Name: label-free identification of lymphocyte subtypes using three-dimensional quantitative phase imaging and machine learning
Uploaded: 2018-11-19T13:00:00
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这项工作得到了 kaist bk21+ 计划、tomocube 公司和韩国国家研究基金会的支持 (2015ra3a2066, 2017m3c1a3013923, 2018k0003996)。y. jo 感谢 kaist 总统研究金和阿桑基金会生物医学科学奖学金的支持。

动物护理和实验程序是在 kaist 机构动物照料和使用委员会 (ka2010-21、kaa160001 和 ka2015-03) 的批准下进行的。本研究中的所有实验都是按照批准的准则进行的。
1. 小鼠血液淋巴细胞分离
<ol><li>一旦 c57bl/6j 小鼠通过吸入二氧化碳实现安乐死 , 将26-g 针插入小鼠心脏并收集0.3 毫升的血液。直接将血液放入用1毫升磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 稀释的 100 u/ml 肝素溶液管中。 注: 或?...

我们提出了一个协议, 使标签免费识别淋巴细胞类型结合3d 定量相位成像和机器学习。该协议的关键步骤是定量相位成像和特征选择。为了获得最佳的全息成像, 应按上述方式控制细胞的密度。细胞的机械稳定性对于获得精确的 3d ri 分布也很重要, 因为浮动或振动细胞运动会干扰全息图测量时, 照明角度的变化。因此, 我们等待了几分钟, 直到样品在成像室变得稳定和静态, 然后再测量全息图。最后,...

淋巴细胞可分为多种亚型, 包括 b、辅助 (cd4 +) t、细胞毒性 (cd8 +) t 和调节 t 细胞。每种淋巴细胞类型在适应性免疫系统中都有不同的作用;例如, b 淋巴细胞产生抗体, 而 t 淋巴细胞检测到特定的抗原, 消除异常细胞, 并调节 b 淋巴细胞。淋巴细胞功能和调节受到各种疾病的严格控制, 并与之相关, 包括癌症1、自身免疫性疾病2和病毒感染 3。因此, 确定淋巴细胞类型对于了解其在此类疾病中的病理生理作用以及在临床上进行免疫治疗具有重要意义。
目前, 淋巴细胞类型的分类方法依靠抗原抗体反应, 靶向特定的表面膜蛋白或表面标记4。靶向表面标记是确定淋巴细胞类型的一种精确和准确的方法。但是, 它需要昂贵的试剂和耗时的程序。此外, 它还具有改变膜蛋白结构和改变细胞功能的风险。
为了克服这些挑战, 这里描述的协议介绍了使用三维定量相位成像 (qpi) 和机器学习5的淋巴细胞类型的无标签识别.这种方法可以根据从单个淋巴细胞的无标签三维成像中提取的形态信息, 在单细胞水平上对淋巴细胞类型进行分类。与传统的荧光显微镜技术不同, qpi 利用折射率 (ri) 分布 (活细胞和组织的固有光学特性) 作为光学对比度6,7。单个淋巴细胞的 ri 图是特定于淋巴细胞亚型的表型信息。在这种情况下, 为了系统地利用单个淋巴细胞的三维 ri 断层扫描, 采用了一种有监督的机器学习算法。
利用各种 qpi 技术, 细胞的三维 ri 图像已被积极用于细胞病理生理学的研究, 因为它们提供了一个无标签, 定量成像能力8,9,10, 11,12,13。此外, 单个细胞的三维 ri 分布可以提供有关细胞的形态、生化和生物力学信息。3d ri 断层扫描术以前曾被用于血液学领域 14,15,16, 17, 传染病18,19, 20、免疫学21、细胞生物学22、23、炎症24、癌症25、神经科学26、27、发育生物学 28、毒理学29, 微生物学12,30,31,32。
尽管 3d ri 断层扫描物提供了细胞的详细形态和生化信息, 但通过简单地成像 3d ri 图5很难实现淋巴细胞亚型的分类.为了系统、定量地利用测量到的三维 ri 图进行细胞类型分类, 我们采用了机器学习算法。最近, 有几项工作是用各种机器学习算法33分析细胞的定量相位图像, 包括微生物的检测34、细菌属的分类 35,36、炭疽孢子的快速无标签检测 37, 精子细胞的自动分析 38, 癌细胞 39,40 的分析, 巨噬细胞活化41 的检测.
该协议提供了详细的步骤, 使用 3d qpi 和机器学习在单个细胞级别执行无标签的淋巴细胞类型识别。这包括: 1) 从小鼠血液中分离淋巴细胞, 2) 通过流式细胞仪进行淋巴细胞分选, 3) 3d qpi, 4) 从 3d ri 肿瘤中提取定量特征, 5) 有监督的学习, 以识别淋巴细胞类型。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1100px;" width="1099">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:303px;">Mouse</td>
			<td style="width:175px;">Daehan Biolink</td>
			<td style="width:344px;">C57BL/6J mice&#160;</td>
			<td style="width:279px;">gender and age-matched, 6 &#8211; 8 weeks</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Falcon conical centrifuge tube</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td>15 mL</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Phosphate-buffered saline&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>806544-500ML</td>
			<td style="width:279px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Ammonium-chloride-potassium lysing buffer&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1049201</td>
			<td style="width:279px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">RPMI-1640 medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td style="width:279px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10438018</td>
			<td style="width:279px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:303px;">Antibody</td>
			<td style="width:175px;">BD Biosciences</td>
			<td>553140 (RRID:AB_394655)</td>
			<td style="width:279px;">CD16/32 (clone 2.4G2)</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555275 (RRID:AB_395699)</td>
			<td>CD3&#949; (clone 17A2)</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Antibody</td>
			<td>Biolegnd</td>
			<td>100734 (RRID:AB_2075238)</td>
			<td>CD8&#945; (clone 53-6.7)</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557655 (RRID:AB_396770)</td>
			<td>CD19 (clone 1D3)</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557683 (RRID:AB_396793)</td>
			<td>CD45R/B220 (clone RA3-6B2)</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>552878 (RRID:AB_394507)</td>
			<td>NK1.1 (clone PK136)</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Antibody</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-0041-85 (RRID:AB_464893)</td>
			<td>CD4 (clone GK1.5)</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">DAPI&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10236276001</td>
			<td style="width:279px;">4,6-diamidino-2-phenylindole</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Flow cytometry&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Aria II or III&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Imaging chamber</td>
			<td>Tomocube, Inc.</td>
			<td>TomoDish</td>
			<td style="width:279px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Holotomography</td>
			<td>Tomocube, Inc.</td>
			<td>HT-1H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Holotomography imaging software</td>
			<td>Tomocube, Inc.</td>
			<td>TomoStudio</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Image professing software</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>Matlab R2017b</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

