Name: label-free identification of lymphocyte subtypes using three-dimensional quantitative phase imaging and machine learning
Uploaded: 2018-11-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Label-Free Identification of Lymphocyte Subtypes Using Three-Dimensional Quantitative Phase Imaging and Machine Learning at JoVE.com

Detta arbete stöds av den KAIST BK21 + Program, Tomocube, Inc., och National Research Foundation Korea (2015R1A3A2066550, 2017M3C1A3013923, 2018K 000396). Y. Jo erkänner stöd från KAIST Presidential gemenskap och Asan Foundation biomedicinsk vetenskap stipendium.

Djurvård och experimentella rutiner utfördes under godkännande av institutionella djur vård och användning kommittén för KAIST (KA2010-21 KA2014-01 och KA2015-03). Alla experimenten i denna studie genomfördes i enlighet med de godkända riktlinjerna.
1. lymfocyter isolering från mus blod
<ol><li>När en C57BL/6J mus är euthanized via CO2 inandning, infoga en 26-G nål in i musen hjärtat och samla 0,3 mL blod. Direkt sätta blod i en tub med 100 U/mL heparin lösning sp?...

Vi presenterar ett protokoll som möjliggör etikett-fri identifiering av lymfocyter typer att utnyttja 3D kvantitativa fas imaging och maskininlärning. Kritiska steg i detta protokoll är kvantitativa fas imaging och funktionen urval. För den optimala holographic imaging kontrolleras tätheten av celler enligt ovan. Mekanisk stabilitet av cellerna är också viktigt att få en exakt 3D RI distribution eftersom flytande eller vibrerande cellulära motioner kommer att störa hologram mätningar vid belysning vinkel för...

