Name: force-clamp rheometry for characterizing protein-based hydrogels
Uploaded: 2018-08-21T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Force-Clamp Rheometry for Characterizing Protein-based Hydrogels at JoVE.com

Wij erkennen de financiële steun uit onderzoek groei-initiatief (Award nr. 101 X 340), National Science Foundation, grote onderzoeksprogramma voor instrumentatie (Grant nr. PHY-1626450), grotere Milwaukee Stichting (Shaw Award) en de Universiteit van Wisconsin systeem (toegepast onderzoek Grant).

1. reagentia oplossing voorbereiding
<ol><li>Bereid een startende eiwit-oplossing door ontbinding/verdunnen van de proteïne van belang zijn voor de gewenste concentratie, met behulp van een Tris-buffer [20 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane en 150 mM NaCl, pH 7.4]. Opmerking: De kleinste eiwitconcentratie voor die cross-linking leidt tot hydrogels hangt af van het eiwit gebruikt en is meestal > 1 mM.</li>
	<li>Bereiden van voorraden van ammoniumnitraat persulfate (APS) (1 M) en tris(bipyridine)ruthenium(II) chlor...

<ol>
	<li>Cao, Y., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+chemical+denaturants+affect+the+mechanical+folding+and+unfolding+of+proteins?.">How do chemical denaturants affect the mechanical folding and unfolding of proteins?.</a> Journal of Molecular Biology. 375 (1), 316-324 (2008).</li><li>Carrion-Vazquez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+and+chemical+unfolding+of+a+single+protein:+a+comparison.">Mechanical and chemical unfolding of a single protein: a comparison.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 3694-3699 (1999).</li><li>Wiita, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+chemistry+of+thioredoxin+catalysis+with+force.">Probing the chemistry of thioredoxin catalysis with force.</a> Nature. 450 (7166), 124-127 (2007).</li><li>Lv, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designed+biomaterials+to+mimic+the+mechanical+properties+of+muscles.">Designed biomaterials to mimic the mechanical properties of muscles.</a> Nature. 465 (7294), 69-73 (2010).</li><li>Plumere, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+redox+hydrogel+protects+hydrogenase+from+high-potential+deactivation+and+oxygen+damage.">A redox hydrogel protects hydrogenase from high-potential deactivation and oxygen damage.</a> Nature Chemistry. 6 (9), 822-827 (2014).</li><li>Kong, N., Peng, Q., Li, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rationally+Designed+Dynamic+Protein+Hydrogels+with+Reversibly+Tunable+Mechanical+Properties.">Rationally Designed Dynamic Protein Hydrogels with Reversibly Tunable Mechanical Properties.</a> Advanced Functional Materials. 24 (46), 7310-7317 (2014).</li><li>Khoury, L. R., Nowitzke, J., Shmilovich, K., Popa, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+Biomechanical+Properties+of+Protein-Based+Hydrogels+Using+Force-Clamp+Rheometry.">Study of Biomechanical Properties of Protein-Based Hydrogels Using Force-Clamp Rheometry.</a> Macromolecules. 51 (4), 1441-1452 (2018).</li><li>Auton, M., Rosgen, J., Sinev, M., Holthauzen, L. M. F., Bolen, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osmolyte+effects+on+protein+stability+and+solubility:+A+balancing+act+between+backbone+and+side-chains.">Osmolyte effects on protein stability and solubility: A balancing act between backbone and side-chains.</a> Biophysical Chemistry. 159 (1), 90-99 (2011).</li><li>Popa, I., Kosuri, P., Alegre-Cebollada, J., Garcia-Manyes, S., Fernandez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+dependency+of+biochemical+reactions+measured+by+single-molecule+force-clamp+spectroscopy.">Force dependency of biochemical reactions measured by single-molecule force-clamp spectroscopy.</a> Nature Protocols. 8 (7), 1261-1276 (2013).</li><li>Aioanei, D., Brucale, M., Tessari, I., Bubacco, L., Samori, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Worm-Like+Ising+Model+for+Protein+Mechanical+Unfolding+under+the+Effect+of+Osmolytes.">Worm-Like Ising Model for Protein Mechanical Unfolding under the Effect of Osmolytes.</a> Biophysical Journal. 102 (2), 342-350 (2012).</li><li>Wheeldon, I. R., Gallaway, J. W., Barton, S. C., Banta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioelectrocatalytic+hydrogels+from+electron-conducting+metallopolypeptides+coassembled+with+bifunctional+enzymatic+building+blocks.">Bioelectrocatalytic hydrogels from electron-conducting metallopolypeptides coassembled with bifunctional enzymatic building blocks.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (40), 15275-15280 (2008).</li><li>Sathaye, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rheology+of+peptide-+and+protein-based+physical+hydrogels:+are+everyday+measurements+just+scratching+the+surface?.">Rheology of peptide- and protein-based physical hydrogels: are everyday measurements just scratching the surface?.