Name: modifying baculovirus expression vectors to produce secreted plant proteins in insect cells
Uploaded: 2018-08-20T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells at JoVE.com

이 작품 Guozhou Xu에 대 한 노스 캐롤라이나 주립 대학에서 새로운 교수 시작 자금에 의해 지원 되었다.

참고: 분 비 식물 단백질 표정 및 결정 화에 대 한 수정 된 식 벡터와 곤충 셀/잠재 시스템 사용 됩니다.
1. 식물 단백질 분 비 식 GP67 신호 펩 티 드와 잠재 식 벡터의 수정
<ol><li>5' BglII 절단 사이트13, GP67 분 비 신호 순서, 노트, BamHI, EcoRI, StuI, 사리, SpeI, XbaI, PstI, 및 XhoI (그림 1A)의 다중 복제 사이트를 포함 하는 DNA 파편을 음성 합성. ?...

<ol>
	<li>Contreras-Gomez, A., Sanchez-Miron, A., Garcia-Camacho, F., Molina-Grima, E., Chisti, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+production+using+the+baculovirus-insect+cell+expression+system.">Protein production using the baculovirus-insect cell expression system.</a> Biotechnology Progress. 30, 1-18 (2014).</li><li>Khan, S., Ng, M. L., Tan, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus+3a+protein+and+the+assembly+of+coronavirus-like+particles+in+the+baculovirus+expression+system.">Expression of the severe acute respiratory syndrome coronavirus 3a protein and the assembly of coronavirus-like particles in the baculovirus expression system.</a> Methods in Molecular Biology. 379, 35-50 (2007).</li><li>Possee, R. D., King, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+Transfer+Vectors.">Baculovirus Transfer Vectors.</a> Methods in Molecular Biology. 1350, 51-71 (2016).</li><li>Vaughn, J. L., Goodwin, R. H., Tompkins, G. J., McCawley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+establishment+of+two+cell+lines+from+the+insect+Spodoptera+frugiperda+(Lepidoptera;+Noctuidae).">The establishment of two cell lines from the insect Spodoptera frugiperda (Lepidoptera; Noctuidae).</a> In Vitro. 13, 213-217 (1977).</li><li>Hink, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Established+insect+cell+line+from+the+cabbage+looper,+Trichoplusia+ni.">Established insect cell line from the cabbage looper, Trichoplusia ni.</a> Nature. 226, 466-467 (1970).</li><li>Davis, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+recombinant+protein+production+of+eight+insect+cell+lines.">Comparative recombinant protein production of eight insect cell lines.</a> In Vitro Cellular &amp; Development Biology - Animal. 29A, 388-390 (1993).</li><li>Wickham, T. J., Nemerow, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+growth+methods+and+recombinant+protein+production+in+BTI-Tn-5B1-4+insect+cells+using+the+baculovirus+expression+system.">Optimization of growth methods and recombinant protein production in BTI-Tn-5B1-4 insect cells using the baculovirus expression system.</a> Biotechnology Progress. 9, 25-30 (1993).</li><li>Davis, T. R., Trotter, K. M., Granados, R. R., Wood, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+expression+of+alkaline+phosphatase+as+a+reporter+gene+for+evaluation+of+production,+glycosylation+and+secretion.">Baculovirus expression of alkaline phosphatase as a reporter gene for evaluation of production, glycosylation and secretion.</a> Nature Biotechnology. 10, 1148-1150 (1992).</li><li>Murphy, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+expression,+secretion,+and+large-scale+purification+of+recombinant+HIV-1+gp120+in+insect+cell+using+the+baculovirus+egt+and+p67+signal+peptides.">Enhanced expression, secretion, and large-scale purification of recombinant HIV-1 gp120 in insect cell using the baculovirus egt and p67 signal peptides.</a> Protein Expression and Purification. 4, 349-357 (1993).</li><li>Sun, S. C., Lindstrom, I., Boman, H. G., Faye, I., Schmidt, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemolin:+an+insect-immune+protein+belonging+to+the+immunoglobulin+superfamily.">Hemolin: an insect-immune protein belonging to the immunoglobulin superfamily.</a> Science. 250, 1729-1732 (1990).</li><li>Li, Z., Chakraborty, S., Xu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+CLE+peptide+perception+by+plant+receptors+implicated+from+structural+and+functional+analyses+of+TDIF-TDR+interactions.">Differential CLE peptide perception by plant receptors implicated from structural and functional analyses of TDIF-TDR interactions.</a> PLoS One. 12, e0175317 (2017).</li><li>Chakraborty, S., Pan, H., Tang, Q., Woolard, C., Xu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Extracellular+Domain+of+Pollen+Receptor+Kinase+3+is+structurally+similar+to+the+SERK+family+of+co-receptors.">The Extracellular Domain of Pollen Receptor Kinase 3 is structurally similar to the SERK family of co-receptors.</a> Scientific Reports. 8, 2796 (2018).</li><li>Khorana, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+synthesis+of+a+gene.">Total synthesis of a gene.</a> Science. 203, 614-625 (1979).