Name: label-free identification of lymphocyte subtypes using three-dimensional quantitative phase imaging and machine learning
Uploaded: 2018-11-19T13:00:00
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Este trabalho foi apoiado pela KAIST BK21 + programa, Tomocube, Inc. e da National Research Foundation da Coreia (2015R1A3A2066550, 2017M3C1A3013923, 2018K 000396). Y. Jo reconhece apoio do KAIST presidencial Fellowship e bolsa de ciência biomédica Asan Foundation.

Cuidados com animais e procedimentos experimentais foram realizados sob a aprovação dos cuidados institucionais do Animal e uso Comitê de KAIST (KA2010-21, KA2014-01 e KA2015-03). Todas as experiências neste estudo foram realizadas em conformidade com as diretrizes aprovadas.
1. linfócitos isolado do sangue de rato
<ol><li>Uma vez um rato C57BL/6J é eutanásia por inalação de CO2 , introduza uma agulha 26-G o coração de rato e recolher 0,3 mL de sangue. Diretamente coloc...

Apresentamos um protocolo que permite a identificação de rótulo livre dos tipos de linfócitos, explorando a imagem 3D fase quantitativa e aprendizado de máquina. Passos críticos do presente protocolo são fase quantitativa de imagem e o recurso seleção. Para a ideal de imagem holográfica, a densidade de células deve ser controlada como descrito acima. Estabilidade mecânica das células também é importante para obter uma distribuição de RI 3D precisa porque movimentos celulares flutuantes ou vibracionais pe...