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 7 (1), 34-68 (2015).</li><li>Ma, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Biocompatible+and+Biodegradable+Protein+Hydrogel+with+Green+and+Red+Autofluorescence:+Preparation,+Characterization+and+In+Vivo+Biodegradation+Tracking+and+Modeling.">A Biocompatible and Biodegradable Protein Hydrogel with Green and Red Autofluorescence: Preparation, Characterization and In Vivo Biodegradation Tracking and Modeling.</a> Scientific Reports. 6, 19370 (2016).</li><li>Fancy, D. A., Kodadek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+for+the+analysis+of+protein-protein+interactions:+rapid+and+efficient+cross-linking+triggered+by+long+wavelength+light.">Chemistry for the analysis of protein-protein interactions: rapid and efficient cross-linking triggered by long wavelength light.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (11), 6020-6024 (1999).</li><li>Saqlain, F., Popa, I., Fernandez, J. M., Alegre-Cebollada, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Strategy+for+Utilizing+Voice+Coil+Servoactuators+in+Tensile+Tests+of+Low+Volume+Protein+Hydrogels.">A Novel Strategy for Utilizing Voice Coil Servoactuators in Tensile Tests of Low Volume Protein Hydrogels.</a> Macromolecular Materials and Engineering. 300 (3), 369-376 (2015).</li><li>Sun, F., Zhang, W. B., Mahdavi, A., Arnold, F. H., Tirrell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+bioactive+protein+hydrogels+by+genetically+encoded+SpyTag-SpyCatcher+chemistry.">Synthesis of bioactive protein hydrogels by genetically encoded SpyTag-SpyCatcher chemistry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (31), 11269-11274 (2014).</li><li>Thompson, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembling+hydrogels+crosslinked+solely+by+receptor-ligand+interactions:+tunability,+rationalization+of+physical+properties,+and+3D+cell+culture.">Self-assembling hydrogels crosslinked solely by receptor-ligand interactions: tunability, rationalization of physical properties, and 3D cell culture.</a> Chemistry. 21 (8), 3178-3182 (2015).</li><li>Kocen, R., Gasik, M., Gantar, A., Novak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscoelastic+behaviour+of+hydrogel-based+composites+for+tissue+engineering+under+mechanical+load.">Viscoelastic behaviour of hydrogel-based composites for tissue engineering under mechanical load.</a> Biomedical Materials. 12 (2), (2017).</li><li>Desai, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastin-Based+Rubber-Like+Hydrogels.">Elastin-Based Rubber-Like Hydrogels.</a> Biomacromolecules. 17 (7), 2409-2416 (2016).</li><li>Fusi, L., Brunello, E., Yan, Z., Irving, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thick+filament+mechano-sensing+is+a+calcium-independent+regulatory+mechanism+in+skeletal+muscle.">Thick filament mechano-sensing is a calcium-independent regulatory mechanism in skeletal muscle.</a> Nature Communications. 7, (2016).</li><li>McDonald, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++dependence+of+loaded+shortening+in+rat+skinned+cardiac+myocytes+and+skeletal+muscle+fibres.">Ca2+ dependence of loaded shortening in rat skinned cardiac myocytes and skeletal muscle fibres.</a> Journal of Physiology-London. 525 (1), 169-181 (2000).</li><li>Wu, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rationally+designed+synthetic+protein+hydrogels+with+predictable+mechanical+properties.">Rationally designed synthetic protein hydrogels with predictable mechanical properties.</a> Nature Communications. 9, (2018).</li><li>Bharadwaj, N. A., Ewoldt, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-point+parallel+disk+correction+for+asymptotically+nonlinear+oscillatory+shear.">Single-point parallel disk correction for asymptotically nonlinear oscillatory shear.</a> Rheologica Acta. 54 (3), 223-233 (2015).</li><li>Valle-Orero, J., Rivas-Pardo, J. A., Popa, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidomain+proteins+under+force.">Multidomain proteins under force.</a> Nanotechnology. 28 (17), 174003 (2017).</li><li>Valle-Orero, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+Deformation+Accelerates+Protein+Ageing.">Mechanical Deformation Accelerates Protein Ageing.</a> Angewandte Chemie International Edition. 56 (33), 9741-9746 (2017).</li><li>Fang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forced+protein+unfolding+leads+to+highly+elastic+and+tough+protein+hydrogels.">Forced protein unfolding leads to highly elastic and tough protein hydrogels.</a> Nature Communications. 4, (2013).</li><li>Gungor-Ozkerim, P. S., Inci, I., Zhang, Y. S., Khademhosseini, A., Dokmeci, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinks+for+3D+bioprinting:+an+overview.">Bioinks for 3D bioprinting: an overview.</a> Biomaterial Science. , (2018).</li></ol>

