Name: a cell-based assay to investigate non-muscle myosin ii contractility via the folded-gastrulation signaling pathway in drosophila s2r+ cells
Uploaded: 2018-08-19T15:00:00
Duration: 7 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Cell-based Assay to Investigate Non-muscle Myosin II Contractility via the Folded-gastrulation Signaling Pathway in Drosophila S2R+ Cells at JoVE.com

Les auteurs tiennent à remercier les membres du laboratoire Rogers et le laboratoire Applewhite, Greta Glover et les étudiants en cours de biologie cellulaire au Reed College printemps 2018, qui ont contribué à l’élaboration du présent protocole. En outre, les auteurs aimeraient remercier les membres du laboratoire du Ritz pour soigneusement la lecture et l’édition de ce manuscrit. Recherche rapporté dans cette publication a été financée par la National Science Foundation sous attribution numéro 716964 D.A.A. et A.R. et le département de biologie de Reed College.

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Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Nous présentons ici un protocole détaillé pour un dosage de contractilité basés sur les cellules à l’aide d’une lignée de cellules de culture de tissus de drosophile (cellules S2R +), qui subit une constriction II la myosine non musculaire en réponse à brouillard de signalisation. Ce dosage est utile pour étudier la voie de brouillard, ainsi que les mécanismes qui régulent la contractilité de la myosine non musculaire II.
Culture cellulaire considérations : Les conditions en vertu de laquelle S2R + cellules sont maintenues est essentielle pour obtenir des données fiables de ce test. Lorsque vous envisagez d’effectuer l’essai de la contractilité, il est préférable de maintenir les cellules S2R + en bouclier et a chanté M3 support d’insectes. Tandis que les cellules S2R + peuvent se développer dans d’autres milieux de culture cellulaire insectes (p. ex., milieu insecte SF900 ou de Schneider), ils perdent souvent leur réactivité au brouillard. S2R + les cellules qui possèdent un nombre élevé de passage, généralement plus de 20-25 passages, commencent à perdre de la sensibilité à l’ARNi. Il est préférable d’utiliser des cellules de rapide-passage pour toutes les expériences. Un autre aspect important à des expériences de déplétion Arni est de choisir des contrôles appropriés. Contrôles négatifs communs incluent dsRNA ciblage EGFP ou pBlueScript, ni de qui ont une homologie avec le génome de la mouche. Ciblage des protéines dans la voie de brouillard (Rho, Rok, etc.), qui, quand épuisée, empêcher l’activation de la contractilité de la myosine non musculaire, sont également des contrôles utiles. S2:Fog-cellules de Myc peuvent être maintenus dans un milieu de culture cellulaire alternatif comme SF900 additionné de 100 unités/mL de pénicilline, 100 µg/mL de streptomycine, et 0,25 amphotéricine B. Notez que BF n’est pas requis lorsque la mise en culture des cellules en SF900. La densité cellulaire est également une composante essentielle pour tous les aspects des cellules de culture de tissus de drosophile . Contrairement aux cellules de culture de tissus chez les mammifères, Drosophila-cellules dérivées des vitroplants prospèrent mieux sous des densités plus élevées de cellule (densités non inférieur à 5 x 105 cellules/mL). Toutefois, lorsque vous effectuez ce test, il est essentiel que les cellules ne sont pas plaqués sur la con-A-enduit de vaisselle à fond de verre au-dessus de 80 % à confluence, car la quantification des contractuels contre les cellules sans contrat deviendra extrêmement fastidieuse.