Os linfócitos podem ser classificados em vários subtipos, incluindo B, auxiliar T (CD4 +), citotóxicos (CD8 +) T e T reguladora células. Cada tipo de linfócito tem um papel diferente no sistema imune adaptativo; por exemplo, os linfócitos B produzem anticorpos, Considerando que os linfócitos T detectam antígenos específicos, eliminam as células anormais e regulam os linfócitos B. Regulamento e função de linfócitos é firmemente controlado pelo e relacionados a várias doenças, incluindo infecções virais3, cancros1e doenças auto-imunes2. Assim, a identificação dos tipos de linfócitos é importante entender seus papéis fisiopatológicos em tais doenças e para imunoterapia em clínicas.
Atualmente, métodos de classificação de tipos de linfócitos dependem de reações antígeno-anticorpo alvejando proteínas específicas da membrana de superfície ou marcadores de superfície4. Direcionamento de marcadores de superfície é um método preciso e exato para determinar os tipos de linfócitos. No entanto, requer reagentes caros e procedimentos demorados. Além disso, ele carrega os riscos da modificação das estruturas de proteína de membrana e a alteração das funções celulares.
Para superar esses desafios, o protocolo descrito aqui introduz a identificação de rótulo livre de linfócitos tipos usando 3D fase quantitativa de imagem (QPI) e máquina de aprendizagem5. Esse método permite a classificação dos tipos de linfócitos em um nível de célula única com base nas informações morfológicas extraídas de imagem em 3D livre de rótulo de linfócitos individuais. Ao contrário de técnicas de microscopia de fluorescência convencional, QPI utiliza o índice de refração (RI) distribuições (intrínsecas propriedades óticas de células vivas e tecidos) como contraste óptico6,7. Os tomograms RI de linfócitos individuais representam informação fenotípica específica para os subtipos de linfócitos. Neste caso, para utilizar sistemicamente 3D tomograms RI de linfócitos individuais, foi utilizado um algoritmo de aprendizado de máquina supervisionado.
Usando várias técnicas QPI, os 3D tomograms RI de células têm sido ativamente utilizados para o estudo da fisiopatologia da célula porque eles fornecem um rótulo livre, quantitativa de imagem capacidade8,9,10, 11,12,13. Além disso, as distribuições de RI 3D de células individuais podem fornecer informações morfológicas, bioquímicas e biomecânicas sobre células. 3D do RI tomograms tenha sido previamente utilizados nos campos da hematologia14,15,16,17, doenças infecciosas18,19, 20, imunologia21célula biologia22,23, inflamação24, câncer25, neurociência26,27, biologia do desenvolvimento28, toxicologia 29e Microbiologia12,30,31,32.
Embora 3D RI tomograms fornecem informações detalhadas morfológicas e bioquímicas das células, a classificação dos subtipos de linfócito é difícil de alcançar por simplesmente imagem 3D RI tomograms5. Explorarem sistematicamente e quantitativamente a medida tomograms RI 3D para a classificação do tipo de célula, utilizamos um algoritmo de aprendizado de máquina. Recentemente, diversos trabalhos têm sido relatados em qual fase quantitativa, analisaram-se imagens de células com várias máquina aprendendo algoritmos33, incluindo a detecção de microorganismos34, classificação de género bacteriana35 , 36, detecção rápida e livre de rótulo de esporos de antraz37, automatizado de análise de espermatozoides38, análise de células de câncer39,40e detecção de ativação de macrófagos41.
Este protocolo fornece etapas detalhadas para executar livre de etiqueta de identificação de tipos de linfócitos no nível da célula individual usando 3D QPI e aprendizado de máquina. Isto inclui: isolamento 1) linfócitos do sangue de rato, 2) linfócito classificação através de fluxo cytometry, QPI 3) 3D, 4) quantitativos extração do 3D do RI tomograms e aprendizado 5) supervisionado para a identificação de tipos de linfócitos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1100px;" width="1099">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:303px;">Mouse</td>
			<td style="width:175px;">Daehan Biolink</td>
			<td style="width:344px;">C57BL/6J mice&#160;</td>
			<td style="width:279px;">gender and age-matched, 6 &#8211; 8 weeks</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Falcon conical centrifuge tube</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td>15 mL</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Phosphate-buffered saline&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>806544-500ML</td>
			<td style="width:279px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Ammonium-chloride-potassium lysing buffer&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1049201</td>
			<td style="width:279px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">RPMI-1640 medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td style="width:279px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10438018</td>
			<td style="width:279px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:303px;">Antibody</td>
			<td style="width:175px;">BD Biosciences</td>
			<td>553140 (RRID:AB_394655)</td>
			<td style="width:279px;">CD16/32 (clone 2.4G2)</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555275 (RRID:AB_395699)</td>
			<td>CD3&#949; (clone 17A2)</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Antibody</td>
			<td>Biolegnd</td>
			<td>100734 (RRID:AB_2075238)</td>
			<td>CD8&#945; (clone 53-6.7)</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557655 (RRID:AB_396770)</td>
			<td>CD19 (clone 1D3)</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557683 (RRID:AB_396793)</td>
			<td>CD45R/B220 (clone RA3-6B2)</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>552878 (RRID:AB_394507)</td>
			<td>NK1.1 (clone PK136)</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Antibody</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-0041-85 (RRID:AB_464893)</td>
			<td>CD4 (clone GK1.5)</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">DAPI&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10236276001</td>
			<td style="width:279px;">4,6-diamidino-2-phenylindole</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Flow cytometry&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Aria II or III&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Imaging chamber</td>
			<td>Tomocube, Inc.</td>
			<td>TomoDish</td>
			<td style="width:279px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Holotomography</td>
			<td>Tomocube, Inc.</td>
			<td>HT-1H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Holotomography imaging software</td>
			<td>Tomocube, Inc.</td>
			<td>TomoStudio</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Image professing software</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>Matlab R2017b</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

label-free identification of lymphocyte subtypes using three-dimensional quantitative phase imaging and machine learning

Descrevemos aqui um protocolo para a identificação do rótulo-livre dos subtipos de linfócito usando a imagem latente da fase quantitativa e aprendizado de máquina. Identificação dos subtipos de linfócito é importante para o estudo da imunologia, bem como diagnóstico e tratamento de várias doenças. Atualmente, métodos padrão para a classificação dos tipos de linfócitos dependem de rotulagem de proteínas de membrana específicas via reações antígeno-anticorpo. No entanto, essas técnicas de rotulagem carregam os riscos potenciais de alterar funções celulares. O protocolo descrito aqui supera esses desafios, explorando contrastes ópticos intrínsecos, medidos pela imagem latente 3D fase quantitativa e um algoritmo de aprendizado de máquina. Medição de tomograms 3D Índice de refração (RI) de linfócitos fornece informações quantitativas sobre morfologia 3D e fenótipos das células individuais. Os parâmetros biofísicos extraídos o tomograms 3D medido do RI são então analisados quantitativamente com um algoritmo de aprendizagem de máquina, permitindo a identificação de rótulo livre de tipos de linfócitos em um nível de célula única. Medimos o 3D tomograms RI de linfócitos B, T CD4 + e CD8 + T e identificados os tipos de células com mais de 80% exatidão. Este protocolo, descreveremos as etapas detalhadas para isolamento de linfócitos, imagem 3D fase quantitativa e aprendizado de máquina para identificar tipos de linfócitos.