Hierin beschrijven we een kracht-clamp reometrie techniek om te onderzoeken van de biomechanische reactie van laag-volume op basis van eiwitten hydrogels. Bovendien, is een protocol bedoeld voor het synthetiseren van een uniforme cilindrische laag-volume hydrogel eiwitSteekproef. Een protocol wordt ook gepresenteerd waarin wordt beschreven hoe u verschillende soorten eiwit gebaseerde hydrogels met de elasticiteit van de diverse binden zonder mechanische vervorming en de eventuele schade aan op basis van eiwitten hydrogel...

Afgezien van een unieke fysieke eigenschappen, houdt op basis van eiwitten hydrogels de belofte van een revolutie in kracht spectroscopie doordat de meting van verschillende miljard moleculen in een 'trekken', waardoor de studie van eiwitten in drukke omgevingen, vergelijkbaar zijn met die gevonden in de huid en andere weefsels. Eiwit domeinen blijven gevouwen binnen hydrogels, waardoor de studie van hun biomechanische reactie te dwingen, bindende partners, en chemische voorwaarden. Bovendien lijkt de biomechanische reactie van eiwit domeinen binnen hydrogels op het antwoord gezien met single-molecuul kracht spectroscopie technieken. Bijvoorbeeld chemische denatureringsmiddelen en oxiderende agenten het verkleinen van de stabiliteit van de gevouwen staat, zowel op de interne eiwit domein niveau1,2,3 de macroscopische niveau4,5 , 6 , 7. ook osmolytes verhogen de stabiliteit van enkele eiwitten8,9, wat leidt tot een afname van de visco-reactie van de hydrogels, voor hetzelfde force voorwaarden7,10.
Verschillende benaderingen zijn gelegd om te synthetiseren op basis van eiwitten hydrogels, hetzij door met behulp van de fysieke interacties11,12 of covalente cross-linking4,13. Covalente Reacties toestaan voor vaste cross-linking locaties en deze hydrogels kan het herstellen van de oorspronkelijke toestand na een verwijdering van de mechanische of chemische verstoringen. Een succesvolle aanpak voor covalente dwarsbinding, is afhankelijk van de vorming van covalente koolstof-koolstof bindingen tussen blootgestelde tyrosine aminozuren met ammonium persulfate (APS) als de oxidator en een ruthenium (II)-zout als een initiatiefnemer (Figuur 1)14. Bij blootstelling aan wit licht, kan een oplossing van geconcentreerde eiwitten worden omgezet in een hydrogel. Door het beheersen van wanneer de reactie begint, de eiwit-APS-mix kunnen worden geïnjecteerd in elke vorm van gieten, waardoor zoals polytetrafluorethyleen (PFTE) buizen (figuur 1B en 1 C), het gebruik van een uiterst kleine oplossing volume15. Bovendien, het gebruik van wit licht om te activeren van de cross-linking reactie resulteert in een beperkte bleken van fluorescente proteïnen en staat de formulering van samengestelde hydrogels met een fluorescente markeringen (Figuur 1). Andere methoden van de vorming op basis van eiwitten hydrogel gebruiken dwarsbinding op basis van de SpyTag-SpyCatcher covalente interactie16, amine cross-linking via Glutaaraldehyde13of17interacties biotine-daar.
Dynamische mechanische analyse (DMA) is momenteel een techniek die op grote schaal gebruikt om te studeren polymeer gebaseerde hydrogels13,18. Terwijl DMA biomaterialen constante kracht protocollen toepassen kunt, vereist het Youngs moduli over 10 kPa en grote steekproef volumes van meer dan 200 µL19. Vanwege deze beperkingen zijn eiwit hydrogels over het algemeen te zacht om door deze techniek worden onderzocht. Zoals gemanipuleerde polyproteins moeilijker zijn te synthetiseren dan polymeren, aangezien zij een levend systeem vereisen te produceren, zijn dergelijke hoge volumes inefficiënt, bij de beste4,15. Bovendien zijn de meeste biologische weefsels zachter dan 10 kPa. Verschillende benaderingen zijn ontwikkeld voor biologische monsters, vooral in de studie van20,21van de elasticiteit van de spieren. Deze technieken kunnen ook opereren onder feedback aan constante kracht maar zijn geoptimaliseerd voor monsters met kleine diameters (in de range van micron) blootgesteld om af te dwingen voor zeer korte tijd (meestal minder dan 1 s).
Op basis van eiwitten hydrogels werden met succes bestudeerd met gemodificeerde reometrie technieken. Bijvoorbeeld, maakt de hydrogel gieten in een ring vorm het gebruik van extensionele reometrie voor het meten van de verandering in de ervaren kracht als een functie van uitbreiding4,22. Andere benaderingen voor het bestuderen van de reologische eigenschappen van eiwitten gebaseerde hydrogels gecontroleerde schuifspanning reometrie gebruiken Deze technieken kunnen ook laag monstervolume bereiken en tolereren van zachte materialen. Echter, deze methoden ontbreken de mogelijkheid om na te bootsen de trekken krachten die oorzaak eiwit ontvouwen in vivoen Youngs modulus wordt berekend op basis van complexe theorieën waarvoor verschillende veronderstellingen en correcties23.
