Name: force-clamp rheometry for characterizing protein-based hydrogels
Uploaded: 2018-08-21T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Force-Clamp Rheometry for Characterizing Protein-based Hydrogels at JoVE.com

אנו להכיר תמיכה כספית מן המחקר צמיחה יוזמה (פרס מס 101 X 340), הקרן הלאומית למדע, מחקר מכשור חוגי (מענק מס ' PHY-1626450), מילווקי גדול קרן (זוכה פרס שאו) ומערכת של אוניברסיטת ויסקונסין (מחקר יישומי גרנט).

1. נוגדנים פתרון הכנה
<ol><li>הכן פתרון חלבון המוצא על ידי המסת/דילול של החלבון עניין לריכוז הרצוי, שימוש ב בופר טריס [20 מ מ טריס (hydroxymethyl) aminomethane ו- 150 מ מ NaCl, pH 7.4]. הערה: ריכוז החלבון הקטן ביותר עבור כשבסופו cross-linking hydrogels תלוי החלבון משמש, בדרך כלל > 1 מ מ.</li>
	<li>להכין מלאי של קירור (APS) (1 מ') tris(bipyridine)rut...

<ol>
	<li>Cao, Y., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+chemical+denaturants+affect+the+mechanical+folding+and+unfolding+of+proteins?.">How do chemical denaturants affect the mechanical folding and unfolding of proteins?.</a> Journal of Molecular Biology. 375 (1), 316-324 (2008).</li><li>Carrion-Vazquez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+and+chemical+unfolding+of+a+single+protein:+a+comparison.">Mechanical and chemical unfolding of a single protein: a comparison.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 3694-3699 (1999).</li><li>Wiita, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+chemistry+of+thioredoxin+catalysis+with+force.">Probing the chemistry of thioredoxin catalysis with force.</a> Nature. 450 (7166), 124-127 (2007).</li><li>Lv, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designed+biomaterials+to+mimic+the+mechanical+properties+of+muscles.">Designed biomaterials to mimic the mechanical properties of muscles.</a> Nature. 465 (7294), 69-73 (2010).</li><li>Plumere, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+redox+hydrogel+protects+hydrogenase+from+high-potential+deactivation+and+oxygen+damage.">A redox hydrogel protects hydrogenase from high-potential deactivation and oxygen damage.</a> Nature Chemistry. 6 (9), 822-827 (2014).</li><li>Kong, N., Peng, Q., Li, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rationally+Designed+Dynamic+Protein+Hydrogels+with+Reversibly+Tunable+Mechanical+Properties.">Rationally Designed Dynamic Protein Hydrogels with Reversibly Tunable Mechanical Properties.</a> Advanced Functional Materials. 24 (46), 7310-7317 (2014).</li><li>Khoury, L. R., Nowitzke, J., Shmilovich, K., Popa, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+Biomechanical+Properties+of+Protein-Based+Hydrogels+Using+Force-Clamp+Rheometry.">Study of Biomechanical Properties of Protein-Based Hydrogels Using Force-Clamp Rheometry.</a> Macromolecules. 51 (4), 1441-1452 (2018).</li><li>Auton, M., Rosgen, J., Sinev, M., Holthauzen, L. M. F., Bolen, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osmolyte+effects+on+protein+stability+and+solubility:+A+balancing+act+between+backbone+and+side-chains.">Osmolyte effects on protein stability and solubility: A balancing act between backbone and side-chains.</a> Biophysical Chemistry. 159 (1), 90-99 (2011).</li><li>Popa, I., Kosuri, P., Alegre-Cebollada, J., Garcia-Manyes, S., Fernandez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+dependency+of+biochemical+reactions+measured+by+single-molecule+force-clamp+spectroscopy.">Force dependency of biochemical reactions measured by single-molecule force-clamp spectroscopy.</a> Nature Protocols. 8 (7), 1261-1276 (2013).</li><li>Aioanei, D., Brucale, M., Tessari, I., Bubacco, L., Samori, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Worm-Like+Ising+Model+for+Protein+Mechanical+Unfolding+under+the+Effect+of+Osmolytes.">Worm-Like Ising Model for Protein Mechanical Unfolding under the Effect of Osmolytes.</a> Biophysical Journal. 102 (2), 342-350 (2012).</li><li>Wheeldon, I. R., Gallaway, J. W., Barton, S. C., Banta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioelectrocatalytic+hydrogels+from+electron-conducting+metallopolypeptides+coassembled+with+bifunctional+enzymatic+building+blocks.">Bioelectrocatalytic hydrogels from electron-conducting metallopolypeptides coassembled with bifunctional enzymatic building blocks.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (40), 15275-15280 (2008).</li><li>Sathaye, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rheology+of+peptide-+and+protein-based+physical+hydrogels:+are+everyday+measurements+just+scratching+the+surface?.">Rheology of peptide- and protein-based physical hydrogels: are everyday measurements just scratching the surface?.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 7 (1), 34-68 (2015).