Name: label-free identification of lymphocyte subtypes using three-dimensional quantitative phase imaging and machine learning
Uploaded: 2018-11-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Label-Free Identification of Lymphocyte Subtypes Using Three-Dimensional Quantitative Phase Imaging and Machine Learning at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av den arbeider nå som forsker BK21 + Program, Tomocube, Inc., og den nasjonale Research Foundation Korea (2015R1A3A2066550, 2017M3C1A3013923, 2018K 000396). Y. Jo anerkjenner støtte fra KAIST presidentvalget fellesskap og Asan Foundation biomedisinsk vitenskap stipend.

Dyr omsorg og eksperimentelle prosedyrer ble utført under godkjenning av institusjonelle dyr omsorg og bruk komiteen av KAIST (KA2010-21, KA2014-01 og KA2015-03). Alle eksperimenter i denne studien ble utført av godkjente retningslinjer.
1. lymfocytt isolert fra mus blod
<ol><li>Når en C57BL/6J mus er euthanized via CO2 innånding, en 26-G nål inn musen hjertet og samle 0,3 mL blod. Direkte sette blod inn i et rør med 100 U/mL heparin-oppløsningen fortynnet med 1 mL av fosfa...

Vi presenterer en protokoll som etikett-fri identifikasjon av lymfocytt utnytte 3D kvantitative fase bildebehandling og maskinlæring. Avgjørende skritt i denne protokollen er kvantitative fase bildebehandling og funksjonen utvalg. For optimal holografiske avbilding, bør tetthet av celler kontrolleres som beskrevet ovenfor. Mekanisk stabilitet av cellene er også viktig å få en nøyaktig 3D RI distribusjon fordi flytende eller vibrasjonsmedisin mobilnettet bevegelser vil forstyrre hologrammet målinger på belysning ...