Aspects critiques et approches de l’analyse de contractilité cellulaire : La production de brouillard, le ligand qui déclenche la contractilité de la myosine non musculaire II, est un élément clé de ce test. Le brouillard gène code pour une protéine de 730 acides aminés avec un poids moléculaire prévu de ~ 78 kDa26. Hydropathy analyse a révélé un tronçon de 12 résidus hydrophobes à aminée du brouillard qui pourrait fonctionner comme une séquence de signaux de sécrétion. En outre, la séquence codante contient également plusieurs sites à potentiel glycosylation N - et O-liés, plus loin, ce qui suggère que le brouillard est une protéine sécrétée26. À l’appui de cela, brouillard a été localisée à des vésicules de sécrétion dans les cellules épidermiques présomptives subissant la constriction apicale16. Expression de brouillard-Myc a été induite par addition de sulfate de cuivre au milieu, et anticorps anti brouillard ou Myc a reconnu une protéine de 150 kD de milieu de culture récoltée des cultures induits mais pas d’induite par les médias de cellules S2 manque la construction de brouillard-Myc. Ce poids moléculaire était plus élevé que le poids moléculaire de prévu 80-kD de brouillard et suggère que le mécanisme sécrétoire des cellules S2 peut glycosylate la protéine avant l’exocytose. En raison de la variabilité dans la purification de brouillard, il est conseillé d’utiliser le même lot des médias conditionné par brouillard pour toutes les expériences. Constituant des lots importants de médias de brouillard-Myc concentré aidera à maintenir la cohérence de l’ensemble des séries d’expériences.
La réussite de ce test dépend aussi de la confiance identifier les cellules qui ont subi une constriction. Alors que ces cellules peuvent être observés par microscopie de fluorescence, de coloration pour l’actine ou non musculaires myosine II, le moyen le plus fiable pour identifier et quantifier ces cellules est par contraste de phase ou de microscopie DIC. Chefs d’accusation précis peuvent être réalisés à l’aide de 20 X - 40 X grossissement sur la plupart des microscopes légers. Bien que le protocole écrit utilise ici des plats à fond de verre, le test peut également être effectué à l’aide de lamelles de 1,5 verre standard couché avec con A. L’ajout du brouillard peut être fait en 35 mm de culture de tissus sur une lamelle couvre-objet ajouté parafilm, afin de limiter la quantité de brouillard utilisé pour chaque dosage. La qualité de la fixation est un élément essentiel de l’analyse, car les cellules fixes mal peuvent provoquer de faux positifs. À l’aide de la solution de fixation fraîches et en s’assurant que les cellules jamais sec une fois fixées conduira à des résultats plus fiables. Enfin, il est important de compter un grand nombre de cellules. En général, seulement 30 % - 50 % de non traitées, ou le contrôle les cellules traitées Arni se contractent après la perfusion de brouillard. Cependant, il y a un niveau basal de la constriction qui survient chez les cellules S2R +, donc un grand nombre de cellules est nécessaire pour s’assurer que tout changement dans la fraction de ces cellules est due à des traitements. En outre, l’appauvrissement de certaines protéines impliquées dans la régulation de la contractilité de la myosine non musculaire II peut conduire à hyper-contractilité, même en l’absence de brouillard. Les données présentées ici sont de plus de 3 600 cellules comptées dans trois traitements successifs d’Arni à l’aide du même lot de médias conditionné par brouillard.
Applications de l’essai de contractilité cellulaire : Ce test de contractilité, lorsqu’il est couplé avec RNAi de méthodes, de dépistage offre un système puissant pour étudier la signalisation cellulaire, morphogenèse et contractilité cellulaire. Auparavant, il a été utilisé pour identifier un des deux brouillard corécepteurs21. Un écran ciblé de 138 récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) est épuisé par ARNi dans les cellules S2R +, et sa capacité à répondre au brouillard a été dosée comme décrit dans le protocole présenté ici. De la 138 RCPG, un seul gène non définie auparavant, maintenant connu comme le brouillard, a été découvert. Enquête plus approfondie sur la fonction de brume ont démontré que non seulement il fallait pour la contractilité cellulaire induite par le brouillard dans les cellules S2R +, mais il est également essentiel pour la gastrulation dans le développement de Drosophila21. En outre, ce test a été utilisé pour démontrer que CIR-8, un FEM non canonique, est également un composant dans le brouillard27de la voie de signalisation. Une série d’expériences d’Arni épistasie couplé avec le test de contractilité a démontré que les CIR-8 interagit avec la sous-unité de12/13 Gα Cta et les fonctions de localiser à l’intérieur de la cellule, ce qui est essentielle à la contractilité cellulaire induite par le brouillard31 .
