Name: label-free identification of lymphocyte subtypes using three-dimensional quantitative phase imaging and machine learning
Uploaded: 2018-11-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Label-Free Identification of Lymphocyte Subtypes Using Three-Dimensional Quantitative Phase Imaging and Machine Learning at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af KAIST BK21 + Program, Tomocube, Inc., og National Research Foundation Korea (2015R1A3A2066550, 2017M3C1A3013923, 2018K 000396). Y. Jo anerkender støtte fra KAIST Presidential Fellowship og Asan Foundation biomedicinsk videnskab legat.

Dyrs pleje og eksperimentelle procedurer blev udført under godkendelse af institutionelle dyrs pleje og brug Udvalget af KAIST (KA2010-21, KA2014-01 og KA2015-03). Alle eksperimenter i denne undersøgelse blev gennemført i overensstemmelse med de godkendte retningslinjer.
1. lymfocytter Isolation fra mus blod
<ol><li>Når en C57BL/6J mus er euthanized via CO2 indånding, indsætte en 26 G kanyle ind i musen hjertet og indsamle 0,3 mL blod. Direkte sætte blod ind i et rør med 1...

Vi præsenterer en protokol, der gør det muligt for etiket-fri identifikation af lymfocyt typer at udnytte 3D kvantitative fase imaging og machine learning. Kritiske trin i denne protokol er kvantitative fase imaging og funktion udvalg. For den optimale holografisk imaging, bør tætheden af celler kontrolleres som beskrevet ovenfor. Mekanisk stabilitet af cellerne er også vigtigt at få en præcis 3D RI distribution, fordi flydende eller vibrationelle cellulære beslutningsforslag vil forstyrre hologram målinger på ...