Lymfocytter kan klassifiseres i ulike undergrupper inkludert B, hjelper (CD4 +) T, cytotoksiske (CD8 +) T og regulatoriske T celler. Hver lymfocytt har en annen rolle i det adaptive immunsystemet; for eksempel, produserer B-lymfocytter antistoffer, mens T-lymfocytter gjenkjenner bestemte antigener, fjerne unormale celler og regulere B-lymfocytter. Lymfocytt funksjon og regulering er tett kontrollert av og relatert til ulike sykdommer, inkludert kreft1, autoimmune sykdommer2og virusinfeksjoner3. Identifikasjon av lymfocytter er derfor viktig å forstå sine patofysiologiske roller i slike sykdommer og for immunterapi i klinikker.
Foreløpig avhengig metoder for klassifisering lymfocytt antigen-antistoff reaksjoner av målretting bestemte overflaten membran proteiner eller overflate markører4. Målretting overflate markører er en presis og nøyaktig metode for å bestemme lymfocytt typer. Men krever det dyre reagenser og tidkrevende prosedyrer. Videre bærer risikoen for endring av membran proteinstrukturer og endring av cellulære funksjoner.
For å overvinne disse utfordringene, introduserer protokollen beskrevet her etikett-fri identifikasjon av lymfocytt 3D kvantitative fase imaging (QPI) og maskinen lære5. Denne metoden gjør det mulig for klassifisering av lymfocytt typer på en enkeltcelle nivå basert på morfologiske informasjon fra etikett-gratis 3D-bildebehandling av personlige lymfocytter. I motsetning til konvensjonelle fluorescens mikroskopi teknikker benytter QPI brytningsindeks (RI) distribusjoner (innebygde optiske egenskaper av levende celler og vev) optisk kontrast6,7. RI tomograms av personlige lymfocytter representerer fenotypiske informasjon spesifikk for subtyper av lymfocytter. I dette tilfellet å systematisk bruke 3D RI tomograms av personlige lymfocytter, ble en veiledet maskin læring algoritmen benyttet.
Bruke ulike QPI teknikker, 3D RI tomograms celler er aktivt brukt for studiet av cellen patofysiologi fordi de gir en etikett-fri, kvantitativ imaging evne8,9,10, 11,12,13. 3D RI distribusjonen av enkeltceller kan også gi morfologiske biokjemiske og biomekaniske informasjon om celler. 3D RI tomograms har tidligere blitt utnyttet innen hematologi14,15,16,17, infeksjonssykdommer18,19, 20, immunologi21, cell biologi22,23, betennelse24, kreft25, nevrovitenskap26,27, utviklingsbiologi28, toksikologi 29og mikrobiologi12,30,31,32.
Selv om 3D RI tomograms gir detaljert morfologiske og biokjemiske informasjon av celler, er klassifiseringen av lymfocytt subtyper vanskelig å oppnå av bare imaging 3D RI tomograms5. Systematisk og kvantitativt utnytte den målte 3D RI tomograms for celle typeklassifisering, benyttet vi en maskin læring algoritme. Nylig har flere blitt rapportert i som kvantitative fase bilder av celler ble analysert med ulike maskin læring algoritmer33, inkludert påvisning av mikroorganismer34, klassifisering av bakterie-slekt35 , 36, rask og etikett-fri påvisning av anthrax sporer37, automatisk analyse av sædceller38, analyse av kreft celler39,40, og oppdagelsen av macrophage aktivisering41.
Denne protokollen gir detaljert fremgangsmåte for å utføre etikett-fri identifikasjon av lymfocytt typer enkeltcelle nivået med 3D QPI og maskinlæring. Dette inkluderer: 1) lymfocytt isolert fra mus blod, 2) lymfocytt sortering via flyt cytometri, 3) 3D QPI, 4) kvantitative egenskapsuttrekking fra 3D RI tomograms og 5) tilsyn læring for å identifisere lymfocytt typer.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1100px;" width="1099">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:303px;">Mouse</td>
			<td style="width:175px;">Daehan Biolink</td>
			<td style="width:344px;">C57BL/6J mice&#160;</td>
			<td style="width:279px;">gender and age-matched, 6 &#8211; 8 weeks</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Falcon conical centrifuge tube</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td>15 mL</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Phosphate-buffered saline&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>806544-500ML</td>
			<td style="width:279px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Ammonium-chloride-potassium lysing buffer&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1049201</td>
			<td style="width:279px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">RPMI-1640 medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td style="width:279px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10438018</td>
			<td style="width:279px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:303px;">Antibody</td>
			<td style="width:175px;">BD Biosciences</td>
			<td>553140 (RRID:AB_394655)</td>
			<td style="width:279px;">CD16/32 (clone 2.4G2)</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555275 (RRID:AB_395699)</td>
			<td>CD3&#949; (clone 17A2)</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Antibody</td>
			<td>Biolegnd</td>
			<td>100734 (RRID:AB_2075238)</td>
			<td>CD8&#945; (clone 53-6.7)</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557655 (RRID:AB_396770)</td>
			<td>CD19 (clone 1D3)</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557683 (RRID:AB_396793)</td>
			<td>CD45R/B220 (clone RA3-6B2)</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>552878 (RRID:AB_394507)</td>
			<td>NK1.1 (clone PK136)</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Antibody</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-0041-85 (RRID:AB_464893)</td>
			<td>CD4 (clone GK1.5)</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">DAPI&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10236276001</td>
			<td style="width:279px;">4,6-diamidino-2-phenylindole</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Flow cytometry&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Aria II or III&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Imaging chamber</td>
			<td>Tomocube, Inc.</td>
			<td>TomoDish</td>
			<td style="width:279px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Holotomography</td>
			<td>Tomocube, Inc.</td>
			<td>HT-1H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Holotomography imaging software</td>
			<td>Tomocube, Inc.</td>
			<td>TomoStudio</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Image professing software</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>Matlab R2017b</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

label-free identification of lymphocyte subtypes using three-dimensional quantitative phase imaging and machine learning