Culture de tissus de drosophile est bien adaptée aux novices, comme les cellules sont facilement maintenus à température ambiante, ne nécessitent pas de CO2 ou mis en mémoire tampon de milieu de culture cellulaire et sont robustes, aussi longtemps que les densités de culture cellulaire appropriée sont maintenues. Le dosage de la contractilité cellulaire a été effectué avec succès par la section laboratoire d’un cours de biologie de premier cycle cellulaire, où les étudiants n’avaient peu ou aucun expérience avec la culture de cellules ou de microscopie. Le dosage de contractilité cellulaire présenté ici représente un outil puissant, à base de cellules qui peut être employé dans la découverte de gènes, ou pour interroger le brouillard voie de signalisation, nous aidant à mieux comprendre le processus de développement, tels que la constriction apicale et contractilité II la myosine non musculaire, en général.

Études de l’embryogenèse menées auprès des organismes modèles génétiques sont sont révélés très précieux pour notre compréhension de la façon dont les cellules sont assemblés dans les tissus. En particulier, les études de Drosophila melanogaster, ont abouti à l’identification des gènes clés et principes biologiques qui dirigent la morphogenèse et le développement d’organismes de la fécondation à l’âge adulte1,2 , 3. Parallèlement à la recherche génétique menée avec la drosophile, les lignées de cellules cultivées provenant de tissus de la mouche des fruits sont également apparues comme un puissant système d’aborder un large éventail de moléculaire et biologique de la cellule des questions4, 5 , 6. cellules de culture de tissus de drosophile ont des exigences minimales pour l’entretien, car ils sont cultivés à la température ambiante et sans CO2. Par conséquent, ils sont prêtent à l’imagerie haute résolution, et ils ont un haut degré de sensibilité à l’inhibition du gène par ARNi6,7. De nombreux groupes ont utilisé des cellules de culture de tissus de drosophile comme outil pour découvrir les gènes impliqués dans la définition de la forme des cellules, la dynamique du cytosquelette, viabilité, phagocytose et signal transduction pathways4,8, 9,10,11. Travaillant comme un modèle aux côtés de l’animal entier, lignées de cellules cultivées Drosophila offrent un ensemble d’approches très complémentaires qui accélèrent l’identification de molécules importantes pour la mise au point et fournir un cadre dans lequel déterminer leurs rôles mécaniste12. Nous décrivons ici une analyse axée sur les cellules afin d’étudier les voies de signalisation qui déclenchent la constriction apicale via la gastrulation plié (brouillard) voie13,14. Ce dosage de contractilité basés sur les cellules permet aux chercheurs d’étudier tous les deux le brouillard signalisation voie et les mécanismes moléculaires régulant la contractilité de la myosine non musculaire II.