Lymfocyter kan delas in i olika subtyper inklusive B, helper (CD4 +) T, cytotoxiska (CD8 +) T och regulatoriska T celler. Varje typ av lymfocyter har en annan roll i det adaptiva immunsystemet; till exempel producerar B-lymfocyter antikroppar, medan T-lymfocyter upptäcka specifika antigener, eliminera onormala celler och reglera B-lymfocyter. Lymfocyter funktion och reglering är tätt kontrolleras av och relaterade till olika sjukdomar inklusive cancer1, autoimmuna sjukdomar2och virusinfektioner3. Identifiering av lymfocyter typer är därför viktigt att förstå deras patofysiologiska roller i sådana sjukdomar och för immunterapi i kliniker.
För närvarande beroende metoder för klassificering av lymfocyter typer antigen-antikroppsreaktioner genom att rikta specifika ytan membranproteiner eller yta markörer4. Inriktning yta markörer är en exakt och noggrann metod för att bestämma lymfocyter typer. Det kräver dock dyra reagenser och tidskrävande förfaranden. Dessutom medför det risker för ändring av protein membranstrukturer och förändringen av cellulära funktioner.
För att övervinna dessa utmaningar, införs i protokollet som beskrivs här etikett-fri identifiering av lymfocyter typer som använder 3D kvantitativa fas imaging (QPI) och machine learning-5. Denna metod möjliggör klassificering av lymfocyter typer på en enskild cell nivå baserat på morfologiska informationsutdrag från etikett-gratis 3D imaging av enskilda lymfocyter. Till skillnad från konventionella fluorescence mikroskopi tekniker använder QPI brytningsindex (RI) distributioner (inneboende optiska egenskaper av levande celler och vävnader) som optiska kontrast6,7. De RI tomograms av enskilda lymfocyter utgör fenotypiska information specifik för subtyper av lymfocyter. I det här fallet för att systemiskt utnyttja 3D RI tomograms av enskilda lymfocyter, utnyttjades en övervakad dator lärande algoritm.
Använda olika QPI tekniker, de 3D RI tomograms celler har aktivt använts för studier av cell patofysiologi eftersom de ger en etikett-fri, kvantitativa imaging kapacitet8,9,10, 11,12,13. Också, de 3D RI-distributionerna av enskilda celler kan ge morfologiska, biokemiska och biomekaniska information om celler. 3D RI tomograms använts tidigare inom hematologi14,15,16,17, infektionssjukdomar18,19, 20, immunologi21, cellbiologi22,23, inflammation24, cancer25, neurovetenskap26,27, utvecklingsbiologi28, toxikologi 29och mikrobiologi12,30,31,32.
Även om 3D RI tomograms ger detaljerad information om morfologiska och biokemiska celler, är klassificering av lymfocyter subtyper svårt att uppnå genom att helt enkelt imaging 3D RI tomograms5. Kvantitativt och systematiskt utnyttja den uppmätta 3D RI tomograms för klassificeringen av cellen, utnyttjade vi en maskin lärande algoritm. Nyligen, flera verk har rapporterats i vilka kvantitativa fasen analyserades bilder av celler med olika maskininlärning algoritmer33, inklusive upptäckt av mikroorganismer34, klassificering av bakteriesläkte35 , 36, etikett-gratis och snabb påvisande av mjältbrand sporer37, automatiserad analys av spermacellerna38, analys av cancer celler39,40, och upptäckt av makrofag aktiveringen41.
Detta protokoll ger detaljerade steg för att utföra etikett-fri identifiering av lymfocyter typer på enskild cellnivå använder 3D QPI och maskininlärning. Detta omfattar: (1) lymfocyter isolering från mus blod, 2) lymfocyter sortering via flöde flödescytometri, 3) 3D QPI, 4) kvantitativa funktionen utvinning från 3D RI tomograms och 5) övervakade lärande för att identifiera lymfocyter typer.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1100px;" width="1099">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:303px;">Mouse</td>
			<td style="width:175px;">Daehan Biolink</td>
			<td style="width:344px;">C57BL/6J mice&#160;</td>
			<td style="width:279px;">gender and age-matched, 6 &#8211; 8 weeks</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Falcon conical centrifuge tube</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td>15 mL</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Phosphate-buffered saline&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>806544-500ML</td>
			<td style="width:279px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Ammonium-chloride-potassium lysing buffer&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1049201</td>
			<td style="width:279px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">RPMI-1640 medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td style="width:279px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10438018</td>
			<td style="width:279px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:303px;">Antibody</td>
			<td style="width:175px;">BD Biosciences</td>
			<td>553140 (RRID:AB_394655)</td>
			<td style="width:279px;">CD16/32 (clone 2.4G2)</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555275 (RRID:AB_395699)</td>
			<td>CD3&#949; (clone 17A2)</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Antibody</td>
			<td>Biolegnd</td>
			<td>100734 (RRID:AB_2075238)</td>
			<td>CD8&#945; (clone 53-6.7)</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557655 (RRID:AB_396770)</td>
			<td>CD19 (clone 1D3)</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557683 (RRID:AB_396793)</td>
			<td>CD45R/B220 (clone RA3-6B2)</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>552878 (RRID:AB_394507)</td>
			<td>NK1.1 (clone PK136)</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Antibody</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-0041-85 (RRID:AB_464893)</td>
			<td>CD4 (clone GK1.5)</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">DAPI&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10236276001</td>
			<td style="width:279px;">4,6-diamidino-2-phenylindole</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Flow cytometry&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Aria II or III&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Imaging chamber</td>
			<td>Tomocube, Inc.</td>
			<td>TomoDish</td>
			<td style="width:279px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Holotomography</td>
			<td>Tomocube, Inc.</td>
			<td>HT-1H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Holotomography imaging software</td>
			<td>Tomocube, Inc.</td>
			<td>TomoStudio</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Image professing software</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>Matlab R2017b</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

label-free identification of lymphocyte subtypes using three-dimensional quantitative phase imaging and machine learning