</li><li>Bahl, C. P., Marians, K. J., Wu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+for+inserting+specific+DNA+sequences+into+cloning+vehicles.">A general method for inserting specific DNA sequences into cloning vehicles.</a> Gene. 1, 81-92 (1976).</li><li>Xu, W., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Vaccine-Derived+Polioviruses,+Relevance+for+the+Global+Polio+Eradication+Initiative.">Isolation and Characterization of Vaccine-Derived Polioviruses, Relevance for the Global Polio Eradication Initiative.</a> Methods in Molecular Biology. 1387, 213-226 (2016).</li><li>Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids.">Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> Journal of Molecular Biology. 166, 557-580 (1983).</li><li>Zhang, S., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purifying+plasmid+DNA+from+bacterial+colonies+using+the+QIAGEN+Miniprep+Kit.">Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), 247 (2007).</li><li>Reddy, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+the+alpha+subunit+of+the+epithelial+sodium+channel,+ENaC.">Expression and purification of the alpha subunit of the epithelial sodium channel, ENaC.</a> Protein Expression and Purification. 117, 67-75 (2016).</li><li>Harris, T. J., Emtage, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+heterologous+genes+in+E.+coli.">Expression of heterologous genes in E. coli.</a> Microbiological Sciences. 3, 28-31 (1986).</li><li>Kaur, J., Kumar, A., Kaur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+optimization+of+heterologous+protein+expression+in+E.+coli:+Roadblocks+and+reinforcements.">Strategies for optimization of heterologous protein expression in E. coli: Roadblocks and reinforcements.</a> International Journal of BIological Macromolecules. 106, 803-822 (2018).</li><li>Guo, Y., Yang, F., Tang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Overview+of+Protein+Secretion+in+Yeast+and+Animal+Cells.">An Overview of Protein Secretion in Yeast and Animal Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1662, 1-17 (2017).</li><li>Blight, M. A., Chervaux, C., Holland, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+secretion+pathway+in+Escherichia+coli.">Protein secretion pathway in Escherichia coli.</a> Current Opinion in Biotechnology. 5, 468-474 (1994).</li><li>Idiris, A., Tohda, H., Kumagai, H., Takegawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+protein+secretion+in+yeast:+strategies+and+impact+on+protein+production.">Engineering of protein secretion in yeast: strategies and impact on protein production.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 86, 403-417 (2010).</li><li>Wormald, M. R., Dwek, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycoproteins:+glycan+presentation+and+protein-fold+stability.">Glycoproteins: glycan presentation and protein-fold stability.</a> Structure. 7, R155-R160 (1999).</li><li>Geisler, C., Mabashi-Asazuma, H., Jarvis, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Overview+and+History+of+Glyco-Engineering+in+Insect+Expression+Systems.">An Overview and History of Glyco-Engineering in Insect Expression Systems.</a> Methods in Molecular Biology. 1321, 131-152 (2015).</li><li>Li, Z., Chakraborty, S., Xu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+crystallographic+studies+of+the+extracellular+domain+of+the+first+plant+ATP+receptor,+DORN1,+and+the+orthologous+protein+from+Camelina+sativa.">X-ray crystallographic studies of the extracellular domain of the first plant ATP receptor, DORN1, and the orthologous protein from Camelina sativa.</a> Acta Crystallographica Section F: Structural BIology and Crystallization Communications. 72, 782-787 (2016).</li><li>Aricescu, A. R., Owens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+recombinant+glycoproteins+in+mammalian+cells:+towards+an+integrative+approach+to+structural+biology.">Expression of recombinant glycoproteins in mammalian cells: towards an integrative approach to structural biology.</a> Current Opinion in Structural Biology. 23, 345-356 (2013).</li><li>Reuter, L. J., Bailey, M. J., Joensuu, J. J., Ritala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale-up+of+hydrophobin-assisted+recombinant+protein+production+in+tobacco+BY-2+suspension+cells.">Scale-up of hydrophobin-assisted recombinant protein production in tobacco BY-2 suspension cells.</a> Plant Biotechnology Journal. 12, 402-410 (2014).</li><li>Dohi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+virus-mediated+expression+of+a+foreign+protein+in+suspension-cultured+plant+cells.">Inducible virus-mediated expression of a foreign protein in suspension-cultured plant cells.</a> Archives of Virology. 151, 1075-1084 (2006).</li></ol>