Her beskriver vi en protokoll for etikett-fri identifikasjon av lymfocytt subtyper kvantitative fase bildebehandling og maskinlæring. Identifikasjon av lymfocytt subtyper er viktig for studiet av immunologi samt diagnose og behandling av ulike sykdommer. Foreløpig avhengige standard metoder for klassifisering lymfocytt merking bestemt membran proteiner via antigen-antistoff reaksjoner. Men bærer disse merking teknikker den potensielle risikoen ved å endre cellulære funksjoner. Protokollen beskrevet her overvinner disse utfordringene ved å utnytte innebygd optisk kontraster målt ved 3D kvantitative fase bildebehandling og en maskinlæring algoritme. Måling av 3D brytningsindeks (RI) tomograms av lymfocytter gir kvantitativ informasjon om 3D morfologi og fenotyper individuelle celler. De Biofysiske parameterne Hentet fra den målte 3D RI tomograms analyseres deretter kvantitativt med en maskin læring algoritme, aktivere etikett-fri identifikasjon av lymfocytt på en enkeltcelle nivå. Vi måle i 3D RI tomograms av B, CD4 + T og CD8 + T-lymfocytter og identifisert deres celletyper med over 80% nøyaktighet. I denne protokollen beskriver vi detaljerte trinn for lymfocytt isolasjon, 3D kvantitative fase bildebehandling og maskinlæring identifisere lymfocytt typer.

Figur 1 viser skjematisk prosessen med hele protokollen. Ved hjelp av prosedyren som presenteres her, vi isolerte B (n = 149), CD4 + T (n = 95), og CD8 + T (n = 112) lymfocytter. For å få fase og amplitude informasjon i forskjellige vinkler av belysning, ble flere 2D hologrammer av hver lymfocytter målt ved å endre vinkelen på belysning (fra-60 ° til 60 °). Vanligvis 50 hologrammer kan brukes til å rekonstruere en 3D RI tomogram, men antall 2D hol...

Watch this Scientific Journal Video about Label-Free Identification of Lymphocyte Subtypes Using Three-Dimensional Quantitative Phase Imaging and Machine Learning at JoVE.com

Label-Free Identification of Lymphocyte Subtypes Using Three-Dimensional Quantitative Phase Imaging and Machine Learning

Vi beskriver en protokoll for etikett-fri identifikasjon av lymfocytt subtyper kvantitative fase bildebehandling og en maskinlæring algoritme. Målinger av 3D brytningsindeks tomograms av lymfocytter presenterer 3D morfologiske og biokjemiske informasjon for enkeltceller som analyseres deretter med en apparat-innlæring algoritme for identifikasjon av celletyper.

Etikett-fri identifikasjon av lymfocytt subtyper med tredimensjonale kvantitative fase Imaging og maskin læring

We describe here a protocol for the label-free identification of lymphocyte subtypes using quantitative phase imaging and machine learning. Identification ...