Figura 1 mostra o processo esquemático do protocolo inteiro. Usando o procedimento aqui apresentado, isolamos B (n = 149), CD4 + T (n = 95) e CD8 + T (n = 112) linfócitos. Para obter informações de fase e amplitude em diferentes ângulos de iluminação, múltiplos hologramas 2D de cada linfócito foram medidos, alterando o ângulo de iluminação (de-60 ° a 60 °). Normalmente, 50 hologramas podem ser usados para reconstruir uma tomografia 3D do RI,...

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Label-Free Identification of Lymphocyte Subtypes Using Three-Dimensional Quantitative Phase Imaging and Machine Learning

Descreveremos um protocolo para a identificação do rótulo-livre dos subtipos de linfócito usando a imagem latente da fase quantitativa e um algoritmo de aprendizado de máquina. Medições de índice de refração 3D tomograms de linfócitos apresentam 3D informações morfológicas e bioquímicas para células individuais, que é, então, analisadas com um algoritmo de aprendizado de máquina para identificação dos tipos de células.

Livre etiqueta de identificação dos subtipos de linfócito utilizando imagens tridimensionais fase quantitativa e aprendizagem de máquina

We describe here a protocol for the label-free identification of lymphocyte subtypes using quantitative phase imaging and machine learning. Identification ...