크기 및 생물 학적 시스템에 단백질의 수천의 안정성에 다양성을 감안할 때, 그것은 종종 경험적 연구에 대 한 실험실을 분리 표현 시스템을 결정 하는 특정 단백질의 표현에 대 한 선택. 대장균 식 시스템은 종종19최대 규모 박테리아, 문화 미디어, 그리고 상대적으로 완화의 저렴 한 비용의 짧은 라이프 사이클에 따른 단백질 표정에 대 한 첫 번째 선택. 그러나 60 kDa,, ?...

특히 x 선 결정학 연구에 대 한 생화학 및 생물 characterizations 위해 균질 재조합 단백질의 대량 생산의 수 연구 실험실을 위한 필수적입니다. 대장균, 효 모, 곤충 세포, 포유류 세포, 식물 세포, 등 그들의 사이에서 많은 확고 분리 식 시스템, 잠재 중재 곤충 세포 표현 시스템은 가장 중 일반적으로 구조적으로 접힌된 대형 재조합 진 핵 단백질의 단백질 결정 화1대량 생산 기법을 사용.
잠재 식 시스템의 식 벡터는 강한 polyhedrin 또는 재조합 세포내 단백질2,3의 높은 수익률을 생산 하는 P10 발기인을 포함 하도록 설계 되었습니다. 재조합 잠재 수 있도록, 관심사의 유전자 Autographa californica nucleopolyhedroviral 멀티 게놈의 polyhedrin (polh) 로커 스를 포함 하는 곤충 벡터에 복제 됩니다. 결과 구문 다음 시퀀스 및 올바른 열려있는 독서 프레임 (ORF) 확인. 올바른 구문 다음 transfection의 과정을 통해 호스트 곤충 세포에 도입 되었습니다. 관심사의 유전자는 상 동 재조합에 의해 바이러스 성 게놈에 삽입 됩니다. 이 이벤트는 재조합 생산 하는 후 복제 바이러스 입자1언약궤 재조합 형 바이러스 성 게놈의 생산에서 발생 합니다.
곤충 세포 표현 시스템에서 가장 일반적으로 사용 되는 Sf9 및 높은 5 (Hi5) 세포 이다. Sf9 세포는 Sf21, Spodoptera frugiperda의 번데기 난소 세포에서 파생 된의 클론 분리 되며 Hi5 세포 클론 분리는 부모의 Trichoplusia ni 난소 세포 선 테네시-3684,5에서 파생 된. Hi5 셀 일반적으로 재조합 단백질6의 더 높은 양을 생성을 선택 하는 동안 공동 transfections, 바이러스 증폭 및 상 패 분석 실험, Sf9 세포에 지휘 된다. Hi5 세포는 돌연변이 바이러스를 생산 하는 그들의 추세 때문에 세대 및 바이러스 progenies의 증폭에 적합 하지 않습니다 지적 가치가 있다. 전통적으로, 25-30 ° C의 온도 범위는 곤충 세포의 경작에 좋은 것으로 간주 됩니다. 그러나, 그것은 27-28 ° C 곤충 세포 성장과 감염7,8에 대 한 최적의 온도 보고 되었습니다.
강한 신호 순서 선행 하는 유전자의 소개 secreted 단백질의 높은 식이 필요 합니다. 신호 순서 효율적으로 단백질 분 비와 포스트 번역 상 수정 적절 한 접는 및 안정화3에 필요한에 대 한 바인딩과 그물에 번역 된 재조합 단백질을 안내 것입니다. 신호 펩 티 드 순서는 잠재 봉투 단백질 GP64/67, 꿀벌 melittin, 그리고 다른 사람, 같이 잠재 중재 식 시스템3분 비 재조합 형 단백질의 표정을 촉진 하기 위해 선택 되었습니다. GP67의 신호 펩 티 드의 도입 대상 유전자9의 내장 신호 펩 티 드를 사용 하 여 비교 secreted 재조합 단백질의 식 수율을 개선 하기 위해 표시 되었습니다. Hemolin는 거 대 한 실크 나 방 Hyalophora cecropia, 박테리아 감염10시 유도의 hemolymph 단백질 이다. 유도 식의 상대적으로 높은 수준으로 인해 유전자의 신호 펩 티 드 순서 잠재 곤충 세포 시스템에서 재조합 단백질의 분 비 식 중재에 사용할 수 있습니다.
A. thaliana Tracheary 요소 차별화 금지 요인 수용 체 (TDR)와 꽃가루 수용 체 키 니 아 제 3 (PRK3) 둘 다 단백질11,12의 식물 신 부유한 반복 같은 수용 체 키 니 아 제 (LRR-RLK) 가족에 속하는 . 구조와 공장 수용 체 단백질의, 뿐만 아니라 다른 식물 분 비 단백질의 구조 및 생 화 확 적인 특성 있을이 가족의 기능을 공부 하기 위하여 잠재 곤충 세포 표현 시스템 수정 되었습니다. 단백질의 품질 및 생산 수율을 향상 시킵니다. TDR 및 PRK3의 세포 외 도메인 성공적으로 두 개의 수정된 식 벡터를 사용 하 여 잠재 곤충 세포 표현 시스템에서 표현 되었습니다. TDR 및 PRK3 단백질의 extracellular 도메인 모두 화 시키는 되는. 이 문서는 GP67 또는 발기인 및 여러 복제 사이 hemolin 신호 순서를 통합 하 여 표현과 많은 양의 두 수정된 잠재 식 벡터와 재조합 분 비 식물 단백질의 정화를 보고 사이트입니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Incubator shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Model Excella E25</td>
			<td>27 oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Model 2005</td>
			<td>27 oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>BECKMAN</td>
			<td>Model J-6</td>
			<td>with a swing bucket rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Herculase II Fusion DNA Polymerase</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>600677-51</td>
			<td>For PCR amplification of DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>Model C1000 Touch</td>
			<td>For PCR amplification of DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>Model I 24</td>
			<td>For growing baceria culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Customer DNA synthesis</td>
			<td>GENSCRIPT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI (HF)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3136S</td>
			<td>Restriction Endonuclease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BglII</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0144S</td>
			<td>Restriction Endonuclease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI (HF)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3189S</td>
			<td>Restriction Endonuclease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0146S</td>
			<td>Restriction Endonuclease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202T</td>
			<td>DNA ligation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td>DNA purification from Agorase gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td>Plasmid DNA purification from bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15510-019</td>
