>ENTO SPHINX S.R.O.</td>
			<td>02.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Applications Suite measurement software</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>any measurement software, including free software, can be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring hypopharyngeal gland acinus size in honey bee (apis mellifera) workers

Las enfermera las glándulas hipofaríngeas producen la fracción proteica del trabajador y la jalea real que se alimenta con el desarrollo de larvas y reinas. Estas glándulas apareadas que se encuentran en la cabeza de la abeja son muy sensibles a la cantidad y calidad de polen y polen sustituye que consume la abeja enfermera. Las glándulas consigue más pequeño cuando las enfermeras son alimentadas con dietas deficientes y son grandes cuando son alimentadas con dietas completas. Porque el tamaño de la glándula hipofaríngea enfermera es un indicador robusto de la enfermera de nutrición, es fundamental que quienes estudian miel abeja nutrición saben cómo medir estas glándulas. Aquí, ofrecemos métodos detallados para la disección, la coloración, la proyección de imagen y medición glándulas hipofaríngeas de enfermeras abeja. Presentamos las comparaciones de datos que se utilizaron para estudiar el impacto de polen en el tamaño de la glándula y tejido sin manchas y manchado. Este método se ha utilizado para probar cómo dieta afecta el tamaño de la glándula hipofaríngea pero tiene otro uso para la comprensión de la función de estas glándulas en la salud de la colmena.

Glándulas hipofaríngeas fueron disectadas de los trabajadores de enfermería y visualizadas con y sin mancha en 60 – 80 X de ampliación (figura 1). En el tejido sin mancha, es difícil encontrar contraste apropiado enfocar y definir los bordes de los acinos. En el tejido manchado, las de los acinos están afiladas debido al mayor contraste entre el tejido manchado y el fondo blanco.
<img alt="F...

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Measuring Hypopharyngeal Gland Acinus Size in Honey Bee Apis mellifera Workers

Medición de hipofaringe tamaño de acino de glándula en trabajadores de la abeja (Apis mellifera)

Tamaño de acino de glándula hipofaríngea es una medida robusta de enfermera nutrición de abejas de miel. Presentamos un protocolo detallado para disección, tinción, proyección de imagen y medición acinos de la glándula de enfermera abeja hipofaríngeo.

The nurse hypopharyngeal glands produce the protein fraction of the worker and royal jelly that is fed to developing larvae and queens. These paired ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la nutrición de la abeja melígri venal, sobre el vínculo entre la mala nutrición y el crecimiento y desarrollo de la glándula hipofaríngea. La principal ventaja de esta técnica es que se puede utilizar para manchar, visualizar y medir fácilmente las glándulas hipofaríngeas de las abejas. Generalmente, los individuos nuevos en este método lucharán porque las glándulas hipofaríngeas pueden ser difíciles de localizar y diseccionar sin guía visual.Antes de comenzar el procedimiento, vierta la cera fría derretida en un plato de Petri de vidrio. Agregue 20 microlitros de la mancha Giemsa recién preparada en un pozo, y 50 a 100 microlitros de solución salina en un pozo adyacente de un portaobjetos de microscopio, por abeja trabajadora enfermera que se procesará. Cuando la cera se haya establecido, utilice tijeras de micro muelle de 10 milímetros para quitar la cabeza de la primera abeja y utilizar fórceps, un microscopio de disección y una pluma de tallado de cera para incrustar la cabeza de lado hacia arriba en la placa de disección de cera.Inserte alfileres en los ojos y la boca para fijar la cabeza a la placa, y utilice una cuchilla de afeitar afilada y rompible fijada en una visera de pasador para hacer una incisión de dos a tres milímetros entre los ojos y las mandíbulas a cada lado de la placa frontal. Coloque suavemente las micro tijeras debajo de la placa frontal y corte el nervio antena que se extiende entre la antena y el cerebro. Usando fórceps finos, agarre la placa frontal por la boca, y clavar el tejido boca abajo a la cera con fórceps de punto fino y un alfiler.A continuación, pipetear 20 microlitros de PBS en la sección abierta de la cabeza. Las glándulas hipofaríngeas parecen una cadena de perlas y se encuentran en la parte superior del cerebro si están intactas. Usando fórceps de punto súper fino, cosecha suavemente una de las glándulas para una inmersión inmediata en la mancha de Giemsa en el portaobjetos de microscopía.Después de una incubación de cinco minutos, transfiera la glándula a la piscina de solución salina en el mismo portaobjetos, cortando la glándula en trozos más pequeños bajo el microscopio con las micro tijeras según sea necesario. Para medir las glándulas, abra el programa de medición para el microscopio de luz y seleccione el aumento 10 veces. Coloque la diapositiva en la etapa del microscopio y localice manualmente las glándulas a través de la pieza del ojo.Aumente el aumento a 60 a 80 veces y ajuste manualmente el enfoque de las glándulas en el nuevo aumento. Ajuste aún más el enfoque de las glándulas en la imagen en vivo en el monitor e introduzca el nombre de la imagen y la descripción de la muestra en el cuadro de nombre de la imagen. Haga clic en Adquirir imagen para obtener una imagen de los prensaestcos y, en la pestaña Análisis, seleccione la herramienta Area y ancle Value en Mostrar fichas.La unidad también no se seleccionará. Establezca todos los demás ajustes en el valor predeterminado. Para medir el acini, haga clic o mantenga pulsado el botón izquierdo del ratón mientras traza un perímetro acinus a la vez con el máximo cuidado posible.Una vez medido todo el acini de una sola imagen, seleccione Crear informe, confirme que se han seleccionado las opciones adecuadas y haga clic en Exportar. A continuación, guarde el informe en un formato adecuado y limpie el área de trabajo y los materiales según corresponda. Es difícil encontrar un contraste adecuado y bordes definidos del acini en tejidos no manchados.En las glándulas hipofaríngeas teñidas, los bordes del acini son afilados debido a la mejora del contraste entre el tejido teñido y el fondo blanco. Las glándulas hipofaríngeas crecen con el tiempo en abejas que se alimentan de miel mezclada con polen, en comparación con las abejas que se alimentan solo de miel. El tamaño de la glándula hipofaríngea también es sensible al tipo de polen proporcionado.Por ejemplo, las abejas alimentadas con polen desértico o almendra demuestran glándulas de tamaño equivalente, mientras que las dietas alimentadas con polen del sureste exhiben glándulas que son más grandes que las abejas alimentadas con miel sola, pero más pequeñas que las glándulas alimentadas con abejas alimentadas con almendras o polen del desierto. Al intentar este procedimiento, es importante recordar diseccionar cuidadosamente las glándulas y no sobre-o mancharlas. No olvide que trabajar con la mancha Giemsa puede ser peligroso y que las precauciones, como mantener la mancha alejada de las llamas, el uso de la eliminación adecuada, y el uso de guantes y protección para los ojos siempre deben tomarse durante la realización de este procedimiento.

Research

JoVE Journal

Environment

Measuring Hypopharyngeal Gland Acinus Size in Honey Bee (Apis mellifera) Workers

Measuring Fluxes of Mineral Nutrients and Toxicants in Plants with Radioactive Tracers

Flujos de nutrientes minerales y sustancias tóxicas de medición en plantas con Trazadores Radiactivos

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Investigación

Medio ambiente

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Medición de Precios de los herbicidas Metabolismo en Dicot malas hierbas con un ensayo extirpados Leaf

In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we ...

A Push-pull Protocol to Reduce Colonization of Bird Nest Boxes by Honey Bees

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