Denne metoden gir et alternativ til konvensjonell fluorescens merking og flyt cytometri analyse prosedyre, som er tidkrevende, kostbart, og pådrar seg risikoen for å endre cellulær funksjon av prøvene. Den største fordelen med denne teknikken er den tredimensjonale brytningsindekstomografien og maskinlæring er etikettfrie og kvantitative metoder som muliggjør en rask og nøyaktig lymfocyttidentifikasjon. Implikasjonene av denne teknikken strekker seg mot behandling av blodkreft og autoimmune sykdommer som identifisering av lymfocytter kan være avgjørende for sykdomsdiagnose og passende behandlingssøknad.Selv om denne metoden kan gi innsikt i lymfocyttpopulasjoner, kan den også brukes på analyse av andre enkeltceller av interesse, inkludert bakterier. Visuell demonstrasjon av 3D kvantitativ fasebildeteknologi er kritisk, da det letter en klar instruksjon om hvordan du utfører teknikken og kan gi innsikt i applikasjonene. Begynn med å samle hver lymfocytt undergruppe ved fluorescens-aktivert cellesortering.For optimal avbildning, fortynne hver celleprøve til en konsentrasjon på 180 celler per mikroliter av RPMI medium, og sakte injisere 120 mikroliter av den første fortynnede prøven i et bildekammer. Etter å ha bekreftet mangel på bobler i kammeret, legg en dråpe destillert vann på objektivet til et 3D kvantitativt fasemikroskop, og plasser bildekammeret på oversettelsesstadiet av mikroskopet. Juster scenen slik at prøven justeres etter objektivobjektivet, og klikk fokus og overflate i kalibreringsfanen i mikroskopperspektivet til bildeprogramvaren for å justere aksiale posisjoner av henholdsvis objektiv- og kondensatorlinsene.Klikk Automatisk modus for å justere objektiv- og kondensatorobjektivene. Hvis du vil optimalisere justeringen, åpner du Skannemodus og justerer linsene manuelt for å justere det digitale mikromirrorenhetsmønsteret til midten. Gå deretter tilbake til Normal-modus og juster oversettelsesstadiet for å finne en celle i synsfeltet.Juster aksialposisjonen til objektivobjektivet for å finne fokalplanet til prøvegrensen visualisert på skjermen er nesten usynlig. Det er viktig å perfekt justere fokus på cellen for å generere en optimal 3DRI tomogram. Hvis bildet ikke tas riktig, vil 3D-rekonstruksjon bli svekket, noe som resulterer i et støyende tomogram.Juster oversettelsesstadiet for å finne en plassering uten en celle, og klikk Kalibrer for å måle flere 2D-hologrammer med varierende belysningsvinkler. Juster oversettelsesstadiet for å finne en celle midt i visningsfeltet. Og under Anskaffelse-fanen gir du eksempelet som bildes.Klikk 3D Snapshot for å måle hologrammene til cellen ved hjelp av de samme belysningsvinklene som for 2D-hologrammene som nettopp er målt. Når de anskaffede dataene vises i Data Management-panelet, høyreklikker du dataene og klikker på Behandle for å rekonstruere et 3D-brytningsindeks tomogram fra 2D-hologrammer ved hjelp av defraksjonstomografialgoritmen implementert i bildeprogramvaren. Etter bildebehandling høyreklikker du på dataene i Databehandling-panelet og klikker Åpne for å visualisere dataene.Klikk midten av cellen for å flytte den og klikke RI Tomogram i Databehandling-panelet. Klikk Last inn i kategorien Forhåndsinnstilling, og dobbeltklikk lymfocytt. xml, som er en forhåndsdefinert overføringsfunksjon levert av bildeprogramvaren for å visualisere tomogrammet i henhold til 3DRI-distribusjonene.Rull musen for å zoome inn og dra cellen for å rotere den i hvilken som helst retning. For kvantitativ morfologiske og biokjemiske funksjonen utvinning plassere alle de tomografiske dataene i en enkelt mappe og dele celletypene i individuelle undermapper i hovedmappen. Deretter åpner du den supplerende funksjonsutvinningsfilen i riktig bildebehandlingsprogramvare og redigerer linje 14 for å angi tomogrammappen som dataene skal pakkes ut fra.Rediger linje 15 for å angi mappen som de utpakkede funksjonsdataene skal lagres til, og kjøre koden. For hvert tomogram i datasettet beregner koden overflatearealet, mobilvolumet, sfærisiteten, proteintettheten og tørrmasse per brytningsindeksterskel. For overvåket læring og identifikasjon bruk den enkle tilfeldige splittingalgoritmen i MATLAB for å tilfeldig dele de utpakkede funksjonsdataene i separate opplærings- og testsettmapper.Åpne den supplerende opplæringsfilen og rediger linje 14 for å angi treningssettmappen, linje 16 for å angi mappen for lagring av den opplærte klassifikatoren og linje 17 for å angi et filnavn for klassifikatoren. Deretter utfører du koden. Ved hjelp av de valgte funksjonene i treningssettet vil koden trene en klassifikator med K nærmeste naboalgoritme og lagre klassifikatoren i den angitte mappen.Deretter åpner du den supplerende testfilen tre, og redigerer linje 14 til 15 for å utpeke den trente klassifikatoren som skal testes og linje 17 for å angi det trente testsettet. Deretter utfører du koden. Klassifikatoren vil identifisere celletypene til de enkelte lymfocytter i testsettet.Her gjenga representative 3D refraktive indekstokogrammer av B-lymfocytter, CD4-positive T-lymfocytter og CD8-positive T-lymfocytter med forskjellige fargevalg, tildelt i henhold til de brytningsindeksverdiene som er tildelt via bildeprogramvaren, vises. Fra brytningsindeksverdiene kan kvantitative morfologiske og biokjemiske egenskaper beregnes. I dette eksperimentet var nøyaktigheten av T- og B-lymfocyttklassifiseringen henholdsvis 93,15 % og 89,81 % for trenings- og testtilfellene.CD4-positive og CD8-positive T-lymfocytter ble statistisk klassifisert, og nøyaktigheten var henholdsvis 87,41 % og 84,38 % for trenings- og testsettene. Til slutt var nøyaktigheten av multiklasse, celletype klassifikator henholdsvis 80,65% og 75,93%for trenings- og teststadiene. Kvaliteten og antall bilder er avgjørende for suksessen til denne teknikken.Jo bedre kvaliteten på bildet og jo høyere datavolum, desto bedre er nøyaktigheten av identifikasjonen. Dyp læring kan brukes til å mer fullstendig analysere de komplekse dataene til tomograms, noe som forbedrer identifikasjonsytelsen. Videre kan fluorescens og 3D kvantitativ faseavbildning brukes til å undersøke banen til fysiologiske roller i de identifiserte lymfocytter.Etter utviklingen banet denne teknikken vei for forskere innen cellebiologi og biomedisin for å utforske spesifikke sykdommer av interesse i forskjellige organismer. Faktisk kan immunologer spesielt ha nytte av å bruke denne nye teknologien for å identifisere populasjon av interesse.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detection of Human Leukocyte Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizing Label-free Biosensor Technology