			<td>For DNA gel electropherosis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAX Efficiency DH5&#945; competen cell</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18-258-012</td>
			<td>For transformation of DNA ligation mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lennox L LB Broth</td>
			<td>Research Product International Corp.</td>
			<td>L24066-5000.0</td>
			<td>For making bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11593-019</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Sulfate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15160-054</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>64-75-5</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15710-064</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAX Efficiency DH10Bac competent cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10361-012</td>
			<td>For making bacmid DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S.O.C. Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15544-034</td>
			<td>For DNA transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellFECTIN II Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10362-101</td>
			<td>Insect cell transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bac-to-Bac Expression System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10359-016</td>
			<td>Baculovirus-insect cells expression kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bluo-gal</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15519-028</td>
			<td>For isolation of recominant Bacmid DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15529-019</td>
			<td>For isolation of recominant Bacmid DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFastBac1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10360014</td>
			<td>Baculorirus expression vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9 cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11496015</td>
			<td>Sf9 monolayer cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hi5 cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>B85502</td>
			<td>High Five insect cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grace&#8217;s insect medium, unsupplemented</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11595030</td>
			<td>Sf9 cell transfection minimum medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grace&#8217;s insect medium, supplemented</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11605102</td>
			<td>Sf9 monolayer cell culture complete medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf-900 II SFM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10902104</td>
			<td>Sf9 suspension cell culture medium without FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Express Five SFM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10486025</td>
			<td>Hi5 cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>100 ml (10,000 I.U./ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS Certified</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16000-044</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-1B</td>
			<td>Flat-bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>353025</td>
			<td>100/case</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1415-2500</td>
			<td>500 tubes/bag</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical screw cap centrifuge tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1475-0511</td>
			<td>25 tubes/bag</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml conical screw cap centrifuge tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1500-1211</td>
			<td>25 tubes/bag</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Superflow</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30430</td>
			<td>NiNTA resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH-indicator strips</td>
			<td>EMD Millipore Corporation</td>
			<td>1.09535.0001</td>
			<td>pH 0 - 14</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modifying baculovirus expression vectors to produce secreted plant proteins in insect cells