</li><li>Ma, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Biocompatible+and+Biodegradable+Protein+Hydrogel+with+Green+and+Red+Autofluorescence:+Preparation,+Characterization+and+In+Vivo+Biodegradation+Tracking+and+Modeling.">A Biocompatible and Biodegradable Protein Hydrogel with Green and Red Autofluorescence: Preparation, Characterization and In Vivo Biodegradation Tracking and Modeling.</a> Scientific Reports. 6, 19370 (2016).</li><li>Fancy, D. A., Kodadek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+for+the+analysis+of+protein-protein+interactions:+rapid+and+efficient+cross-linking+triggered+by+long+wavelength+light.">Chemistry for the analysis of protein-protein interactions: rapid and efficient cross-linking triggered by long wavelength light.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (11), 6020-6024 (1999).</li><li>Saqlain, F., Popa, I., Fernandez, J. M., Alegre-Cebollada, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Strategy+for+Utilizing+Voice+Coil+Servoactuators+in+Tensile+Tests+of+Low+Volume+Protein+Hydrogels.">A Novel Strategy for Utilizing Voice Coil Servoactuators in Tensile Tests of Low Volume Protein Hydrogels.</a> Macromolecular Materials and Engineering. 300 (3), 369-376 (2015).</li><li>Sun, F., Zhang, W. B., Mahdavi, A., Arnold, F. H., Tirrell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+bioactive+protein+hydrogels+by+genetically+encoded+SpyTag-SpyCatcher+chemistry.">Synthesis of bioactive protein hydrogels by genetically encoded SpyTag-SpyCatcher chemistry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (31), 11269-11274 (2014).</li><li>Thompson, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembling+hydrogels+crosslinked+solely+by+receptor-ligand+interactions:+tunability,+rationalization+of+physical+properties,+and+3D+cell+culture.">Self-assembling hydrogels crosslinked solely by receptor-ligand interactions: tunability, rationalization of physical properties, and 3D cell culture.</a> Chemistry. 21 (8), 3178-3182 (2015).</li><li>Kocen, R., Gasik, M., Gantar, A., Novak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscoelastic+behaviour+of+hydrogel-based+composites+for+tissue+engineering+under+mechanical+load.">Viscoelastic behaviour of hydrogel-based composites for tissue engineering under mechanical load.</a> Biomedical Materials. 12 (2), (2017).</li><li>Desai, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastin-Based+Rubber-Like+Hydrogels.">Elastin-Based Rubber-Like Hydrogels.</a> Biomacromolecules. 17 (7), 2409-2416 (2016).</li><li>Fusi, L., Brunello, E., Yan, Z., Irving, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thick+filament+mechano-sensing+is+a+calcium-independent+regulatory+mechanism+in+skeletal+muscle.">Thick filament mechano-sensing is a calcium-independent regulatory mechanism in skeletal muscle.</a> Nature Communications. 7, (2016).</li><li>McDonald, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++dependence+of+loaded+shortening+in+rat+skinned+cardiac+myocytes+and+skeletal+muscle+fibres.">Ca2+ dependence of loaded shortening in rat skinned cardiac myocytes and skeletal muscle fibres.</a> Journal of Physiology-London. 525 (1), 169-181 (2000).</li><li>Wu, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rationally+designed+synthetic+protein+hydrogels+with+predictable+mechanical+properties.">Rationally designed synthetic protein hydrogels with predictable mechanical properties.</a> Nature Communications. 9, (2018).</li><li>Bharadwaj, N. A., Ewoldt, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-point+parallel+disk+correction+for+asymptotically+nonlinear+oscillatory+shear.">Single-point parallel disk correction for asymptotically nonlinear oscillatory shear.</a> Rheologica Acta. 54 (3), 223-233 (2015).</li><li>Valle-Orero, J., Rivas-Pardo, J. A., Popa, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidomain+proteins+under+force.">Multidomain proteins under force.</a> Nanotechnology. 28 (17), 174003 (2017).</li><li>Valle-Orero, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+Deformation+Accelerates+Protein+Ageing.">Mechanical Deformation Accelerates Protein Ageing.</a> Angewandte Chemie International Edition. 56 (33), 9741-9746 (2017).</li><li>Fang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forced+protein+unfolding+leads+to+highly+elastic+and+tough+protein+hydrogels.">Forced protein unfolding leads to highly elastic and tough protein hydrogels.</a> Nature Communications. 4, (2013).</li><li>Gungor-Ozkerim, P. S., Inci, I., Zhang, Y. S., Khademhosseini, A., Dokmeci, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinks+for+3D+bioprinting:+an+overview.">Bioinks for 3D bioprinting: an overview.</a> Biomaterial Science. , (2018).</li></ol>