Här beskriver vi ett protokoll för etikett-fri identifiering av lymfocyter subtyper använder kvantitativa fas imaging och maskininlärning. Identifiering av lymfocyter subtyper är viktigt för studien av immunologi samt diagnos och behandling av olika sjukdomar. För närvarande, lita standardiserade metoder för klassificering av lymfocyter typer på märkning specifika membranproteiner via antigen-antikroppsreaktioner. Dock utföra dessa märkning tekniker de potentiella riskerna med att ändra cellulära funktioner. Protokollet beskrivs här övervinner dessa utmaningar genom att utnyttja inneboende optiska kontraster mätt med 3D kvantitativa fas imaging och en algoritm för maskininlärning. Mätning av 3D brytningsindex (RI) tomograms av lymfocyter ger kvantitativ information om 3D morfologi och fenotyper av enskilda celler. De biofysiska parametrar extraheras från den uppmätta 3D RI tomograms analyseras sedan kvantitativt med en maskin lärande algoritm, möjliggör etikett-fri identifiering av lymfocyter typer på en enskild cell-nivå. Vi mäter den 3D RI tomograms av B, T CD4 + och CD8 + T-lymfocyter och identifierat deras celltyper med över 80% noggrannhet. I detta protokoll beskriver vi de detaljerade anvisningarna för lymfocyter isolering, 3D kvantitativa fas imaging och maskininlärning för att identifiera lymfocyter typer.

Figur 1 visar schematiskt processen i hela protokollet. Använda proceduren presenteras här, vi isolerat B (n = 149), CD4 + T (n = 95), och CD8 + T (n = 112) lymfocyter. För att få informationen om huvudaktivitet och amplitud i olika vinklar av belysning, mättes flera 2D hologram av varje lymfocyter genom att ändra vinkeln på belysningen (från-60 ° till 60 °). Vanligtvis, 50 hologram kan användas för att rekonstruera en 3D RI-tomogram, men anta...

Watch this Scientific Journal Video about Label-Free Identification of Lymphocyte Subtypes Using Three-Dimensional Quantitative Phase Imaging and Machine Learning at JoVE.com

Label-Free Identification of Lymphocyte Subtypes Using Three-Dimensional Quantitative Phase Imaging and Machine Learning

Vi beskriver ett protokoll för etikett-fri identifiering av lymfocyter subtyper använder kvantitativa fas imaging och en algoritm för maskininlärning. Mätningar av 3D brytningsindex tomograms av lymfocyter presentera 3D morfologiska och biokemiska information för enskilda celler, som sedan analyseras med en maskininlärning algoritmen för identifiering av celltyper.

Etikett-fri identifiering av lymfocyter undertyper med hjälp av tredimensionell kvantitativ fas Imaging och Machine Learning

We describe here a protocol for the label-free identification of lymphocyte subtypes using quantitative phase imaging and machine learning. Identification ...

