Name: label-free identification of lymphocyte subtypes using three-dimensional quantitative phase imaging and machine learning
Uploaded: 2018-11-19T13:00:00
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Ce travail a été soutenu par le KAIST BK21 + Program, Tomocube, Inc. et la National Research Foundation of Korea (2015R1A3A2066550, 2017M3C1A3013923, 2018K 000396). Y. Jo reconnaît le soutien du KAIST présidentielle bourse et bourse de sciences biomédicales de la Fondation Asan.

Soins des animaux et des procédures expérimentales ont été effectuées en vertu de l’approbation de l’animalerie institutionnelle et utilisation Comité du KAIST (KA2010-21, KA2014-01 et KA2015-03). Toutes les expériences dans cette étude ont été effectuées conformément aux principes directeurs adoptés.
1. les lymphocytes isolement du sang de souris
<ol><li>Une fois une souris C57BL/6J est euthanasiée par inhalation de CO2 , insérer une aiguille 26-G dans le coeur...

Nous présentons un protocole qui permet l’identification exempte d’étiquette des types de lymphocytes exploitant imagerie 3D volet quantitatif et apprentissage automatique. Les étapes critiques du présent protocole sont volet quantitatif d’imagerie et de la fonctionnalité de sélection. Pour l’imagerie holographique optimale, la densité des cellules doit être contrôlée comme décrit ci-dessus. La stabilité mécanique des cellules est aussi importante d’obtenir une répartition précise des RI 3D parce...

Les lymphocytes peuvent être classés en différents sous-types dont B, d’assistance (CD4 +) T cytotoxiques (CD8 +) T et T régulateurs des cellules. Chaque type de lymphocyte a un rôle différent dans le système immunitaire adaptatif ; par exemple, les lymphocytes B produisent des anticorps, alors que les lymphocytes T détecter les antigènes spécifiques, d’éliminer les cellules anormales et réglementent les lymphocytes B. Règlement et fonction lymphocytaire est étroitement contrôlée par et associés à diverses maladies dont les cancers1et maladies auto-immunes2infections virales3. Ainsi, l’identification des types de lymphocytes est importante de comprendre leurs rôles physiopathologiques de ces maladies et d’immunothérapie dans les cliniques.
Actuellement, les méthodes de classification des types de lymphocytes s’appuient sur réactions antigène-anticorps en ciblant les protéines de la membrane de surface spécifique ou de marqueurs de surface4. Ciblage des marqueurs de surface est une méthode précise et exacte pour déterminer les types de lymphocytes. Cependant, elle nécessite des réactifs coûteux et procédures fastidieuses. En outre, il comporte des risques de la modification des structures de protéines membranaires et la modification des fonctions cellulaires.
Pour surmonter ces défis, le protocole décrit ici présente l’identification exempte d’étiquette des types de lymphocytes à l’aide de 3D phase quantitative imaging (QPI) et5en apprentissage automatique. Cette méthode permet la classification des types de lymphocytes au niveau cellule unique basée sur l’information morphologique extraite de l’imagerie 3D exempte d’étiquette de lymphocytes individuels. Contrairement aux techniques de microscopie de fluorescence conventionnels, QPI utilise l’indice de réfraction (RI) des distributions (propriétés optiques intrinsèques des tissus et de cellules vivantes) comme contraste optique6,7. Les tomographies RI des lymphocytes individuels représentent des informations phénotypiques spécifiques aux sous-types des lymphocytes. Dans ce cas, pour pouvoir systématiquement utiliser 3D RI tomographies des lymphocytes individuels, un algorithme d’apprentissage supervisé machine a été utilisé.
En utilisant diverses techniques QPI, les 3D tomographies RI des cellules ont été activement utilisées pour l’étude de la physiopathologie de la cellule parce qu’ils fournissent une étiquette libre, quantitative imaging capacité8,9,10, 11,12,13. Aussi, les distributions de RI 3D de cellules individuelles peuvent fournir des informations morphologiques, biochimiques et biomécaniques sur les cellules. 3D RI tomographies ont été précédemment utilisés dans les domaines de l’hématologie14,15,16,17, maladies infectieuses18,19, 20, immunologie21, cell biology22,23, inflammation24, cancer25, neuroscience26,,27,28de la biologie du développement, toxicologie 29et microbiologie12,30,31,32.
Bien que 3D RI tomographies fournissent des détails morphologiques et biochimiques des cellules, la classification des sous-types de lymphocytes est difficile à réaliser par simplement d’imagerie 3D RI tomographies5. Systématiquement et quantitativement exploiter les tomographies de RI 3D mesurées pour la classification de type de cellule, nous avons utilisé un algorithme d’apprentissage machine. Récemment, plusieurs ouvrages ont été signalés, dans quelle phase quantitative des images de cellules ont été analysées avec divers machine learning algorithmes33, y compris la détection des microorganismes34, classification du genre bactérien35 , 36, détection rapide et sans étiquette de l’anthrax spores37, automatisé d’analyse des spermatozoïdes38, analyse des cellules de cancer39,40et la détection de macrophage activation41.
Ce protocole prévoit la procédure détaillée pour effectuer exempte d’étiquette d’identification des types de lymphocytes au niveau des cellules individuelles à l’aide de 3D QPI et apprentissage automatique. Cela inclut : isolement 1) des lymphocytes de sang de souris, lymphocytes 2) Tri par écoulement cytometry, QPI 3) 3D, 4) quantitative trait extraction de 3D RI tomographies et apprentissage 5) supervisé pour identifier les types de lymphocytes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1100px;" width="1099">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:303px;">Mouse</td>
			<td style="width:175px;">Daehan Biolink</td>
			<td style="width:344px;">C57BL/6J mice&#160;</td>
			<td style="width:279px;">gender and age-matched, 6 &#8211; 8 weeks</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Falcon conical centrifuge tube</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td>15 mL</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Phosphate-buffered saline&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>806544-500ML</td>
			<td style="width:279px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Ammonium-chloride-potassium lysing buffer&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1049201</td>
			<td style="width:279px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">RPMI-1640 medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td style="width:279px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10438018</td>
			<td style="width:279px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:303px;">Antibody</td>
			<td style="width:175px;">BD Biosciences</td>
			<td>553140 (RRID:AB_394655)</td>
			<td style="width:279px;">CD16/32 (clone 2.4G2)</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555275 (RRID:AB_395699)</td>
			<td>CD3&#949; (clone 17A2)</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Antibody</td>
			<td>Biolegnd</td>
			<td>100734 (RRID:AB_2075238)</td>
			<td>CD8&#945; (clone 53-6.7)</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557655 (RRID:AB_396770)</td>
			<td>CD19 (clone 1D3)</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557683 (RRID:AB_396793)</td>
			<td>CD45R/B220 (clone RA3-6B2)</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>552878 (RRID:AB_394507)</td>
			<td>NK1.1 (clone PK136)</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Antibody</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-0041-85 (RRID:AB_464893)</td>
			<td>CD4 (clone GK1.5)</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">DAPI&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10236276001</td>
			<td style="width:279px;">4,6-diamidino-2-phenylindole</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Flow cytometry&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Aria II or III&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Imaging chamber</td>
			<td>Tomocube, Inc.</td>
			<td>TomoDish</td>
			<td style="width:279px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Holotomography</td>
			<td>Tomocube, Inc.</td>
			<td>HT-1H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Holotomography imaging software</td>
			<td>Tomocube, Inc.</td>
			<td>TomoStudio</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Image professing software</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>Matlab R2017b</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