במסמך זה, אנו מתארים שיטה rheometry כוח-קלאמפ לחקור את התגובה ביו-מכני של hydrogels חלבון מבוססת בנפח נמוך. בנוסף, פרוטוקול מסופק לסנתז מדגם הידרוג חלבון בנפח נמוך גלילי אחיד. פרוטוקול מוצג גם המתאר איך לקשור סוגים שונים של חלבון מבוססת hydrogels עם elasticities שונים מבלי לגרום לכל דפורמציה מכאנית או נזק דגי?...

פרט מאפיינים הפיזיים ייחודיים, חלבון מבוססת hydrogels להחזיק את ההבטחה של לעשות מהפכה ספקטרוסקופיה בכוח על-ידי הפיכת המדידה של מספר מולקולות מיליארד ב אחד 'למשוך', ובכך מאפשר חקר חלבונים בסביבות צפופות, דומה אלה המצויים העור ורקמות אחרות. חלבון תחומים נשארים מקופל בתוך hydrogels, המאפשר חקר את תגובתם biomechanical לכפות, איגוד שותפים והתנאים כימי. בנוסף, התגובה ביו-מכני של חלבון תחומים בתוך hydrogels דומה את התגובה עם טכניקות ספקטרוסקופיה כוח מולקולה בודדת. לדוגמה, denaturants כימי וסוכנים חמצון להקטין את יציבות המדינה מקופל,2,3 ברמה1,תחום חלבון יחיד והן מאקרוסקופית ברמה4,5 , 6 , 7. באופן דומה, osmolytes להגדיל את היציבות של חלבונים יחידה8,9, המוביל לירידה התגובה viscoelastic של hydrogels, עבור אותו לכפות תנאים7,10.
מספר גישות יושמו לסנתז חלבון מבוססת hydrogels, על ידי או באמצעות אינטראקציות גופניות11,12 או קוולנטיות cross-linking4,13. תגובות קוולנטיות לאפשר מיקומים קבועים cross-linking, hydrogels אלה ניתן לשחזר את המצב ההתחלתי על הסרה של לפליטת כימי או מכני. בגישה מוצלח עבור cross-linking קוולנטיות מסתמך על יצירת קישור קוולנטי, קשרי פחמן-פחמן הקשרים בין חומצות האמינו טירוזין חשוף באמצעות קירור (APS) כמו של חמצון ומלח רותניום (II) יוזם (איור 1)14. עם חשיפה לאור לבן, פתרון של חלבונים מרוכזים יכולים להיהפך של הידרוג. על ידי שליטה כאשר הוא מתחיל התגובה, לערבב חלבונים-APS יכול להיות מוזרק בכל צורה הליהוק, כגון טפלון (PFTE) צינורות (איור 1B ו- 1 C), המאפשר שימוש אמצעי אחסון קטן מאוד פתרון15. יתר על כן, השימוש של אור לבן כדי לעורר את התגובה cross-linking תוצאות הלבנת מוגבלת של חלבונים פלורסנט ומאפשר ניסוח של hydrogels ללא הפרדות צבע עם סמנים פלורסנט (איור 1). שיטות אחרות של היווצרות חלבון מבוססת הידרוג להשתמש cross-linking המבוססת על אינטראקציה קוולנטיות SpyTag-SpyCatcher16, אמין cross-linking ויה גלוטראלדהיד13, או אינטראקציות ביוטין-streptavidin17.
ניתוח מכני דינמי (DMA) היא טכניקה המשמשת בהרחבה ללמוד מבוסס פולימר hydrogels13,18. בעוד DMA באפשרותך להחיל כוח קבוע פרוטוקולים biomaterials, זה דורש מודולים של יאנג מעל 10 kPa ואמצעי אחסון מדגם גדולים של יותר מ-200 µL19. בשל מגבלות אלו, חלבון hydrogels הם בדרך כלל יותר מדי רכים להיחקר על ידי שיטה זו. Polyproteins הנדסה קשים יותר לסנתז מאשר פולימרים, מכיוון שהם דורשים מערכת חיה כדי לייצר, שאמצעי אחסון גבוהה אלה הם יעיל,4,הטוב ביותר15. יתר על כן, רוב רקמות ביולוגיות, רכים יותר 10 kPa. מספר גישות פותחו עבור דגימות ביולוגיות, במיוחד במחקר של שריר אלסטיות20,21. טכניקות אלה יכולים לפעול גם תחת משוב להפעיל כוח קבוע אבל הממוטבות דגימות עם צווארונים קטנים אטומים מפליז (בטווח מיקרון) חשופים לכפות לזמנים קצרים מאוד (בדרך כלל פחות מ- 1 s).
Hydrogels חלבון מבוססת נחקרו בהצלחה עם טכניקות rheometry שונה. לדוגמה, השלכת את הידרוג בצורת הטבעת מאפשרת את השימוש rheometry הארכת כדי למדוד את השינוי בחיל מנוסים כפונקציה של סיומת4,22. גישות אחרות ללמוד את מאפייני rheological מבוססי חלבונים hydrogels שימוש מבוקר מאמץ גזירה-rheometry. שיטות אלה ניתן גם להשיג נפח דגימה נמוכים, לסבול חומרים רכים. עם זאת, אלה שיטות חוסר היכולת לחקות את משיכת כוחות כי הסיבה חלבון התגלגלות ויוו, מודול האלסטיות הוא מחושב בהתבסס על תיאוריות מורכבות הדורשות הנחות והתיקונים השונים23.