Este método fornece uma alternativa ao procedimento convencional de rotulagem de fluorescência e análise de citometria de fluxo, que são demorados, caros e incorrem no risco de alterar a função celular das amostras. A principal vantagem dessa técnica é que a tomografia tridimensional do índice de refração e o aprendizado de máquina são métodos livres de rótulos e quantitativos que permitem uma identificação rápida e precisa do linfócito. As implicações dessa técnica se estendem à terapia de cânceres de sangue e doenças autoimunes, pois a identificação de linfócitos pode ser crucial para o diagnóstico da doença e a aplicação adequada do tratamento.Embora este método possa fornecer insights sobre populações de linfócitos, ele também pode ser aplicado à análise de outras células únicas de interesse, incluindo bactérias. A demonstração visual da tecnologia de imagem de fase quantitativa 3D é fundamental, pois facilita uma instrução clara de como executar a técnica e pode fornecer insights sobre suas aplicações. Comece coletando cada subconjunto de linfócitos por triagem celular ativada por fluorescência.Para uma imagem ideal, diluir cada amostra celular para uma concentração de 180 células por microliter de meio RPMI, e injetar lentamente 120 microlitres da primeira amostra diluída em uma câmara de imagem. Depois de confirmar a falta de bolhas dentro da câmara, coloque uma gota de água destilada na lente objetiva de um microscópio de fase quantitativa 3D, e coloque a câmara de imagem no estágio de tradução do microscópio. Ajuste o estágio para que a amostra se alinhe com a lente objetiva, e clique no foco e na superfície na guia de calibração da perspectiva do microscópio do software de imagem para ajustar as posições axiais das lentes objetivas e condensadoras, respectivamente.Clique no modo Automático para alinhar as lentes objetivas e condensadoras. Para otimizar o alinhamento, abra o modo de digitalização e ajuste manualmente as lentes para alinhar o padrão do dispositivo micromor digital ao centro. Em seguida, retorne ao modo Normal e ajuste o estágio de tradução para localizar uma célula no campo de visão.Ajuste a posição axial da lente objetiva para encontrar o plano focal até que o limite da amostra visualizado na tela seja quase invisível. É importante ajustar perfeitamente o foco da célula para gerar um tomograma ótimo de 3DRI. Se a imagem não for tomada corretamente, a reconstrução 3D será prejudicada, resultando em um tomograma barulhento.Ajuste o estágio de tradução para encontrar um local sem uma célula e clique em Calibrar para medir vários hologramas 2D com diferentes ângulos de iluminação. Ajuste o estágio de tradução para localizar uma célula no centro do campo de visão. E sob a guia Aquisição, nomeie a amostra sendo imageda.Clique em Snapshot 3D para medir os hologramas da célula usando os mesmos ângulos de iluminação que os hologramas 2D apenas medidos. Quando os dados adquiridos aparecerem no painel Gerenciamento de Dados, clique com o botão direito do mouse nos dados e clique em Processo para reconstruir um tomograma de índice de refração 3D a partir dos hologramas 2D usando o algoritmo de tomografia defraction implementado no software de imagem. Após a imagem, no painel Gerenciamento de Dados, clique com o botão direito do mouse nos dados e clique em Abrir para visualizar os dados.Clique no centro da célula para reposicioná-lo e clique em RI Tomogram no painel Data Manager. Na guia Predefinição clique em Carregar e clique duas vezes no linfócito. xml, que é uma função de transferência predefinida fornecida pelo software de imagem para visualizar o tomograma de acordo com as distribuições 3DRI.Role o mouse para ampliar e arraste a célula para rodá-lo em qualquer direção. Para extração quantitativa de recursos morfológicos e bioquímicos, coloque todos os dados tomográficos em uma única pasta e divida os tipos de células dentro de subpatas individuais na pasta principal. Em seguida, abra o arquivo de extração de recursos suplementares no software de imagem apropriado e edite a linha 14 para designar a pasta de tomograma da qual os dados devem ser extraídos.Editar a linha 15 para designar a pasta à qual os dados do recurso extraídos devem ser salvos e executar o código. Para cada tomograma no conjunto de dados, o código calculará a área de superfície, volume celular, esfericidade, densidade proteica e massa seca por limiar de índice refrativo. Para aprendizado e identificação supervisionados, use o algoritmo de divisão aleatória simples no MATLAB para dividir aleatoriamente os dados do recurso extraído em pastas separadas de treinamento e conjunto de testes.Abra o arquivo de treinamento suplementar e edite a linha 14 para designar a pasta do conjunto de treinamento, a linha 16 para designar a pasta para salvar o classificador treinado e a linha 17 para definir um nome de arquivo para o classificador. Então execute o código. Usando as características selecionadas do conjunto de treinamento, o código treinará um classificador com o algoritmo vizinho mais próximo K e salvará o classificador na pasta designada.Em seguida, abra o arquivo de teste suplementar três e edite as linhas 14 a 15 para designar o classificador treinado a ser testado e a linha 17 para designar o conjunto de testes treinado. Então execute o código. O classificador identificará os tipos celulares dos linfócitos individuais no conjunto de testes.Aqui representativo 3D renderizado indicador de índice refrativo de linfócitos B, linfócitos T positivos CD4 e linfócitos T positivos CD8 com diferentes esquemas de cores, alocados de acordo com os valores de índice de refração atribuídos através do software de imagem são mostrados. A partir do índice refrativo podem ser calculados os valores quantitativos morfológicos e bioquímicos. Neste experimento, a precisão da classificação de linfócitos T e B foi de 93,15% e 89,81% para os casos de treinamento e teste, respectivamente.Os linfócitos T positivos CD4 e CD8 foram classificados estatisticamente, e a precisão foi de 87,41% e 84,38% para os conjuntos de treinamento e teste, respectivamente. Por fim, a precisão do classificador multiclasse, tipo celular, foi de 80,65% e 75,93% para as etapas de treinamento e teste, respectivamente. A qualidade e o número de imagens são essenciais para o sucesso dessa técnica.Quanto melhor a qualidade da imagem e maior o volume de dados, maior a precisão da identificação. O aprendizado profundo pode ser usado para analisar mais completamente os dados complexos dos tomogramas, melhorando o desempenho de identificação. Além disso, fluorescência e imagem de fase quantitativa 3D podem ser usados para investigar o caminho dos papéis fisiológicos dos linfócitos identificados.Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores das áreas de biologia celular e biomedicina explorarem doenças específicas de interesse dentro de diferentes organismos. De fato, os imunologistas, em particular, podem se beneficiar do uso dessa nova tecnologia para identificar população de interesse.

Research

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