Lymfocytter kan inddeles i forskellige undertyper herunder B, helper (CD4 +) T cytotoksisk (CD8 +) T og regulerende T celler. Hver lymfocyt har en anden rolle i det adaptive immunsystem; for eksempel, producerer B-lymfocytter antistoffer, der henviser til, at T-lymfocytter opdage specifikke antigener, fjerne unormale celler og regulere B-lymfocytter. Lymfocyt funktion og regulering er stramt kontrolleret af og relateret til forskellige sygdomme herunder kræft1, autoimmune sygdomme2og virusinfektioner3. Identifikation af lymfocyt typer er således vigtigt at forstå deres patofysiologiske roller i sådanne sygdomme og for immunterapi i klinikker.
I øjeblikket, afhængige metoder til klassificering af lymfocyt typer antigen-antistof reaktioner ved at målrette specifikke overflade Membranproteiner eller celleoverflademarkører4. Målretning celleoverflademarkører er en præcis og nøjagtig metode til at bestemme lymfocyt typer. Det kræver dog dyrt reagenser og tidskrævende procedurer. Desuden, det bærer risikoen for ændring af membran proteinstrukturer og ændring af cellulære funktioner.
For at overvinde disse udfordringer, introducerer protokollen beskrevet her den etiket-fri identifikation af lymfocyt typer ved hjælp af 3D kvantitative fase imaging (QPI) og machine learning5. Denne metode gør det muligt for klassifikation af lymfocyt på en enkelt celle niveau baseret på morfologiske oplysninger fra etiket-gratis 3D billeddannelse af enkelte lymfocytter. I modsætning til konventionelle Fluorescens mikroskopi-teknikker udnytter QPI brydningsindeks (RI) distributioner (iboende optiske egenskaber af levende celler og væv) som optisk kontrast6,7. RI Tomogrammer af individuelle lymfocytter repræsenterer fænotypiske oplysninger specifikt for undertyper af lymfocytter. I dette tilfælde for at systemisk udnytte 3D RI Tomogrammer af individuelle lymfocytter, blev en overvåget maskinen læring algoritme udnyttet.
Bruger forskellige QPI teknikker, de 3D RI Tomogrammer af celler er blevet aktivt brugt til studie af celle Patofysiologi fordi de giver en etiket-fri, kvantitative imaging kapacitet8,9,10, 11,12,13. Også, de 3D RI distributioner af individuelle celler kan give morfologiske, biokemiske og Biomekanisk information om celler. 3D RI Tomogrammer tidligere har udnyttet inden for hæmatologi14,15,16,17, infektionssygdomme18,19, 20, immunologi21, celle biologi22,23, betændelse24, kræft25, neurovidenskab26,27, udviklingsmæssige biologi28, toksikologi 29og Mikrobiologi12,30,31,32.
Selv om 3D RI Tomogrammer give detaljerede oplysninger om morfologiske og biokemiske af celler, er klassificering af lymfocyt undertyper vanskeligt at opnå ved simpelthen imaging 3D RI Tomogrammer5. Systematisk og kvantitativt udnytte den målte 3D RI Tomogrammer for celle type klassificering, udnyttet vi en maskine læring algoritme. For nylig, flere værker er blevet rapporteret i hvilke kvantitative fase billeder af celler blev analyseret med forskellige machine learning algoritmer33, herunder påvisning af mikroorganismer34, klassificering af bakteriel slægten35 , 36, hurtig og etiket-fri påvisning af miltbrand sporer37, automatiseret analyse af sædceller38, analyse af kræft celler39,40, og påvisning af makrofag aktivering41.
Denne protokol giver detaljerede trin for at udføre etiket-fri identifikation af lymfocyt typer på den enkelte celle niveau ved hjælp af 3D QPI og machine learning. Dette omfatter: 1) lymfocyt isolation fra mus blod, 2) lymfocyt sortering via flow flowcytometri, 3) 3D QPI, 4) kvantitative funktion udvinding fra 3D RI Tomogrammer og 5) overvåget læring til at identificere lymfocyt typer.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1100px;" width="1099">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:303px;">Mouse</td>
			<td style="width:175px;">Daehan Biolink</td>
			<td style="width:344px;">C57BL/6J mice&#160;</td>
			<td style="width:279px;">gender and age-matched, 6 &#8211; 8 weeks</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Falcon conical centrifuge tube</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td>15 mL</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Phosphate-buffered saline&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>806544-500ML</td>
			<td style="width:279px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Ammonium-chloride-potassium lysing buffer&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1049201</td>
			<td style="width:279px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">RPMI-1640 medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td style="width:279px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10438018</td>
			<td style="width:279px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:303px;">Antibody</td>
			<td style="width:175px;">BD Biosciences</td>
			<td>553140 (RRID:AB_394655)</td>
			<td style="width:279px;">CD16/32 (clone 2.4G2)</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555275 (RRID:AB_395699)</td>
			<td>CD3&#949; (clone 17A2)</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Antibody</td>
			<td>Biolegnd</td>
			<td>100734 (RRID:AB_2075238)</td>
			<td>CD8&#945; (clone 53-6.7)</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557655 (RRID:AB_396770)</td>
			<td>CD19 (clone 1D3)</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557683 (RRID:AB_396793)</td>
			<td>CD45R/B220 (clone RA3-6B2)</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>552878 (RRID:AB_394507)</td>
			<td>NK1.1 (clone PK136)</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Antibody</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-0041-85 (RRID:AB_464893)</td>
			<td>CD4 (clone GK1.5)</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">DAPI&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10236276001</td>
			<td style="width:279px;">4,6-diamidino-2-phenylindole</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Flow cytometry&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Aria II or III&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Imaging chamber</td>
			<td>Tomocube, Inc.</td>
			<td>TomoDish</td>
			<td style="width:279px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Holotomography</td>
			<td>Tomocube, Inc.</td>
			<td>HT-1H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Holotomography imaging software</td>
			<td>Tomocube, Inc.</td>
			<td>TomoStudio</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Image professing software</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>Matlab R2017b</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

label-free identification of lymphocyte subtypes using three-dimensional quantitative phase imaging and machine learning