Gastrulation de l’embryon de drosophile précoce a été étudiée pendant de nombreuses années comme modèle génétique pour la morphogenèse épithéliale et la transition cellulaire épithéliale à l’identité des cellules mésenchymateuses. L’un des principaux événements de la gastrulation est la morphogénèse d’un sous-ensemble de cellules épithéliales le long de la ligne ventrale embryonnaire médiane de colonnes à pyramidal en forme15,16,17,18. Cette forme de la cellule simple changement se traduit par l’internalisation des cellules mésodermiques présomptives et est entraînée par l’activité motrice de la myosine non musculaire II constriction de l’actine réseau16,19,20. Des décennies de recherche génétique a identifié les composants moléculaires de cette voie et les a placés séquentiellement dans l’ordre suivant : 1) brouillard est sécrété par le domaine apical des cellules épithéliales à la ligne médiane ventrale ; 2) brouillard se lie à des récepteurs couplés aux protéines G Co, brume et le brouillard enfumé et signale par un heterotrimeric G-protéine complexe contenant la sous-unité de12/13 Gα Concertina (Cta), qui est chaperonné par le Ric non-canoniques de FEM-8 ; 3) LTC active un facteur d’échange nucléotide guanine, RhoGEF2, qui active à son tour la petite Rho1 protéines G ; 4) Rho1 active Rho kinase (République de Corée) ; 5) Rok active la contractilité de la myosine non musculaire II au niveau du domaine apical par la phosphorylation de la chaîne légère régulatrice (RLC), produisant ainsi la constriction apicale (Figure 1)15,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29. Des mutations dans plusieurs de ces éléments interfèrent avec la gastrulation normale et d’autres mouvements morphogénétiques, y compris la formation du disque de l’aile et les glandes salivaires, indiquant que cette voie est utilisée à différents stades de la drosophile l’embryogenèse30,31,32. La voie de brouillard est un des modèles mieux étudiés pour façonner épithéliales et a fourni des renseignements importants sur la morphogenèse comment au niveau du tissu est régulé de transcription génique à axée sur le cytosquelette cellulaire mouvements14,15 ,,21.
Nous avons développé un test de contractilité basés sur les cellules qui récapitule beaucoup d'entre les réponses cellulaires en aval de brouillard qui ont été observées dans le développement des embryons mouche17. Nous avons conçu un S2 stable lignée cellulaire qui exprime le brouillard marquée dans sa partie C-terminale avec myc sous le contrôle d’un promoteur inductible metallothionine qui peut être récolté lors de l’addition de sulfate de cuivre (CuSO4) au milieu. Lorsque médias conditionné par brouillard est appliqué façon ectopique à S2 récepteurs + (S2R +) des cellules, qui sont une sous-population de cellules S2 distingués par leur expression différentielle des récepteurs tels que les sous-unités Frizzled et intégrine, les cellules subissent une réorganisation de la cytosquelette rappelle fortement la constriction apicale12,17,27,33. Ces changements peuvent être observés en microscopie à contraste de phase dans laquelle brouillard traitement entraîne l’apparition de phase noir volants indicatives d’une augmentation de la radiale dans la contractilité de la myosine non musculaire II, ou en microscopie de fluorescence où traitement anti-buée mène à la formation de la myosine non musculaire II anneaux dans les cellules exprimant EGFP-tag RLC34. Ces anneaux contiennent une chaîne légère régulatrice d’expression-myosine phosphorylée (pRLC) visible via immunostaining23,34,35. Cette réponse induite par le brouillard requis LTC, RhoGEF2, Rho et la République de Corée ; ainsi, à l’aide de recombinants brouillard-Myc et cellules S2R +, nous avons établi un moyen d’enquêter sur la constriction induite par le brouillard dans un système à base de tissu-culture24,25,34.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1159px;" width="1157">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">S2R+ cells</td>
			<td style="width:223px;">Drosophila Genomics Resorce Center&#160;</td>
			<td style="width:123px;">150</td>
			<td style="width:496px;">cell culture line, undergoes apical constriciton</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">S2:Fog-myc cells</td>
			<td style="width:223px;">Drosophila Genomics Resorce Center&#160;</td>
			<td>218</td>
			<td>cell culture line, produces Fog-myc under pMT promoter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">S2R+ :Sqh-EGFP cells</td>
			<td style="width:223px;">Drosophila Genomics Resorce Center&#160;</td>
			<td>196</td>
			<td>cell culture line, stably expresses Sqh(RLC of non-muscle myosin II) tagged with EGFP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Shield and Sang M3</td>
			<td style="width:223px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">S3652</td>
			<td>cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">SF900 insect medium</td>