label-free identification of lymphocyte subtypes using three-dimensional quantitative phase imaging and machine learning

Nous décrivons ici un protocole d’identification exempte d’étiquette des sous-types de lymphocytes en utilisant l’imagerie quantitative phase et apprentissage automatique. Identification des sous-types de lymphocytes est importante pour l’étude de l’immunologie ainsi que diagnostic et le traitement de diverses maladies. Actuellement, des méthodes standard pour la classification des types de lymphocytes s’appuient sur l’étiquetage des protéines membranaires spécifiques via des réactions antigène-anticorps. Toutefois, ces techniques d’étiquetage portent les risques potentiels d’altérer les fonctions cellulaires. Le protocole décrit ici permet de surmonter ces défis en exploitant les contrastes optiques intrinsèques, mesurés par imagerie 3D volet quantitatif et un algorithme d’apprentissage automatique. Mesure des tomographies 3D indice de réfraction (RI) des lymphocytes fournit des informations quantitatives sur la morphologie 3D et les phénotypes des cellules individuelles. Les paramètres biophysiques extraites des tomographies de RI 3D mesurées sont ensuite quantitativement analysés avec un algorithme d’apprentissage machine permettant une identification des types de lymphocytes au niveau unicellulaire exempte d’étiquette. Nous mesurons les tomographies RI 3D des lymphocytes B, T CD4 + et CD8 + T et identifié leurs types de cellules avec plus de 80 % exactitude. Dans ce protocole, nous décrivons la procédure détaillée pour l’isolement de lymphocytes, l’imagerie 3D volet quantitatif et apprentissage automatique pour l’identification des types de lymphocytes.