We hebben onlangs gemeld dat een nieuwe aanpak die gebruikmaakt van een kleine hoeveelheid eiwitten, polymeervorm binnen de buizen met een diameter < 1 mm. Onze eerste implementatie van deze techniek was in de lengte-clamp modus, waarin de gel werd uitgebreid naar aanleiding van de gewenste protocol15actief. Bij deze methode wordt ervaring de eiwitten een voortdurende veranderingen in zowel de uitbreiding als de kracht terwijl de domeinen ontvouwen, waardoor de data interpretatie omslachtig. Onlangs hebben we een nieuwe kracht-clamp reometrie techniek, waar een feedback-lus laag-volume eiwit hydrogels naar een vooraf gedefinieerde geldende protocol7 (Figuur 2 blootstellen kan) gemeld. Een analoog PID systeem vergelijkt de kracht gemeten door de kracht sensor met de punt van de reeks verzonden vanaf de computer en past de gel-extensie door het bewegen van de spreekspoel om te minimaliseren van het verschil tussen de twee ingangen. Deze 'klemmen' van de kracht staat nu voor nieuwe soorten experimenten voor het meten van de biomechanica van eiwit hydrogels.
In de modus kracht-oprit ervaringen een getuide eiwit hydrogel een constante stijging en daling van kracht met de tijd. De PID compenseert voor eventuele visco vervorming door de extensie te wijzigen in een niet-lineaire manier, afhankelijk van het soort eiwit en hydrogel formulering. Het belangrijkste voordeel van kracht helling is dat het mogelijk maakt de kwantificering van standaardparameters, zoals Youngs modulus en energie dissipatie, als gevolg van een ontvouwen en uiteinde van eiwit domeinen.
In constante-force-modus, de toegepaste kracht verandert in een stap-achtige manier. In deze modus, de gel uitbreidt en contracten elastisch wanneer de kracht is verhoogd of verlaagd, respectievelijk, gevolgd door een tijd-afhankelijke vervorming. Deze visco vervorming, plaatsvindt terwijl de gel een constante kracht ervaringen, is direct gerelateerd aan het domein ontvouwen/uiteinde. Op een vereenvoudigde manier, kan deze uitbreiding worden gezien als het equivalent van verschillende miljard enkel molecuul sporen samen gemiddeld en allemaal tegelijk gemeten. Constante-force protocollen kunnen worden gebruikt om de kruip en ontspanning van eiwit hydrogels als een functie van kracht en tijd te studeren. Als een functie van kracht, voor BSA gebaseerde eiwit hydrogels, hebben we onlangs aangetoond dat er een lineaire afhankelijkheid tussen de elastiek en visco uitbreiding en de terugslag met de toegepaste spanning7.
Hier detail wij de werking van een kracht-clamp-rheometer met behulp van samengestelde gels gemaakt van een mengsel van eiwit L (8 domeinen24, afgebeeld als L8) en een eiwit L-eGFP construct (L-eGFP), waardoor de algehele hydrogel TL en gebruiksvriendelijke aantonen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>SI-KG4A force transducer</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>SI-KG4A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linear Voice Coil Motor</td>
			<td>Equipement Solutions</td>
			<td>LFA2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Rocky Mountain Biologicals (RMBIO)</td>
			<td>BSA-AAF-1XG / 100 G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>248614-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(bipyridine)ruthenium(II) chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>544981-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EXPRESS MEDICAL SUPPLIES&#160;6-0 NYLON SUTURE 12/PK</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0395626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1mL Syringe Only, Luer-Lok Tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silane, Sigmacote</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SL2-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbore PTFE Tubing, 0.022&#34;ID x 0.042&#34;OD, 100 ft/roll</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-06417-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic Needle, 23 Gauge</td>
			<td>Healthcare Supply Pros</td>
			<td>305194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jensen Global JG24-1.5X Red IT Dispensing Tips - 24 gauge</td>
			<td>KIMCO</td>
			<td>JG24-1.5X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USH-103D USHIO 100W Short Arc Mercury Lamp</td>
			<td>ALB</td>
			<td>USH-103D USHIO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The computer code and CAD design of the custom parts can be made available on request to the corresponding author.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