Vi beskriver her en protokol for etiket-fri identifikation af lymfocyt undertyper ved hjælp af kvantitative fase imaging og machine learning. Identifikation af lymfocyt undertyper er vigtige for studiet af immunologi samt diagnose og behandling af forskellige sygdomme. I øjeblikket, stole ensartede metoder til klassificering af lymfocyt typer på mærkning specifikke Membranproteiner via antigen-antistof reaktioner. Men disse mærkning teknikker medfører de potentielle risici ved at ændre cellulære funktioner. Protokollen beskrevet her overvinder disse udfordringer ved at udnytte iboende optisk kontraster målt ved 3D kvantitative fase billeddiagnostik og en maskine læring algoritme. Måling af 3D brydningsindeks (RI) Tomogrammer af lymfocytter giver kvantitative oplysninger om 3D morfologi og fænotyper af individuelle celler. De biofysiske parametre udvundet fra den målte 3D RI Tomogrammer analyseres derefter kvantitativt med en maskine læring algoritme, aktivering af label-fri identifikation af lymfocyt typer på en enkelt celle niveau. Vi måler den 3D RI Tomogrammer af B, CD4 + T og CD8 + T-lymfocytter og identificeret deres celletyper med over 80% nøjagtighed. I denne protokol beskriver vi detaljerede trin til lymfocyt isolation, 3D kvantitative fase imaging og machine learning til at identificere lymfocyt typer.

Figur 1 viser skematisk processen med den hele protokol. Ved hjælp af den procedure, der præsenteres her, vi isoleret B (n = 149), CD4 + T (n = 95), og CD8 + T (n = 112) lymfocytter. For at få oplysninger om hovedaktivitet og amplitude på forskellige vinkler af belysning, blev flere 2D hologrammer af hver lymfocyt målt ved at ændre vinklen af belysning (fra-60 ° til 60 °). Typisk 50 hologrammer kan bruges til at rekonstruere en 3D RI tomogram, men...

Watch this Scientific Journal Video about Label-Free Identification of Lymphocyte Subtypes Using Three-Dimensional Quantitative Phase Imaging and Machine Learning at JoVE.com

Label-Free Identification of Lymphocyte Subtypes Using Three-Dimensional Quantitative Phase Imaging and Machine Learning

Vi beskriver en protokol for etiket-fri identifikation af lymfocyt undertyper ved hjælp af kvantitative fase billeddiagnostik og en maskine læring algoritme. Målinger af 3D brydningsindeks Tomogrammer af lymfocytter præsenterer 3D morfologiske og biokemiske oplysninger for individuelle celler, som er derefter analyseret med en maskine-læring algoritme for identifikation af celletyper.

Label-gratis identifikation af lymfocyt undertyper ved hjælp af tre-dimensionelle kvantitative fase Imaging og Machine Learning

We describe here a protocol for the label-free identification of lymphocyte subtypes using quantitative phase imaging and machine learning. Identification ...