Figure 1 montre le processus schématique de l’ensemble du protocole. À l’aide de la procédure présentée ici, nous avons isolé B (n = 149), lymphocytes T CD4 + (n = 95) et T CD8 + (n = 112) les lymphocytes. Pour obtenir des informations de phase et d’amplitude à différents angles d’éclairage, plusieurs hologrammes 2D de chaque lymphocyte ont été mesurés en changeant l’angle d’éclairage (à partir de-60 ° c à 60 °). En règle gé...

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Label-Free Identification of Lymphocyte Subtypes Using Three-Dimensional Quantitative Phase Imaging and Machine Learning

Les auteurs décrivent un protocole d’identification des sous-types de lymphocytes en utilisant l’imagerie quantitative phase et un algorithme d’apprentissage machine exempte d’étiquette. Mesures de l’indice de réfraction 3D tomographies des lymphocytes présentent 3D informations morphologiques et biochimiques des cellules individuelles, qui sont ensuite analysées grâce à un algorithme d’apprentissage automatique pour l’identification des types de cellules.

Machine Learning et sans étiquette d’Identification des sous-types de lymphocytes à l’aide de l’imagerie tridimensionnelle Phase Quantitative

We describe here a protocol for the label-free identification of lymphocyte subtypes using quantitative phase imaging and machine learning. Identification ...