			<td style="width:223px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>12658019</td>
			<td>alternative cell cutlure medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Schneider&#8217;s insect medium</td>
			<td style="width:223px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>21720024</td>
			<td>alternative cell cutlure medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:223px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>16000044</td>
			<td>media supplement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td style="width:223px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>15240112</td>
			<td>antimicrobial/antifugal media supplement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Concanavalin A</td>
			<td style="width:223px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:123px;">150710</td>
			<td>used to coat dishes and coverslip for cellular adhesion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Glass bottom plates</td>
			<td style="width:223px;">Maktek</td>
			<td style="width:123px;">P35G-1.5-10</td>
			<td>used for assay and for fixing and staining cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Glass cover slips</td>
			<td style="width:223px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">2940-225</td>
			<td>alternative to glass bottom dishes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Protein concentrators</td>
			<td style="width:223px;">Millipore</td>
			<td style="width:123px;">UFC903008</td>
			<td>30,000 molecular weight cutoff, used to concentrate media</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:317px;">25 cm2, 75 cm2, 150 cm2 tissue culture flasks</td>
			<td style="width:223px;">Genessee</td>
			<td style="width:123px;">25-204,25-206,25-208,25-210</td>
			<td>used to culture cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">6-well and 12-well tissue culture dishes</td>
			<td style="width:223px;">Genessee</td>
			<td style="width:123px;">25-105, 25-106</td>
			<td>used to culture cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Flourescent mounting medium</td>
			<td style="width:223px;">Dako</td>
			<td style="width:123px;">S3023</td>
			<td>to preserve fixed cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">32% Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:223px;">EMS</td>
			<td style="width:123px;">15714-S</td>
			<td>used to fix cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Pipes</td>
			<td style="width:223px;">EMS</td>
			<td style="width:123px;">19240</td>
			<td>used in PEM buffer for cell fixation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Anti-Myc Antibody</td>
			<td style="width:223px;">Drosophila Hybirdoma Bank</td>
			<td style="width:123px;">cat# 9E10</td>
			<td>used to dectect Fog-Myc&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">PhosphoSerine-19 antibody</td>
			<td style="width:223px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:123px;">3671</td>
			<td>antibody against phosphorylated regulatory light chain (RLC) serine 19</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">488-Phalloidin, 568-Phalloidin</td>
			<td style="width:223px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">A12379, A12380</td>
			<td>to stain for f-actin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hawk-VT multi-point array scanning confocal system&#160;</td>
			<td style="width:223px;">VisiTech International</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Used for live cell imaging of S2R+:Sqh cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Eclipse TE300 Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Used for live cell imaging of S2R+:Sqh cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a cell-based assay to investigate non-muscle myosin ii contractility via the folded-gastrulation signaling pathway in drosophila s2r+ cells

Nous avons développé un test d’amplification cellulaire utilisant des cellules de drosophile qui récapitule la constriction apicale initiée par gastrulation pliée (brouillard), un autocatalytiques épithéliales sécrétées. Dans cet essai, brouillard est utilisé comme un agoniste pour activer Rho à travers une cascade de signalisation qui comprend un récepteur couplé aux protéines G (Mist), une protéine de12/13 Gα (Concertina/Cta) et un facteur d’échange du nucléotide des guanine-contenant du domaine PDZ (RhoGEF2). Brouillard entraîne la réorganisation rapide et spectaculaire du cytosquelette d’actine pour former une chaîne sac contractile de signalisation. Brouillard soluble est prélevé une lignée cellulaire stable et appliqué de façon ectopique à cellules S2R +, conduisant à des changements morphologiques comme la constriction apicale, un processus observé au cours du processus de développement comme la gastrulation. Ce dosage est susceptible de criblage à haut débit et, à l’aide d’Arni, peut faciliter l’identification des autres gènes impliqués dans cette voie.