לאחרונה דיווחנו גישה חדשה אשר מנצל נפח קטן של חלבונים, polymerized בתוך צינורות עם קטרים < 1 מ מ. היישום הראשון שלנו של טכניקה זו היה פועל במצב אורך-קלאמפ, שבו הג'ל הוארך בעקבות הרצוי פרוטוקול ה-15. בשיטה זו, החלבונים לחוות שינוי רציף סיומת והן כוח בזמן התחומים מתגלגלים, שהופך את פרשנות הנתונים מסורבלת. לאחרונה, אנו מדווחים על טכניקה rheometry כוח-קלאמפ חדשה, שבו לולאת משוב יכול לחשוף בנפח נמוך חלבון hydrogels על פרוטוקול כוח מראש7 (איור 2). מערכת PID אנלוגי משווה את כוח נמדד על ידי חיישן כוח עם הנקודה סט הנשלחים מהמחשב ומתאים את הסיומת ג'ל על-ידי הזזת את הגליל קול כדי למזער את ההבדל בין שתי כניסות. זה 'מחבר חובק למעקה' של הכוח מאפשר כעת סוגים חדשים של ניסויים כדי למדוד את ביומכניקה של חלבון hydrogels.
במצב כוח-כבש, חוויות הידרוג חלבון עגינה על עליה מתמדת וירידה בכוח עם הזמן. ה-PID מפצה על כל דפורמציה viscoelastic על ידי שינוי הסיומת באופן ליניארי, בהתאם לסוג של חלבון ו הידרוג ניסוח. היתרון העיקרי של כוח הרמפה הוא שהיא מאפשרת כימות של פרמטרים סטנדרטיים, כגון מודול האלסטיות, פיזור אנרגיה, בשל התגלגלות של refolding של חלבון תחומים.
במצב קבוע-כוח, הכוח שהוחל משתנה אופנה כמו שלב. במצב זה, הג'ל מרחיב חוזים elastically כאשר הכוח או ההגברה, בהתאמה, ואחריו עיוות תלויי-זמן. דפורמציה viscoelastic הזה, המתרחשים בזמן הג'ל חוויות כוח קבוע, קשור ישירות לתחום התגלגלות/refolding. בצורה פשוטה, הרחבה זו ניתן לראות המקבילה של מספר עקבות מולקולה בודדת מיליארד בממוצע יחד ומדדתי את הכל בבת אחת. פרוטוקולים קבוע-כוח ניתן ללמוד על השרץ ורגיעה של חלבון hydrogels כפונקציה של כוח וזמן. כפונקציה של כוח, למען hydrogels חלבון מבוסס-BSA, לאחרונה הראינו שיש תלות לינארית בין סיומת אלסטי, viscoelastic ובצינתם עם זן יישומית7.
כאן אנחנו פירוט המבצע של rheometer כוח-קלאמפ באמצעות ג'ל ללא הפרדות צבע עשוי תערובת של חלבון L (8 תחומים24, ו"כדור L8) וגם מבנה החלבון L-eGFP (L-eGFP), מה שהופך את הידרוג הכוללת פלורסנט וקל להפגין.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>SI-KG4A force transducer</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>SI-KG4A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linear Voice Coil Motor</td>
			<td>Equipement Solutions</td>
			<td>LFA2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Rocky Mountain Biologicals (RMBIO)</td>
			<td>BSA-AAF-1XG / 100 G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>248614-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(bipyridine)ruthenium(II) chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>544981-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EXPRESS MEDICAL SUPPLIES&#160;6-0 NYLON SUTURE 12/PK</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0395626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1mL Syringe Only, Luer-Lok Tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silane, Sigmacote</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SL2-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbore PTFE Tubing, 0.022&#34;ID x 0.042&#34;OD, 100 ft/roll</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-06417-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic Needle, 23 Gauge</td>
			<td>Healthcare Supply Pros</td>
			<td>305194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jensen Global JG24-1.5X Red IT Dispensing Tips - 24 gauge</td>
			<td>KIMCO</td>
			<td>JG24-1.5X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USH-103D USHIO 100W Short Arc Mercury Lamp</td>
			<td>ALB</td>
			<td>USH-103D USHIO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The computer code and CAD design of the custom parts can be made available on request to the corresponding author.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