force-clamp rheometry for characterizing protein-based hydrogels

Hier beschrijven we een kracht-clamp reometrie methode karakteriseren de biomechanische eigenschappen van hydrogels op basis van eiwitten. Deze methode maakt gebruik van een analoge evenredige-integraal-afgeleide (PID) systeem toe te passen gecontroleerde-force protocollen op cilindrische op basis van eiwitten hydrogel monsters, die tussen een lineaire spreekspoel-motor en een transducer kracht worden aangebonden. Tijdens het uitvoeren van past de PID-systeem de extensie van het monster hydrogel te volgen van een vooraf gedefinieerde kracht-protocol door het minimaliseren van het verschil tussen de gemeten en instelpunt krachten. Deze unieke benadering op basis van eiwitten hydrogels kunt het binden van extreem laag-volume hydrogel monsters (< 5 µL) met verschillende eiwit concentratie. Onder force-oprit protocollen, waar de toegepaste stress verhoogt en verlaagt lineair met de tijd, het systeem maakt de studie van de elasticiteit en hysteresis gedragingen die zijn gekoppeld aan de (un) vouwing van eiwitten en het meten van standaard elastische en Visco parameters. Onder constante-force, waar de kracht pulse een stap-achtige vorm, de elastische reactie, behoren tot de verandering in werking is getreden heeft, is ontkoppeld van de visco-reactie, die afkomstig is van eiwit domein ontvouwen en uiteinde. Vanwege de geringe hoeveelheden monster en veelzijdigheid bij de toepassing van verschillende mechanische verstoringen, is kracht-clamp reometrie geoptimaliseerd voor het onderzoeken van de mechanische reactie van eiwitten onder kracht met behulp van een bulk-aanpak.