label-free identification of lymphocyte subtypes using three-dimensional quantitative phase imaging and machine learning

我们在这里描述了一个协议的无标签识别淋巴细胞亚型使用定量相位成像和机器学习。淋巴细胞亚型的鉴定对免疫学的研究以及各种疾病的诊断和治疗都很重要。目前, 对淋巴细胞类型进行分类的标准方法依赖于通过抗原抗体反应标记特定的膜蛋白。然而, 这些标记技术具有改变细胞功能的潜在风险。通过利用三维定量相位成像和机器学习算法测量的内在光学对比来克服这些挑战。测量淋巴细胞的三维折射率 (ri) 断层扫描物提供了有关单个细胞的三维形态学和表型的定量信息。然后, 使用机器学习算法对从测量到的 3d ri 断层扫描图中提取的生物物理参数进行定量分析, 从而能够在单细胞水平上对淋巴细胞类型进行无标签识别。我们测量 b、cd4+ t 和 cd8+ t 淋巴细胞的 3d ri 断层扫描, 并以80% 以上的准确率确定它们的细胞类型。在本协议中, 我们描述了淋巴细胞分离、三维定量相位成像和机器学习的详细步骤, 以识别淋巴细胞类型。

图 11显示整个协议的原理图过程。使用这里介绍的程序, 我们分离 b (n = 149)、cd4+ t (n = 95) 和 cd8 + t (n = 112) 淋巴细胞。为了在不同的光照角度获得相位和振幅信息, 通过改变光照角度 (从-60°到 60°) 测量了每个淋巴细胞的多个二维全息图。通常情况下, 50个全息图可用于重建三维 ri 断层扫描图, 但2d 全息图的数量可以根据成像速度和质量进行调整。利...

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Label-Free Identification of Lymphocyte Subtypes Using Three-Dimensional Quantitative Phase Imaging and Machine Learning

我们描述了一种使用定量相位成像和机器学习算法对淋巴细胞亚型进行无标签识别的协议。对淋巴细胞三维折射率图的测量为单个细胞提供了三维形态和生化信息, 然后用机器学习算法进行分析, 以识别细胞类型。

用三维定量相位成像和机器学习技术对淋巴细胞亚型进行无标签鉴定

We describe here a protocol for the label-free identification of lymphocyte subtypes using quantitative phase imaging and machine learning. Identification ...