Påvisning av humant leukocytt antigen Biomarkører i Breast Cancer Utnytte Etikett-free Biosensor Technology

According to the American Cancer Society, more than 200,000 women will be diagnosed with invasive breast cancer each year and approximately 40,000 will ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Høy gjennomstrømming Kvantitativ Real-time RT-PCR-analyse for fastsetting Expression Profiler av type I og III Interferon Subtyper

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

påvisning av<em&gt; Trypanosoma brucei</em&gt; Variant Surface glykoprotein Bytte av Magnetic Aktivert Cell Sorting og flowcytometri

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) ...

Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

Non-invasiv<em&gt; In vivo</em&gt; Fluorescens Optisk Imaging av Inflammatorisk MMP Aktivitet ved hjelp av en aktiverbar fluorescerende Imaging Agent

This paper describes a non-invasive method for imaging matrix metalloproteinases (MMP)-activity by an activatable fluorescent probe, via in vivo ...

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo  Cell Trafficking by PET/CT

Murine Lymfocytter Merking av<sup&gt; 64</sup&gt; Cu-antistoff Reseptor for målretting<em&gt; In Vivo</em&gt; Celletrafikken av PET / CT

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

Kvalitativ og kvantitativ analyse av immun Synapse i menneskelige systemet ved hjelp av Imaging flowcytometri

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analyse av lymfocytt-ekstravasasjon ved hjelp av en<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell av det menneskelige blod-hjernebarrieren

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Light-sheet Microscopy for Three-dimensional Visualization of Human Immune Cells

Lys arks mikroskopi for tredimensjonale visualisering av menneskelig immunceller

In vivo, activation, proliferation, and function of immune cells all occur in a three-dimensional (3D) environment, for instance in lymph nodes or ...

Label-free Neutrophil Enrichment from Patient-derived Airway Secretion Using Closed-loop Inertial Microfluidics

Etikett-fri nøytrofile berikelse fra pasient-avledede Airway sekresjon bruker lukket treghet Microfluidics

Airway secretions contain a large number of immune-related cells, e.g., neutrophils, macrophages, and lymphocytes, which can be used as a major resource ...

Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System

Sanntid bildebehandling og kvantifisering av sopp Biofilm utvikling bruker en tofaset resirkulerende med System

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. ...