Figuur 1A blijkt de regeling van de photoactive reactie die gebruikt voor het synthetiseren van de L-EGP/L8 hydrogel. Figuur 1B toont de hydrogel mengsel in de PTFE-buis vóór en na de photoactivation. Figuur 1 c presenteert de geëxtrudeerde L-eGFP-L8 hydrogel binnen een oplossing van Tris. De hydrogel monster heeft geen structurele gebreken zoals inkepingen. Hydrogels met dui...

Watch this Scientific Journal Video about Force-Clamp Rheometry for Characterizing Protein-based Hydrogels at JoVE.com

Force-Clamp Rheometry for Characterizing Protein-based Hydrogels

Kracht-Clamp reometrie voor het karakteriseren van de Hydrogels op basis van eiwitten

Een nieuwe kracht-clamp reometrie techniek wordt gebruikt voor het onderzoeken van de mechanische eigenschappen van laag-volume op basis van eiwitten hydrogel monsters aangebonden tussen een spreekspoel motor en een kracht sensor. Een analoge evenredige-integraal-afgeleide (PID) systeem zorgt voor het 'klemmen' van de kracht ervaren om het gewenste protocol.

Here, we describe a force-clamp rheometry method to characterize the biomechanical properties of protein-based hydrogels. This method uses an analog ...