Denna metod ger ett alternativ till konventionell fluorescens märkning och flöde cytometry analysförfarande, som är tidskrävande, kostsamt, och ådra sig risken att ändra cellulär funktion av proverna. Den största fördelen med denna teknik är den tredimensionella brytningsindex tomografi och maskininlärning är etikettfria och kvantitativa metoder som möjliggör en snabb och exakt lymfocytidentifiering. Konsekvenserna av denna teknik sträcker sig mot terapi av blodcancer och autoimmuna sjukdomar som identifiering av lymfocyter kan vara avgörande för sjukdomsdiagnos och lämplig behandling ansökan.Även om denna metod kan ge insikt i lymfocytpopulationer, det kan också tillämpas på analys av andra enskilda celler av intresse, inklusive bakterier. Visuell demonstration av 3D kvantitativ fas bildteknik är kritisk, eftersom det underlättar en tydlig instruktion om hur man utför tekniken och kan ge insikt i dess tillämpningar. Börja med att samla in varje lymfocytundergrupp genom fluorescens-aktiverad cellsortering.För optimal avbildning, späd varje cellprov till en koncentration på 180 celler per mikroliter av RPMI-medium, och injicera långsamt 120 mikroliter av det första utspädda provet i en bildkammare. Efter att ha bekräftat en brist på bubblor i kammaren, placera en droppe destillerat vatten på den objektiva linsen av en 3D kvantitativ fas mikroskop, och placera bildbehandlingskammaren på översättningsstadiet av mikroskopet. Justera scenen så att provet ligger i linje med objektivet objektivet, och klicka på fokus och yta i kalibreringsfliken i avbildningsprogrammets mikroskopperspektiv för att justera objektiv- respektive kondensorlinsens axiella positioner.Klicka på Auto-läge om du vill justera objektiv- och kondensorlinserna. Optimera inriktningen genom att öppna Skanningsläge och justera objektiven manuellt så att det digitala mikromikrodenhetens mönster riktas mot mitten. Sedan återgår du till normalläge och justerar översättningsstadiet för att leta upp en cell i synfältet.Justera objektivets axiella position för att hitta fokalplanet tills den provgräns som visualiseras på skärmen nästan är osynlig. Det är viktigt att perfekt justera cellens fokus för att generera ett optimalt 3DRI-tomogram. Om bilden inte tas på rätt sätt kommer 3D-rekonstruktionen att försämras, vilket resulterar i ett bullrigt tomogram.Justera översättningsstadiet för att hitta en plats utan cell och klicka på Kalibrera för att mäta flera 2D-hologram med varierande belysningsvinklar. Justera översättningsstadiet för att lokalisera en cell i mitten av synfältet. Och under fliken Förvärv, namnge provet som avbildas.Klicka på 3D Snapshot för att mäta cellens hologram med samma belysningsvinklar som för de 2D-hologram som just uppmätts. När de förvärvade uppgifterna visas i datahanteringspanelen högerklickar du på data och klickar på Process för att rekonstruera ett 3D-brytningsindextomogram från 2D-hologrammen med hjälp av algoritmen för defraktionstomografi som implementeras i bildhanteringsprogrammet. Efter bildtagning, i datahanteringspanelen, högerklicka på data och klicka på Öppna för att visualisera data.Klicka på cellens mitt om du vill placera om den och klicka på RI Tomogram på datahanterarens panel. Klicka på Förinställningsfliken På fliken Förinställning Ladda och dubbelklicka på lymfocyt. xml, som är en fördefinierad överföringsfunktion som tillhandahålls av bildhanteringsprogrammet för att visualisera tomogrammet enligt 3DRI-distributionerna.Rulla musen för att zooma in och dra cellen för att rotera den i valfri riktning. För kvantitativa morfologiska och biokemiska funktionen extraktion placera alla de tomographic data i en enda mapp och dela celltyperna inom enskilda undermappar i huvudmappen. Därefter öppnar du den kompletterande funktionen extrahering filen i lämplig bildbehandling programvara och redigera linje 14 för att utse tomogram mapp från vilken data ska extraheras.Redigera linje 15 för att utse den mapp som de extraherade funktionsdata ska sparas till och exekvera koden. För varje tomogram i datauppsättningen koden kommer att beräkna ytan, cellulär volym, sfäricitet, proteintäthet, och torr massa per brytningsindex tröskel. För övervakad inlärning och identifiering använd den enkla slumpmässiga delningsalgoritmen i MATLAB för att slumpmässigt dela upp de extraherade funktionsdata i separata utbildning och testuppsättningsmappar.Öppna den kompletterande träningsfilen och redigera linje 14 för att utse mappen för träningsuppsättning, linje 16 för att utse mappen för att spara den tränade klassificeraren och linje 17 för att ange ett filnamn för klassificeraren. Kör sedan koden. Med hjälp av de valda funktionerna i träningsuppsättningen kommer koden att träna en klassificerare med K närmaste grannalgoritm och spara klassificeraren i den angivna mappen.Öppna därefter den kompletterande testningsfilen tre, och redigera raderna 14 till 15 för att utse den utbildade klassificeraren som ska testas och linje 17 för att utse den tränade testuppsättningen. Kör sedan koden. Klassificeraren kommer att identifiera celltyperna av de enskilda lymfocyterna i testuppsättningen.Här representativa 3D utförda brytningsindex tomograms av B-lymfocyter, CD4 positiva T-lymfocyter, och CD8 positiva T-lymfocyter med olika färgscheman, allokeras enligt brytningsindex värden tilldelas via bildåtergivning programvara visas. Från brytningsindexet värden kvantitativa morfologiska och biokemiska funktioner kan beräknas. I detta experiment noggrannheten i den T och B lymfocyt klassificering var 93,15%och 89,81%för utbildningen och testfall respektive.CD4 positiva och CD8 positiva T lymfocyter var statistiskt klassificeras, och noggrannheten var 87,41%och 84,38%för utbildningen och testuppsättningar respektive. Slutligen var noggrannheten hos multiklassen, celltypklassificeraren 80,65 %respektive 75,93 % för tränings- respektive teststadium. Kvaliteten och antalet bilder är avgörande för framgången för denna teknik.Ju bättre bildkvalitet och ju högre datavolym desto bättre är identifieringens noggrannhet. Djupinlärning kan användas för att mer fullständigt analysera de komplexa datan av tomogramsna som högt förhöjer identifieringsprestationen. Vidare kan fluorescens och 3D kvantitativ fas imaging användas för att undersöka vägen för fysiologiska roller av de identifierade lymfocyter.Efter dess utveckling banade denna teknik vägen för forskare inom områdena cellbiologi och biomedicin att utforska specifika sjukdomar av intresse inom olika organismer. I synnerhet immunologer kan faktiskt dra nytta av att använda denna nya teknik för att identifiera population av intresse.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detection of Human Leukocyte Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizing Label-free Biosensor Technology