force-clamp rheometry for characterizing protein-based hydrogels

כאן, אנו מתארים שיטה rheometry כוח-קלאמפ לאפיין את המאפיינים ביו-מכני של חלבון מבוססת hydrogels. שיטה זו משתמשת מערכת אנלוגית (PID) פרופורציונלי-אינטגרל-נגזרת להחלת פרוטוקולים כוח מבוקר על דגימות הידרוג חלבון מבוססת גלילי, אשר הם קשורה בין מנוע ליניארי קול סליל מתמר כוח. במהלך המבצע, מערכת PID מתאימה ההרחבה של המדגם הידרוג לעקוב פרוטוקול כוח שהוגדרו מראש על-ידי הקטנת ההבדל בין הכוחות נמדד קבע-נקודה. גישה ייחודית זו כדי hydrogels חלבון מבוססת מאפשר קשירה של דגימות הידרוג מאוד מצומצמות (< 5 µL) עם חלבונים שונים ריכוזים. תחת פרוטוקולים כוח-כבש, שבו הלחץ יישומית עליות וירידות באופן ליניארי עם הזמן, המערכת מאפשרת המחקר של ההתנהגויות גמישות ורכות היסטרזיס הקשורים עם קיפול (האו ם) של חלבונים והמידה של אלסטי סטנדרטי, viscoelastic פרמטרים. תחת קבוע-כוח, שם דופק כוח יש צורה כמו שלב, התגובה אלסטי, בשל לשינוי בכוח, הוא decoupled של התגובה viscoelastic, אשר מגיע מהתחום חלבון התגלגלות, refolding. בשל בנפח נמוך מדגם שלה צדדיות בהחלת לפליטת מכניים שונים, rheometry כוח-קלאמפ ממוטבת כדי לחקור את התגובה מכני של חלבונים תחת כוח תוך שימוש בגישה גורפת.

איור 1A מציג את ערכת התגובה photoactive בשימוש לסנתז את הידרוג8 L-EGP/L. איור 1B מציג את התערובת הידרוג בצינור PTFE לפני ואחרי photoactivation. איור 1C מציג את הידרוג-8 של L-eGFP-L מעוקם בתוך פתרון טריס. המדגם הידרוג יש מסויד כגון חריצים. ?...

Watch this Scientific Journal Video about Force-Clamp Rheometry for Characterizing Protein-based Hydrogels at JoVE.com

Force-Clamp Rheometry for Characterizing Protein-based Hydrogels

. מלחציים צולבים כוח Rheometry על אפיון Hydrogels מבוססי חלבונים

טכניקה חדשה של rheometry כוח-קלאמפ משמש כדי לחקור את התכונות המכאניות של דגימות בנפח נמוך חלבון מבוססת הידרוג קשורה בין מנוע סליל קול חיישן כוח. מערכת אנלוגית (PID) פרופורציונלי-אינטגרל-נגזרת מאפשר לבצע את 'חסימת העורקים' של הכוח מנוסים בפרוטוקול הרצוי.

Here, we describe a force-clamp rheometry method to characterize the biomechanical properties of protein-based hydrogels. This method uses an analog ...