Denne metode giver et alternativ til konventionel fluorescens mærkning og flow cytometri analyse procedure, som er tidskrævende, dyre, og indebærer risiko for at ændre den cellulære funktion af prøverne. Den største fordel ved denne teknik er den tre-dimensionelle brydningsindeks tomografi og machine learning er etiket-fri og kvantitative metoder, der muliggør en hurtig og præcis lymfocyt identifikation. Konsekvenserne af denne teknik strækker sig mod behandling af blodkræft og autoimmune sygdomme som identifikation af lymfocytter kan være afgørende for sygdomsdiagnose og passende behandling ansøgning.Selv om denne metode kan give indsigt i lymfocyt populationer, det kan også anvendes til analyse af andre enkelt celler af interesse, herunder bakterier. Visuel demonstration af 3D-kvantitativ fasebilledteknologi er afgørende, da den letter en klar instruktion i, hvordan teknikken udføres, og kan give indsigt i dens anvendelser. Begynd med at indsamle hver lymfocyt undersæt ved fluorescens-aktiveret celle sortering.For optimal billeddannelse fortyndes hver celleprøve til en koncentration på 180 celler pr. mikroliter RPMI-medium, og 120 mikroliter af den første fortyndede prøve ind i et billedbehandlingskammer. Efter at have bekræftet en mangel på bobler i kammeret, placere en dråbe destilleret vand på mållinsen af en 3D kvantitativ fase mikroskop, og placere billedbehandling kammer på oversættelsesfasen af mikroskopet. Juster scenen, så prøven flugter med objektivets objektivet, og klik på fokus og overflade i kalibreringsfanen på mikroskopprogrammet for billedbehandlingssoftwaren for at justere henholdsvis objektivets og kondensatorlinsernes aksiale positioner.Klik på Auto-tilstand for at justere mål- og kondensatorlinserne. For at optimere justeringen skal du åbne scanningstilstand og manuelt justere linserne for at justere det digitale mikromørkhedsmønster til midten. Vend derefter tilbage til tilstanden Normal, og juster oversættelsesfasen for at finde en celle i synsfeltet.Juster objektivets aksiale position for at finde brændplanet, indtil prøvegrænsen, der visualiseres på skærmen, næsten er usynlig. Det er vigtigt at perfekt justere cellens fokus for at generere et optimalt 3DRI-tomogram. Hvis billedet ikke tages korrekt, vil 3D-rekonstruktionen blive forringet, hvilket resulterer i et støjende tomogram.Juster oversættelsesfasen for at finde en placering uden en celle, og klik på Kalibrer for at måle flere 2D-hologrammer med forskellige belysningsvinkler. Juster oversættelsesfasen for at finde en celle midt i synsfeltet. Og under fanen Erhvervelse skal du navngive den prøve, der afbildes.Klik på 3D Snapshot for at måle cellens hologrammer ved hjælp af de samme belysningsvinkler som for de 2D-hologrammer, der lige er målt. Når de hentede data vises i panelet Datastyring, skal du højreklikke på dataene og klikke på Proces for at rekonstruere et 3D-brydningsindekstomogram fra 2D-hologrammer ved hjælp af den affrætionstomografialgoritme, der er implementeret i billedbehandlingssoftwaren. Efter billedbehandling skal du højreklikke på dataene i panelet Datastyring og klikke på Åbn for at visualisere dataene.Klik på midten af cellen for at flytte den, og klik på RI Tomogram i panelet Datastyring. Klik på Indlæs og dobbeltklik på lymfocyt under fanen Forudindstillet. xml, som er en foruddefineret overførselsfunktion, der leveres af billedsoftwaren til at visualisere tomogrammet i henhold til 3DRI-distributionerne.Rul musen for at zoome ind, og træk i cellen for at rotere den i en hvilken som helst retning. For kvantitativ morfologisk og biokemisk trækudtrækning skal alle tomografiske data i en enkelt mappe opdeles i en enkelt mappe og opdele celletyperne i de enkelte undermapper i hovedmappen. Åbn derefter den supplerende funktionsudtræksfil i den relevante billedbehandlingssoftware, og rediger linje 14 for at angive den tomogrammappe, som dataene skal udtrækkes fra.Rediger linje 15 for at angive den mappe, som de udpakkede funktionsdata skal gemmes til, og udfør koden. For hvert tomogram i datasættet beregner koden overfladearealet, cellevolumen, sfæriskhed, proteintæthed og tør masse pr. brydningsindekstærskel. For overvåget læring og identifikation bruge den enkle tilfældige opdeling algoritme i MATLAB til tilfældigt at opdele de udtrukne funktion data i separate uddannelse og test sæt mapper.Åbn den supplerende træningsfil, og rediger linje 14 for at angive mappen med træningssæt, linje 16 for at angive mappen til lagring af den uddannede klassificering og linje 17 for at angive et filnavn til klassificeringen. Udfør derefter koden. Ved hjælp af de valgte funktioner i træningssættet, vil koden træne en klassificering med K nærmeste nabo algoritme og gemme klassificeringen i den angivne mappe.Åbn derefter den supplerende testfil tre, og rediger linje 14 til 15 for at udpege den uddannede klassificering, der skal testes, og linje 17 til at udpege det uddannede testsæt. Udfør derefter koden. Klassificeringen identificerer celletyperne af de enkelte lymfocytter i testsættet.Her repræsentative 3D gjort brydningsindeks tomogrammer af B lymfocytter, CD4 positive T lymfocytter, og CD8 positive T lymfocytter med forskellige farveskemaer, tildelt i henhold til brydningsindeksværdier tildelt via billedbehandling software er vist. Ud fra brydningsindeksværdierne kan kvantitative morfologiske og biokemiske egenskaber beregnes. I dette eksperiment var nøjagtigheden af T- og B-lymfocytklassificeringen henholdsvis 93,15 % og 89,81 % for trænings- og prøvetilfældene.CD4 positive og CD8 positive T lymfocytter blev statistisk klassificeret, og nøjagtigheden var 87,41% og 84,38% for uddannelse og testsæt hhv. Endelig var nøjagtigheden af multiklassen, celletypeklassificeringen henholdsvis 80,65% og 75,93% for trænings- og testfaserne. Kvaliteten og antallet af billeder er afgørende for succes af denne teknik.Jo bedre kvaliteten af billedet og jo højere mængden af data, jo bedre nøjagtigheden af identifikationen. Deep learning kan bruges til mere fuldstændigt at analysere de komplekse data i tomogrammer, hvilket i høj grad forbedrer identifikationsydelsen. Endvidere kan fluorescens og 3D kvantitativ fase billeddannelse bruges til at undersøge stien af fysiologiske roller af de identificerede lymfocytter.Efter sin udvikling banede denne teknik vejen for forskere inden for cellebiologi og biomedicin til at udforske specifikke sygdomme af interesse inden for forskellige organismer. Især immunologer kan drage fordel af at bruge denne nye teknologi til at identificere interessepopulationer.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detection of Human Leukocyte Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizing Label-free Biosensor Technology