此方法为传统的荧光标记和流式细胞学分析程序提供了替代方案，这些过程既耗时又昂贵，并且存在改变样品细胞功能的风险。该技术的主要优点是三维折射率断层扫描和机器学习是无标签和定量的方法，能够快速准确地识别淋巴细胞。该技术的影响扩展到血液癌和自身免疫性疾病的治疗，因为淋巴细胞的鉴定对于疾病诊断和适当的治疗应用至关重要。虽然这种方法可以提供对淋巴细胞群的洞察，但它也可以应用于其他感兴趣的单细胞的分析，包括细菌。3D 定量相位成像技术的可视化演示至关重要，因为它有助于明确指导如何执行该技术，并可以深入了解其应用。首先通过荧光激活细胞排序收集每个淋巴细胞子集。为了获得最佳成像效果，将每个细胞样品稀释至每微升RPMI介质180个细胞的浓度，然后缓慢地将第一个稀释样品的120微升注入成像室。在确认腔室内无气泡后，将一滴蒸馏水放在三D定量相显微镜的物镜上，然后将成像室置于显微镜的翻译阶段。调整阶段，使样品与物镜对齐，并分别单击成像软件显微镜透视的校准选项卡中的对焦和表面，分别调整物镜和冷凝器镜头的轴向位置。单击"自动"模式可对齐目标镜头和冷凝器镜头。要优化校准，请打开扫描模式并手动调整镜头，使数字微镜设备模式与中心对齐。然后，返回到"正常"模式并调整平移阶段以在视野中定位单元格。调整客观透镜的轴向位置以找到焦平面，直到屏幕上显示的样本边界几乎不可见。必须完美调整细胞的焦点，以生成最佳的 3DRI 汤姆形图。如果图像拍摄不正确，3D 重建将受到损害，从而产生嘈杂的汤姆形图。调整平移阶段以查找没有单元格的位置，然后单击"校准"以测量具有不同照明角度的多个 2D 全息图。调整平移阶段以定位视图区域中心的单元格。在"获取"选项卡下，命名要成像的示例。单击 3D 快照，使用与刚刚测量的 2D 全息图相同的照明角度测量单元格的全息图。当采集的数据出现在数据管理面板中时，右键单击数据并单击"过程"，使用成像软件中实现的去射断层扫描算法从 2D 全息图中重建 3D 折射率托马图。成像后，在"数据管理"面板中，右键单击数据，然后单击"打开"以可视化数据。单击单元格的中心以重新定位它，然后单击数据管理器面板上的 RI 汤姆图。在"预设"选项卡上单击"加载"和"双击淋巴细胞"。xml，这是成像软件提供的预定义传输函数，用于根据 3DRI 分布可视化汤姆图。滚动鼠标以放大并拖动单元格以旋转任何方向。对于定量形态学和生化特征提取，将所有断层扫描数据放在单个文件夹中，并在主文件夹中的单个子文件夹中拆分细胞类型。接下来，在相应的成像软件中打开补充功能提取文件，并编辑第 14 行，以指定从中提取数据的汤姆图文件夹。编辑第 15 行以指定要将提取的要素数据保存到的文件夹并执行代码。对于数据集中的每个汤姆图，代码将计算表面积、细胞体积、球面、蛋白质密度和干质量每折射率阈值。对于监督学习和识别，请使用 MATLAB 中的简单随机拆分算法将提取的要素数据随机拆分为单独的训练和测试集文件夹。打开补充训练文件并编辑行 14 以指定训练集文件夹，第 16 行指定用于保存训练分类器的文件夹，第 17 行为分类器设置文件名。然后执行代码。使用训练集的选定功能，代码将训练具有 K 最近邻算法的分类器，并将分类器保存在指定的文件夹中。接下来，打开补充测试文件三，编辑行 14 到 15 以指定要测试的训练分类器，第 17 行指定训练测试集。然后执行代码。分类器将识别测试集中单个淋巴细胞的细胞类型。这里代表的3D渲染率率图的B淋巴细胞，CD4阳性T淋巴细胞，CD8阳性T淋巴细胞具有不同配色方案，根据通过成像软件分配的折射率值分配显示。从折射率值可以计算定量形态和生化特征。在该实验中，训练和试验例的T和B淋巴细胞分类精度分别是93.15%和89.81%。对CD4阳性和CD8阳性的T淋巴细胞进行了统计分类，训练和测试组准确率分别是87.41%和84.38%。最后，多类、细胞类型分类器在训练和测试阶段的精度分别是80.65%和75.93%。图像的质量和数量对于这项技术的成功至关重要。图像质量越好，数据量越高，识别的准确性越好。深度学习可用于更全面地分析汤姆图的复杂数据，提高识别性能。此外，荧光和三维定量相位成像可用于研究已识别淋巴细胞的生理作用路径。这项技术开发后，为细胞生物学和生物医学领域的研究人员探索不同生物体内感兴趣的特定疾病铺平了道路。事实上，特别是免疫学家，可能受益于使用这项新技术来识别感兴趣的人群。

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