The main advantages of this technique are that it utilizes a PID, which is a proportional integral derivative system to apply controlled force protocols to protein hydrogel samples, and it utilizes small sample volume. The protocols for the forces clamp allow for straight-forward interpretation of the data while low volumes are critical when working with hard to produce proteins that are available only in small amounts. The implications of this technique extend toward developing and characterizing new biometric materials with durable elasticity, using down-folding, refolding transition characteristic for proteins.This method can answer questions in tissue and biomaterial mechanics through enabling the measurements of billions of protein molecules in one pull and simulating crowded environments specific to biological tissues. Begin this procedure with reagent solutions preparation as described in the text protocol. To synthesize the protein-based hydrogel, first fix a 23-gauge needle on a one milliliter syringe with a pressed plunger.Then, cut a 10 centimeter polytetrafluoroethylene, or PTFE, tube using a razor blade. Attach the needle and syringe to one end of the PTFE tube. Insert the second end of the tube into a silane solution and fill the tube by retracting the syringe plunger.Leave the tube for approximately 30 minutes. Then, remove the silane solution and dry the tube with compressed air. Now, mix the protein solution with APS and Tris(bipyridine)ruthenium(II)chloride in a 1.5 milliliter tube using a constant volume ratio.Vortex the photoactive solution until it is mixed completely. Then, centrifuge the mix at maximum speed to remove any bubbles from the solution. Bubbles can form while loading the hydrogel photoactive mix into the Teflon tube, leading to sample damage.To prevent bubble formation, keep the Teflon tube end in the solution mix during the loading process and retract the syringe plunger slowly. Insert the open end of the treated PTFE tube into the photoactive mixture and draw the solution into the tube by retracting the syringe plunger. Now, place the loaded tube approximately 10 centimeters away from a 100 watt mercury lamp to prevent heating it and keep it there for up to 30 minutes at room temperature.Remove the tube from the needle and cut the edges of the tube near the hydrogel ends with a razor blade. Then, use a blunted 24-gauge needle to extrude the hydrogel into the Tris solution. Visually inspect the gels for any defects that might form during the extrusion or due to bubbles and discard any defective gels.Start the instrument control program and turn on the voice coil motor. Then, set the coil position to a value toward the end of the range. Displace the hooks in the Z direction and align them at the bend in the X direction.Then, record the values of the micrometer screws for the X direction. Now, tie a loose double-overhand knot at the end of the suture strand, such that the diameter of the loop is about four millimeters. Then, cut the loop off the strand.Repeat to form a second loop. Then, place the two loops on the hook connected to the force sensor. Fill the experimental chamber with Tris buffer and transfer the hydrogel sample into the filled chamber using medical tweezers.Place the voice coil and force sensor hooks close to the solution surface and align the hooks in all directions with the XYZ positioning manipulators. Using medical tweezers, hang both sides of the protein hydrogel sample on the hooks connected to the voice coil and force sensor. A typical error is an over-tightening of the suture loops around the hydrogel samples during the attachment process.This may lead to a notch formation and cutting of the hydrogel sample. Carefully tighten one suture loop around the hydrogel sample on the voice coil hook by holding both ends of the suture loop with medical tweezers and pulling them simultaneously. Repeat this step for the loop connected to the force sensor.Tighten the suture loops on the bends of each hook to prevent any slippage. Use these bends as reference points to find the zero separation