Påvisning af humant leukocyt antigen Biomarkører i Breast Cancer hjælp Label-fri biosensorteknologi

According to the American Cancer Society, more than 200,000 women will be diagnosed with invasive breast cancer each year and approximately 40,000 will ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

High-throughput kvantitativ real-time RT-PCR assay til bestemmelse Expression Profiler af type I og III Interferon Undertyper

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

påvisning af<em&gt; Trypanosoma brucei</em&gt; Variant overfladeglycoprotein Skift af magnetisk cellesortering og flowcytometri

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) ...

Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

Ikke-invasiv<em&gt; In vivo</em&gt; Fluorescens optisk billeddannelse af inflammatorisk MMP Aktivitet Brug et aktiverbart Fluorescent Imaging Agent

This paper describes a non-invasive method for imaging matrix metalloproteinases (MMP)-activity by an activatable fluorescent probe, via in vivo ...

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo  Cell Trafficking by PET/CT

Muse lymfocyt Mærkning af<sup&gt; 64</sup&gt; Cu-antistofreceptor Målretning for<em&gt; In vivo</em&gt; Cell Trafficking af PET / CT

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

Kvalitativ og kvantitativ analyse af den immun Synapse i det menneskelige System, ved hjælp af Imaging flowcytometri

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analyse af lymfocyt Ekstravasation Ved anvendelse af en<em&gt; In vitro</em&gt; Model af humant blod-hjernebarrieren

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Light-sheet Microscopy for Three-dimensional Visualization of Human Immune Cells

Lys-ark mikroskopi for tre-dimensionelle visualisering af Human immun celler

In vivo, activation, proliferation, and function of immune cells all occur in a three-dimensional (3D) environment, for instance in lymph nodes or ...

Label-free Neutrophil Enrichment from Patient-derived Airway Secretion Using Closed-loop Inertial Microfluidics

Label-fri neutrofile berigelse fra Patient-afledte luftvejene sekretion ved hjælp af lukkede kredsløb Inertial mikrofluidik

Airway secretions contain a large number of immune-related cells, e.g., neutrophils, macrophages, and lymphocytes, which can be used as a major resource ...

Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System

Real-time Imaging og kvantificering af svampe Biofilm udvikling ved hjælp af en 2-faset recirkulerende Flow System

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. ...