The main advantages of this technique are that it utilizes a PID, which is a proportional integral derivative system to apply controlled force protocols to protein hydrogel samples, and it utilizes small sample volume. The protocols for the forces clamp allow for straight-forward interpretation of the data while low volumes are critical when working with hard to produce proteins that are available only in small amounts. The implications of this technique extend toward developing and characterizing new biometric materials with durable elasticity, using down-folding, refolding transition characteristic for proteins.This method can answer questions in tissue and biomaterial mechanics through enabling the measurements of billions of protein molecules in one pull and simulating crowded environments specific to biological tissues. Begin this procedure with reagent solutions preparation as described in the text protocol. To synthesize the protein-based hydrogel, first fix a 23-gauge needle on a one milliliter syringe with a pressed plunger.Then, cut a 10 centimeter polytetrafluoroethylene, or PTFE, tube using a razor blade. Attach the needle and syringe to one end of the PTFE tube. Insert the second end of the tube into a silane solution and fill the tube by retracting the syringe plunger.Leave the tube for approximately 30 minutes. Then, remove the silane solution and dry the tube with compressed air. Now, mix the protein solution with APS and Tris(bipyridine)ruthenium(II)chloride in a 1.5 milliliter tube using a constant volume ratio.Vortex the photoactive solution until it is mixed completely. Then, centrifuge the mix at maximum speed to remove any bubbles from the solution. Bubbles can form while loading the hydrogel photoactive mix into the Teflon tube, leading to sample damage.To prevent bubble formation, keep the Teflon tube end in the solution mix during the loading process and retract the syringe plunger slowly. Insert the open end of the treated PTFE tube into the photoactive mixture and draw the solution into the tube by retracting the syringe plunger. Now, place the loaded tube approximately 10 centimeters away from a 100 watt mercury lamp to prevent heating it and keep it there for up to 30 minutes at room temperature.Remove the tube from the needle and cut the edges of the tube near the hydrogel ends with a razor blade. Then, use a blunted 24-gauge needle to extrude the hydrogel into the Tris solution. Visually inspect the gels for any defects that might form during the extrusion or due to bubbles and discard any defective gels.Start the instrument control program and turn on the voice coil motor. Then, set the coil position to a value toward the end of the range. Displace the hooks in the Z direction and align them at the bend in the X direction.Then, record the values of the micrometer screws for the X direction. Now, tie a loose double-overhand knot at the end of the suture strand, such that the diameter of the loop is about four millimeters. Then, cut the loop off the strand.Repeat to form a second loop. Then, place the two loops on the hook connected to the force sensor. Fill the experimental chamber with Tris buffer and transfer the hydrogel sample into the filled chamber using medical tweezers.Place the voice coil and force sensor hooks close to the solution surface and align the hooks in all directions with the XYZ positioning manipulators. Using medical tweezers, hang both sides of the protein hydrogel sample on the hooks connected to the voice coil and force sensor. A typical error is an over-tightening of the suture loops around the hydrogel samples during the attachment process.This may lead to a notch formation and cutting of the hydrogel sample. Carefully tighten one suture loop around the hydrogel sample on the voice coil hook by holding both ends of the suture loop with medical tweezers and pulling them simultaneously. Repeat this step for the loop connected to the force sensor.Tighten the suture loops on the bends of each hook to prevent any slippage. Use these bends as reference points to find the zero separation between the hooks. Cut the excess lengths of the sutures using medical scissors.Move the attached hydrogel using Z manipulators along the Z axis towards the experimental chamber to immerse the hydrogel in the experimental solution. Align the hydrogel sample in YZ using the manipulators such that the gel is not under any stress. Zero the force sensor and separate the two hooks using the X micrometer stages until the gel starts to experience force.Once this happens, slightly turn back the micrometer screw in the X direction. Record the position of both manipulators for the voice coil motor and the sensor. Then, use the difference between these values and the ones previously measured to calculate the exact separation between the tethering hooks at the start of the experiment.To perform a force-ramp cycle by increasing the force at the desired loading rate, input the starting and final force values, as well as the duration of the protocol, which appears as a flipped V, followed by a constant low force for about 200 seconds to allow the protein domains to refold before the next cycle. Perform a constant-force protocol by applying a low force for 30 seconds. Then, increase the force to a constant force for a defined amount of time, followed by quenching the force back to the same low value for greater than 300 seconds to allow the protein domains to refold and the gel elasticity to recover.Finally, perform data analysis as described in the text protocol. Each measurement starts with a slack curve. By fitting two lines, the zero force on the sensor and the true gel length is determined.The true gel length is calculated from the intersection of the fits and the position of the micrometer screws. The force-clamp rheometry system can apply two different types of protocols. In the force ramp mode, the hydrogel sample experiences a force changing protocol with time that resembles an inverted V.In constant force mode, the applied stress changes in a step-like pattern.During measurements, the PID system adjusts the hydrogel extension by changing the coil position to follow the pre-defined set point from the force protocol. The strain is then calculated by dividing the measured extension to the true gel length. The stress is determined by dividing the applied force to the cross-sectional area of the hydrogel sample.Force Ramp traces are best represented as stress versus strain. The Young's modulus can be calculated from the slope measure during the loading phase. The hysteresis gives the energy dissipation coming from unfolding and refolding the protein.Constant force traces are best represented as a function of time. The change in strain can be used to measure the unfolding and refolding rates by fitting a double exponential. While attempting this procedure, it's important to remember to dry any silane from the tube before adding the protein, to centrifuge the protein mix to remove bubbles, to check the bubbles after injecting the protein mix inside the tube and to discard any mechanically damaged hydrogels after extrusion from the tube.Generally, individuals new to this method will struggle at first with attaching the gels to the hooks using the surgical sutures without causing damage to the hydrogel sample. Extruding the gel from the tube can damage the hydrogel as well. This method enables the applications of constant force protocols on low volume hydrogel samples.These experiments allow the decoupling of the elastic and the viscoelastic behaviors and the study of protein unfolding and folding mechanics in a bulk approach. After its development, this technique allows researchers in the field of material sciences to explore new soft biomaterials such as engineered polyproteins-based hydrogels that have an excellent potential for serving as tissue engineering scaffolds, drug delivery systems and biological ink for 3-D printing. Not only does this method provide insight into the mechanics of protein-based hydrogels, it can also be applied to other systems such as measuring the isometric response of muscle fibers or the elasticity of tissues such as skin.