between the hooks. Cut the excess lengths of the sutures using medical scissors.Move the attached hydrogel using Z manipulators along the Z axis towards the experimental chamber to immerse the hydrogel in the experimental solution. Align the hydrogel sample in YZ using the manipulators such that the gel is not under any stress. Zero the force sensor and separate the two hooks using the X micrometer stages until the gel starts to experience force.Once this happens, slightly turn back the micrometer screw in the X direction. Record the position of both manipulators for the voice coil motor and the sensor. Then, use the difference between these values and the ones previously measured to calculate the exact separation between the tethering hooks at the start of the experiment.To perform a force-ramp cycle by increasing the force at the desired loading rate, input the starting and final force values, as well as the duration of the protocol, which appears as a flipped V, followed by a constant low force for about 200 seconds to allow the protein domains to refold before the next cycle. Perform a constant-force protocol by applying a low force for 30 seconds. Then, increase the force to a constant force for a defined amount of time, followed by quenching the force back to the same low value for greater than 300 seconds to allow the protein domains to refold and the gel elasticity to recover.Finally, perform data analysis as described in the text protocol. Each measurement starts with a slack curve. By fitting two lines, the zero force on the sensor and the true gel length is determined.The true gel length is calculated from the intersection of the fits and the position of the micrometer screws. The force-clamp rheometry system can apply two different types of protocols. In the force ramp mode, the hydrogel sample experiences a force changing protocol with time that resembles an inverted V.In constant force mode, the applied stress changes in a step-like pattern.During measurements, the PID system adjusts the hydrogel extension by changing the coil position to follow the pre-defined set point from the force protocol. The strain is then calculated by dividing the measured extension to the true gel length. The stress is determined by dividing the applied force to the cross-sectional area of the hydrogel sample.Force Ramp traces are best represented as stress versus strain. The Young's modulus can be calculated from the slope measure during the loading phase. The hysteresis gives the energy dissipation coming from unfolding and refolding the protein.Constant force traces are best represented as a function of time. The change in strain can be used to measure the unfolding and refolding rates by fitting a double exponential. While attempting this procedure, it's important to remember to dry any silane from the tube before adding the protein, to centrifuge the protein mix to remove bubbles, to check the bubbles after injecting the protein mix inside the tube and to discard any mechanically damaged hydrogels after extrusion from the tube.Generally, individuals new to this method will struggle at first with attaching the gels to the hooks using the surgical sutures without causing damage to the hydrogel sample. Extruding the gel from the tube can damage the hydrogel as well. This method enables the applications of constant force protocols on low volume hydrogel samples.These experiments allow the decoupling of the elastic and the viscoelastic behaviors and the study of protein unfolding and folding mechanics in a bulk approach. After its development, this technique allows researchers in the field of material sciences to explore new soft biomaterials such as engineered polyproteins-based hydrogels that have an excellent potential for serving as tissue engineering scaffolds, drug delivery systems and biological ink for 3-D printing. Not only does this method provide insight into the mechanics of protein-based hydrogels, it can also be applied to other systems such as measuring the isometric response of muscle fibers or the elasticity of tissues such as skin.