Upptäckt av HLA-antigen Biomarkers i bröstcancer Använda Label fria Biosensor Teknik

According to the American Cancer Society, more than 200,000 women will be diagnosed with invasive breast cancer each year and approximately 40,000 will ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Hög-throughput kvantitativ realtids-RT-PCR-analys för bestämning av uttryck Profiler av typ I och III Interferon Subtyper

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

detektering av<em&gt; Trypanosoma brucei</em&gt; Variant ytglykoprotein Omkoppling av magnetkamera Aktivt cellsortering och flödescytometri

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) ...

Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

Icke-invasiv<em&gt; In vivo</em&gt; Fluorescence optisk avbildning av inflammatorisk MMP aktivitet Använda en aktiverbar Fluorescent Imaging Agent

This paper describes a non-invasive method for imaging matrix metalloproteinases (MMP)-activity by an activatable fluorescent probe, via in vivo ...

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo  Cell Trafficking by PET/CT

Murina Lymfocyt Märkning av<sup&gt; 64</sup&gt; Cu-antikroppreceptor Targeting för<em&gt; In Vivo</em&gt; Cell Trafficking med PET / CT

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

Kvalitativ och kvantitativ analys av immun synapsen i det mänskliga systemet använder Imaging flödescytometri

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analys av Lymphocyte Extravasation Med användning av ett<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell av det mänskliga blod-hjärnbarriären

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Light-sheet Microscopy for Three-dimensional Visualization of Human Immune Cells

Ljus-ark mikroskopi för tredimensionell visualisering av mänskliga immunceller

In vivo, activation, proliferation, and function of immune cells all occur in a three-dimensional (3D) environment, for instance in lymph nodes or ...

Label-free Neutrophil Enrichment from Patient-derived Airway Secretion Using Closed-loop Inertial Microfluidics

Etikett-fri neutrofila berikning från patientderiverade luftvägarna sekretion använder slutna tröghetsbaserad mikrofluidik

Airway secretions contain a large number of immune-related cells, e.g., neutrophils, macrophages, and lymphocytes, which can be used as a major resource ...

Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System

Realtid avbildning och kvantifiering av svamp Biofilm utveckling med hjälp av en tvåfas recirkulerande flödessystem

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. ...