Research

JoVE Journal

Engineering

Bringing the Visible Universe into Focus with Robo-AO

Brengen het zichtbare heelal in Focus met Robo-AO

The angular  resolution of ground-based optical telescopes is limited by the degrading  effects of the turbulent atmosphere. In the absence of an ...

Concurrent Quantitative Conductivity and Mechanical Properties Measurements of Organic Photovoltaic Materials using AFM

Concurrent Kwantitatieve geleidbaarheid en mechanische eigenschappen metingen van organische fotovoltaïsche Materialen met AFM

Organic photovoltaic  (OPV) materials are inherently inhomogeneous at the nanometer scale. Nanoscale  inhomogeneity of OPV materials affects performance ...

Fabrication of Nano-engineered Transparent Conducting Oxides by Pulsed Laser Deposition

Fabricage van Nano-engineered transparante geleidende oxides door gepulste laser depositie

Nanosecond Pulsed  Laser Deposition (PLD) in the presence of a background gas allows the deposition  of metal oxides with tunable morphology, structure, ...

Spatial Separation of Molecular Conformers and Clusters

Ruimtelijke scheiding van moleculaire conformers en clusters

Gas-phase molecular physics and physical chemistry experiments commonly use supersonic expansions through pulsed valves for the production of cold ...

The Preparation of Electrohydrodynamic Bridges from Polar Dielectric Liquids

De voorbereiding van elektrohydrodynamische Bruggen van Polar diëlektrische vloeistoffen

Horizontal and vertical liquid bridges are simple and powerful tools for exploring the interaction of high intensity electric fields (8-20 kV/cm) and ...

Selective Area Modification of Silicon Surface Wettability by Pulsed UV Laser Irradiation in Liquid Environment

Selectieve Area Wijziging van Silicon Surface Bevochtigbaarheid door Pulsed UV Laser bestraling in Liquid Milieu

The wettability of silicon (Si) is one of the important parameters in the technology of surface functionalization of this material and fabrication of ...

Detection and Recovery of Palladium, Gold and Cobalt Metals from the Urban Mine Using Novel Sensors/Adsorbents Designated with Nanoscale Wagon-wheel-shaped Pores

Detectie en herstel van Palladium, Goud en Cobalt metalen uit de Urban Mine via innovatieve sensoren / Adsorbentia Aangewezen met nanoschaal Wagon-wheel-vormige poriën

Developing low-cost, efficient processes for recovering and recycling palladium, gold and cobalt metals from urban mine remains a significant challenge in ...

Writing Bragg Gratings in Multicore Fibers

Het schrijven van Bragg Roosters in Multicore Fibers

Fiber Bragg gratings in multicore fibers can be used as compact and robust filters in astronomical and other research and commercial applications. Strong ...

Characterizing Far-infrared Laser Emissions and the Measurement of Their Frequencies

Karakteriseren van Ver-infrarood laser emissies en het meten van hun frequenties

The generation and subsequent measurement of far-infrared radiation has found numerous applications in high-resolution spectroscopy, radio astronomy, and ...

Experimental Methods for Investigation of Shape Memory Based Elastocaloric Cooling Processes and Model Validation

Experimentele methoden voor Onderzoek van Shape geheugen gebaseerd Elastocaloric Cooling Processen en Model Validation

Shape Memory Alloys (SMA) using elastocaloric cooling processes have the potential to be an environmentally friendly alternative to the conventional vapor ...