Research

JoVE Journal

Engineering

Bringing the Visible Universe into Focus with Robo-AO

הבאת היקום הנראה לפוקוס עם רובו-AO

The angular  resolution of ground-based optical telescopes is limited by the degrading  effects of the turbulent atmosphere. In the absence of an ...

Concurrent Quantitative Conductivity and Mechanical Properties Measurements of Organic Photovoltaic Materials using AFM

מוליכות כמותית במקביל ומדידת תכונות מכאנית של חומרים אורגניים באמצעות Photovoltaic AFM

Organic photovoltaic  (OPV) materials are inherently inhomogeneous at the nanometer scale. Nanoscale  inhomogeneity of OPV materials affects performance ...

Fabrication of Nano-engineered Transparent Conducting Oxides by Pulsed Laser Deposition

ייצור של ננו מהונדס תחמוצות שקופות לנהל בתצהיר ליזר פעם

Nanosecond Pulsed  Laser Deposition (PLD) in the presence of a background gas allows the deposition  of metal oxides with tunable morphology, structure, ...

Spatial Separation of Molecular Conformers and Clusters

הפרדה מרחבית של קונפורמרים מולקולריים ואשכולות

Gas-phase molecular physics and physical chemistry experiments commonly use supersonic expansions through pulsed valves for the production of cold ...

The Preparation of Electrohydrodynamic Bridges from Polar Dielectric Liquids

הכנת גשרי Electrohydrodynamic מנוזלי דיאלקטרי פולאר

Horizontal and vertical liquid bridges are simple and powerful tools for exploring the interaction of high intensity electric fields (8-20 kV/cm) and ...

Selective Area Modification of Silicon Surface Wettability by Pulsed UV Laser Irradiation in Liquid Environment

פינת שינוי סלקטיבית של יכולת רטיבות משטח סיליקון על ידי פעמו UV לייזר הקרנה בסביבה נוזלית

The wettability of silicon (Si) is one of the important parameters in the technology of surface functionalization of this material and fabrication of ...

Detection and Recovery of Palladium, Gold and Cobalt Metals from the Urban Mine Using Novel Sensors/Adsorbents Designated with Nanoscale Wagon-wheel-shaped Pores

איתור והשחזור של פלדיום, מתכות זהב וקובלט ממכרה העירונית באמצעות חיישנים / Adsorbents רומן יעודיים עם נקבוביות-בצורת גלגל עגלה ננומטריים

Developing low-cost, efficient processes for recovering and recycling palladium, gold and cobalt metals from urban mine remains a significant challenge in ...

Writing Bragg Gratings in Multicore Fibers

כתיבת Gratings בראג בסיבים מרובי-ליבות

Fiber Bragg gratings in multicore fibers can be used as compact and robust filters in astronomical and other research and commercial applications. Strong ...

Characterizing Far-infrared Laser Emissions and the Measurement of Their Frequencies

אפיון פליטות לייזר רחוק אינפרה-אדומות והמדידה של התדרים שלהם

The generation and subsequent measurement of far-infrared radiation has found numerous applications in high-resolution spectroscopy, radio astronomy, and ...

Experimental Methods for Investigation of Shape Memory Based Elastocaloric Cooling Processes and Model Validation

שיטות ניסיוניות לחקירות זיכרון צורה Elastocaloric בהתבסס תהליכי קירור ותיקוף דגם

Shape Memory Alloys (SMA) using elastocaloric cooling processes have the potential to be an environmentally friendly alternative to the conventional vapor ...