Cette méthode offre une alternative à l’étiquetage conventionnel de fluorescence et à la procédure d’analyse de cytométrie de flux, qui prennent beaucoup de temps, sont coûteuses et encourent le risque de modifier la fonction cellulaire des échantillons. Le principal avantage de cette technique est la tomographie à indice réfractif tridimensionnel et l’apprentissage automatique sont des méthodes quantitatives et sans étiquette qui permettent une identification rapide et précise des lymphocytes. Les implications de cette technique s’étendent vers la thérapie des cancers du sang et des maladies auto-immunes car l’identification des lymphocytes peut être cruciale pour le diagnostic de la maladie et l’application appropriée de traitement.Bien que cette méthode puisse fournir un aperçu des populations de lymphocytes, elle peut également être appliquée à l’analyse d’autres cellules individuelles d’intérêt, y compris les bactéries. La démonstration visuelle de la technologie d’imagerie quantitative de phase 3D est essentielle, car elle facilite une instruction claire sur la façon d’exécuter la technique et peut fournir un aperçu de ses applications. Commencez par recueillir chaque sous-ensemble de lymphocytes par tri cellulaire activé par fluorescence.Pour une imagerie optimale, diluer chaque échantillon cellulaire à une concentration de 180 cellules par microlitre de milieu RPMI, et injecter lentement 120 microlitres du premier échantillon dilué dans une chambre d’imagerie. Après avoir confirmé l’absence de bulles dans la chambre, placez une goutte d’eau distillée sur la lentille objective d’un microscope de phase quantitative 3D et placez la chambre d’imagerie sur l’étape de traduction du microscope. Ajustez l’étape de sorte que l’échantillon s’aligne avec la lentille objective, et cliquez sur la mise au point et la surface dans l’onglet d’étalonnage de la perspective microscope du logiciel d’imagerie pour ajuster les positions axiaales des lentilles objectif et condenseur, respectivement.Cliquez sur le mode Automatique pour aligner les lentilles objectif et condenseur. Pour optimiser l’alignement, ouvrez le mode numérisation et ajustez manuellement les lentilles pour aligner le modèle numérique de périphérique micromirror au centre. Ensuite, revenez en mode Normal et ajustez l’étape de traduction pour localiser une cellule dans le champ de vision.Ajustez la position axial de la lentille objective pour trouver le plan focal jusqu’à ce que la limite de l’échantillon visualisée dans l’écran soit presque invisible. Il est important d’ajuster parfaitement l’orientation de la cellule pour générer une tomographie 3DRI optimale. Si l’image n’est pas prise correctement, la reconstruction 3D sera altérée, ce qui entraîne une tomogramme bruyante.Ajustez l’étape de traduction pour trouver un emplacement sans cellule et cliquez sur Calibrate pour mesurer plusieurs hologrammes 2D avec différents angles d’éclairage. Ajustez l’étape de traduction pour localiser une cellule au centre du champ de vision. Et sous l’onglet Acquisition, nommez l’échantillon en cours d’image.Cliquez sur instantané 3D pour mesurer les hologrammes de la cellule en utilisant les mêmes angles d’éclairage que pour les hologrammes 2D juste mesurés. Lorsque les données acquises apparaissent dans le panneau de gestion des données, cliquez à droite sur les données et cliquez sur Processus pour reconstruire un tomogramme d’index réfractif 3D à partir des hologrammes 2D à l’aide de l’algorithme de tomographie de défraction mis en œuvre dans le logiciel d’imagerie. Après l’imagerie, dans le panneau gestion des données, cliquez à droite sur les données et cliquez sur Ouvrir pour visualiser les données.Cliquez sur le centre de la cellule pour le repositionner et cliquez sur RI Tomogram sur le panneau Data Manager. Sur l’onglet Preset cliquez sur Charge et double clic lymphocyte. xml, qui est une fonction de transfert prédéfinie fournie par le logiciel d’imagerie pour visualiser la tomographie selon les distributions 3DRI.Faites défiler la souris pour zoomer et faites glisser la cellule pour la faire pivoter dans n’importe quelle direction. Pour l’extraction quantitative des caractéristiques morphologiques et biochimiques, placez toutes les données tomographiques dans un seul dossier et divisez les types de cellules dans les sous-composants individuels dans le dossier principal. Ensuite, ouvrez le fichier d’extraction de fonctionnalités supplémentaires dans le logiciel d’imagerie approprié et modifiez la ligne 14 pour désigner le dossier de tomographie à partir duquel les données doivent être extraites.Modifier la ligne 15 pour désigner le dossier auquel les données de fonctionnalité extraites doivent être enregistrées et exécuter le code. Pour chaque tomogramme de l’ensemble de données, le code calculera la surface, le volume cellulaire, la sphérité, la densité des protéines et la masse sèche par seuil d’index réfractif. Pour l’apprentissage supervisé et l’identification, utilisez l’algorithme simple de fractionnement aléatoire dans MATLAB pour diviser aléatoirement les données de fonctionnalités extraites en dossiers distincts de formation et d’ensemble de tests.Ouvrez le fichier de formation supplémentaire et modifiez la ligne 14 pour désigner le dossier d’ensemble de formation, la ligne 16 pour désigner le dossier pour enregistrer le classificateur formé et la ligne 17 pour définir un nom de fichier pour le classificateur. Ensuite, exécutez le code. En utilisant les fonctionnalités sélectionnées de l’ensemble de formation, le code formera un classificateur avec l’algorithme voisin le plus proche K et enregistrera le classificateur dans le dossier désigné.Ensuite, ouvrez le fichier de test supplémentaire trois, et modifiez les lignes 14 à 15 pour désigner le classificateur formé à tester et la ligne 17 pour désigner l’ensemble de test formé. Ensuite, exécutez le code. Le classificateur identifiera les types de cellules des lymphocytes individuels dans l’ensemble d’essai.Ici, des tomogrammes d’index réfractifs représentatifs rendus en 3D des lymphocytes B, des lymphocytes T positifs CD4 et des lymphocytes T positifs CD8 avec différents schémas de couleurs, attribués en fonction des valeurs d’index réfractives attribuées via le logiciel d’imagerie sont affichés. À partir des valeurs de l’indice réfractaire, les caractéristiques quantitatives morphologiques et biochimiques peuvent être calculées. Dans cette expérience, l’exactitude de la classification des lymphocytes T et B était de 93,15 % et de 89,81 % respectivement pour les cas de formation et de test.Les lymphocytes T positifs CD4 et CD8 ont été classés statistiquement, et l’exactitude était de 87,41 % et 84,38 % respectivement pour les ensembles de formation et de test. Enfin, la précision du classificateur de type cellulaire multiclasse était de 80,65 % et de 75,93 % respectivement pour les étapes de formation et de test. La qualité et le nombre d’images sont essentiels au succès de cette technique.Plus la qualité de l’image est bonne et plus le volume de données est élevé, meilleure est la précision de l’identification. L’apprentissage profond peut être utilisé pour analyser plus complètement les données complexes des tomogrammes, améliorant fortement les performances d’identification. De plus, la fluorescence et l’imagerie quantitative de phase 3D peuvent être utilisées pour étudier la trajectoire des rôles physiologiques des lymphocytes identifiés.Après son développement, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs dans les domaines de la biologie cellulaire et de la biomédecine pour explorer des maladies spécifiques d’intérêt dans différents organismes. En effet, les immunologistes en particulier, peuvent bénéficier de l’utilisation de cette nouvelle technologie pour identifier la population d’intérêt.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Détection de l&#39;antigène leucocytaire humain biomarqueurs du cancer du sein Utilisant la technologie des biocapteurs Sans étiquette

According to the American Cancer Society, more than 200,000 women will be diagnosed with invasive breast cancer each year and approximately 40,000 will ...

Recherche

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