S2 et S2:Fog-Myc cellules ont été cultivées à proximité des conditions confluentes dans une fiole de vitroplants de 150 cm2 et ont été traités avec 25-75 µM CuSO4 sur une période de 24 à 48 heures pour induire l’expression de brouillard-Myc (Figure 2). Des échantillons de cellules S2 (Figure 2A) et S2:Fog-Myc cellules (Figure 2B) ont été retirées et la production de brouillard-Myc a été suivie par western blot. Comme prévu, nous n’avons pas détecter brouillard-Myc dans les médias récoltées à partir des cellules S2 dans toutes les conditions. Cependant, nous avons détecté brouillard dans les médias récoltées dans le S2:Fog-lignée cellulaire stable de Myc, dès 24 heures après l’induction avec 75 µM CuSO4. S2R + cellules attachés à la con-A-enduit à fond de verre plats exprimant une étiquette EGFP chaîne légère régulatrice (GFP-RLC) de la myosine non musculaire II (Figures 3 a et 3 b). Imagerie de cellules vivantes a été réalisée sur un microscope inversé équipé d’un 100 X / 1.4 NA objectif durant la perfusion de médias conditionné par brouillard. Environ 5 minutes après le traitement avec brouillard-Myc, le RLC formé les anneaux de constriction de la myosine non musculaire II. Ces anneaux peut être observés par immunomarquage S2R + cellules avec un anticorps dirigé contre un phosphopeptide synthétique correspondant à des résidus qui entourent Ser19 de myosine humaine RLC (Figures 4 a et 4 b). Cet anticorps réagissent avec Drosophila RLC.
Nous avons ici un exemple représentatif de l’essai de contractilité cellulaire après un traitement de 7 jours de cellules avec contrôle RNAi et dsRNA contre Rho1 (Figures 5 a - 5E). S2R + cellules étaient plaquées sur la con-A-enduit à fond de verre vaisselle et traités avec brouillard conditionnée (+ brouillard) médias ou contrôle (-brouillard). Le nombre de cellules sous contrats ont été quantifié puis après fixation. Les indicatifs de phase dense aux volants de constriction dominait dans les cellules de contrôle appauvri traitées avec brouillard-conditionné médias (Figure 5B). Figure 5C, Rho-appauvri des cellules traitées avec milieu conditionné S2 sont un exemple typique de morphologie à bords lisses, frits-semblables à des œufs. Notez que Rho joue un rôle dans la voie de signalisation de brouillard, ainsi que dans la cytokinèse ; ainsi, Rho-appauvri cellules souvent ne pas diviser correctement, conduisant à une augmentation de la taille des cellules et la ploïdie. Traitement de la commande cellules appauvris avec les médias conditionné par Fog typique conduit à 30-50 % des cellules subissant une constriction, alors que nous n’a pas observé de constriction importante dans les cellules appauvries Rho.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58325/58325fig1.jpg"> Figure 1:le brouillard putatif, voie de signalisation. En l’absence de brouillard, la sous-unité Gα12/13 Concertina (Cta), ainsi que ses partenaires de liaison Gϒ et Gβ, sont inactifs et associé les corécepteurs de brume et le brouillard enfumé. CIR-8 accompagnateurs LTC et régule sa localisation subcellulaire. À brouillard binding, LTC dissocie de Gϒ et Gβ recrute RhoGEF2 à la membrane de la cellule où elle catalyse l’échange du PIB pour GTP dans la petite GTPase Rho1. GTP-bondissent Rho1, maintenant active, active Rho Kinase (République de Corée), qui phosphoryle le RLC de la myosine non musculaire, conduisant à son activation et la contractilité cellulaire ultérieure. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58325/58325fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58325/58325fig2.jpg"> Figure 2 : Évolution temporelle de la production de brouillard-Myc. Ces panneaux montrent un milieu de culture cellulaire récolté dans une fiole confluentes proche de 100 % des cellules contrôles S2 (A) ou (B) S2:Fog-cellules stables de Myc. Les cellules ont été traitées avec 25-75 µM CuSO4 sur une période de 24 à 48 heures. Le milieu de culture cellulaire a été recueilli et préparé pour SDS-PAGE et éponger occidental. Brouillard-Myc a été détectée par un anticorps anti-Myc. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58325/58325fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58325/58325fig3.jpg"> Figure 3 : Imagerie de cellules vivantes de constriction induite par le brouillard. Stable S2R + les lignées de cellules exprimant EGFP-tag RLC de la myosine non musculaire II ont été photographié par microscopie confocale a balayé au cours de la perfusion des médias conditionné par brouillard. Heure est indiquée en minutes et secondes. (A), ce panneau affiche une image d’un plan focal à proximité de l’interface de la cellule-lamelle au temps 0:00 avant la perfusion de brouillard-Dauphiné (B), ce panneau affiche une série temporelle (0:30-10:00) des images prises dans un plan focal près du sommet de la cellule. Les flèches blanches indiquent la réorganisation de la myosine non musculaire II comme indiqué par EGFP-RLC en rondelles contractiles au cours de la constriction. La barre d’échelle est 10 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58325/58325fig3large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58325/58325fig4.jpg"> Figure 4 : Phosphorylée-RLC se localise à anneaux contractiles après induction de constriction par brouillard-Dauphiné S2R + cellules étaient fixés et colorés pour l’actine en utilisant la phalloïdine (rouge), phosphorylée RLC à l’aide d’un anticorps phosphosérine-19 (vert) et DAPI (ADN, bleu), après traitement avec contrôle de (A) ou (B), brouillard-Myc-conditionné médias. Notez la réorganisation du RLC phosphorylé en rondelles sur l’ajout du brouillard-Dauphiné <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58325/58325fig4large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58325/58325fig5.jpg"> Figure 5 : Quantification représentatif de l’essai de contractilité cellulaire induite par le brouillard. S2R + cellules ont été traitées avec contrôle (A et B) Arni ou dsRNA (C et D) contre le petit GTPase Rho1 pendant 7 jours. Après ce temps, les cellules ont été cultivées sur con-A-enduit les plats à fond de verre et ont été traités par les médias de contrôle (A et C) ou des médias à brouillard-Myc-conditionné (B et D). L’échelle bar représente 10 µm. (E) un scatter emplacement indique les intervalles de confiance moyenne et 95 % de la fraction des cellules contractées par l’État. Chaque point représente la fraction de cellules sous contrats / champ de vision au grossissement X 40 (cellules de 10 à 120 par champ) et les chiffres entre parenthèses indiquent que le nombre total de cellules comptées pour cellules sous contrats et sans contrat distinct sur trois Expériences d’Arni. Astérisques indiquent une différence statistiquement significative entre les traités RNAi et brouillard conditions comme déterminé par ANOVA à (p < 0,0001) avec analyse de post hoc à comparaison multiple de Tukey. Notez qu’il n’y avait aucune différence statistiquement significative (n.s.) entre échantillons Rho1 RNAi-traités, traités avec contrôle ou des médias de brouillard-Myc-conditionné. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58325/58325fig5large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Cell-based Assay to Investigate Non-muscle Myosin II Contractility via the Folded-gastrulation Signaling Pathway in Drosophila S2R+ Cells at JoVE.com

A Cell-based Assay to Investigate Non-muscle Myosin II Contractility via the Folded-gastrulation Signaling Pathway in Drosophila S2R+ Cells

Nous décrivons ici un essai de contractilité S2R + cellules de drosophile . L’application d’un ligand exogène, gastrulation plié (Fog), conduit à l’activation du brouillard contractilité cellulaire et de la voie de signalisation. Ce test peut être utilisé pour étudier la régulation des protéines cellulaires contractilité dans le brouillard, voie de signalisation.

Un Cell-based Assay pour étudier la myosine Non musculaire II contractilité via la gastrulation plié voie de signalisation de cellules S2R + Drosophila

We have developed a cell-based assay using Drosophila cells that recapitulates apical constriction initiated by folded gastrulation (Fog), a secreted ...

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A Cell-based Assay to Investigate Non-muscle Myosin II Contractility via the Folded-gastrulation Signaling Pathway in Drosophila S2R+ Cells

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