그것은 구조 및 생화학 연구 재조합 분 비 진 핵 단백질을 표현 하는 과학자에 대 한 도전이 되었습니다. 잠재 중재 곤충 세포 표현 시스템 일부 포스트 번역 상 수정 재조합 진 핵 세포 분 비 단백질을 표현 하는 데 사용 하는 시스템 중 하나입니다. 분 비 단백질 단백질 glycosylation, 이황화 결합 형성, 및 다른 포스트 번역 상 수정 분 비 경로 통해 라우팅할 필요가 있다. 를 개선 하기 위해 분 비 식물 단백질의 기존 곤충 세포 표현 잠재 식 벡터 중 하나는 GP67의 추가 또는 발기인 및 다중 복제 사이트 간에 hemolin 신호 펩 티 드 순서에 의해 수정 됩니다. 이 새롭게 설계 된 수정된 벡터 시스템은 성공적으로 애기 thaliana의 수용 성 재조합 분 비 식물 수용 체 단백질의 높은 수익률을 생산. 두 애기 TDR 및 PRK3 원형질 막 수용 체의 세포 외 도메인 표현된 식물 단백질의 x 선 결정학 연구 화 시키는 했다. 수정 된 벡터 시스템 뿐만 아니라 동물의 왕국에 있는 재조합 형 분 비 단백질의 표정을 위해 잠재적으로 이용 될 수 있는 향상 된 도구입니다.

그림 1에서 보듯이 두 수정된 pFastBac1 잠재 식 벡터는 GP67 또는 hemolin 신호 순서 대상 유전자의 본질적인 신호 순서를 대체 하는 secreted 단백질을 표현 하기 위해 사용 되었다. 바이러스 성 GP67와 곤충 hemolin 유전자 세포에 있는 높은 분 비 식 수준 입증 되었습니다. 융해 단백질이 두 신호 시퀀스 중 하나가 크게 분 비 식 수준 향상으로 예상 된다. 동일?...

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Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

식물 단백질 곤충 세포에서 분 비 생산 잠재 식 벡터를 수정

여기, 선물이 곤충 세포 및 잠재 단백질 식 시스템 단백질 결정 화에 대 한 분 비 하는 식물 단백질의 대량 생산에 활용에 대 한 프로토콜. 잠재 식 벡터 GP67 또는 곤충 hemolin 신호 펩 티 드 식물 곤충 세포에서 단백질 분 비 식에 대 한 수정 되었습니다.

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

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항온, 발현, 정제, 인간 세로토닌 전달체 결정화 바운드<em&gt; S</em&gt; 시탈 로프 람

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

연구

생화학

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

절연 및 호흡 측정의 미토 콘 드리 아 애기 thaliana 에서

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

카페인 추출, 효소 활동 및 식물 세포 정지에서 카페인 Synthase의 유전자 발현

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

인지질 단백질 Annexin a 2 석 영 공명 기를 사용 하 여 지원 되는 고체 지질 Bilayers에 바인딩의 바인딩 역학 공부 되는 낭비 적인 Microgravimetry

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

How to Quantify the Fraction of Photoactivated Fluorescent Proteins in Bulk and in Live Cells

Photoactivated 형광 단백질 대량 및 라이브 셀의 일부분을 계량 하는 방법

Photoactivatable and -convertible fluorescent proteins (PA-FPs) have been used in fluorescence live-cell microscopy for analyzing the dynamics of cells ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

체 외 형광 공명 에너지 전달에 밀리초 시간 규모에서 단백질 복합물의 역학을 공부 하는 사용 하 여

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Fumarylacetotate 하이드로 아세테이트 도메인 함유 단백질의 발현, 정제, 결정화 및 효소 어세포

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling

유전자 발현 프로파일링을 위한 수정된 방법으로 시리얼 씨앗에서 고품질 전사 데이터 획득

The characterization of gene expression is dependent on RNA quality. In germinating, developing and mature cereal seeds, the extraction of high-quality ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support