Name: a cell-based assay to investigate non-muscle myosin ii contractility via the folded-gastrulation signaling pathway in drosophila s2r+ cells
Uploaded: 2018-08-19T15:00:00
Duration: 7 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Cell-based Assay to Investigate Non-muscle Myosin II Contractility via the Folded-gastrulation Signaling Pathway in Drosophila S2R+ Cells at JoVE.com

המחברים רוצה להודות חברי המעבדה רוג'רס, המעבדה אפלוויט גרטה גלובר, הסטודנטים של המכללה ריד האביב 2018 קורס ביולוגיה תאית, שתרמו להתפתחות של פרוטוקול זה. יתר על כן, המחברים רוצה להודות חברי המעבדה ריץ בקפידה קריאה ועריכה של כתב היד הזה. מחקר דיווח בפרסום זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדע תחת מספר פרס 716964 D.A.A., ע. ר, המחלקה לביולוגיה של המכללה ריד.

<ol>
	<li>Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+tools+and+assays+for+the+study+of+human+diseases.">Drosophila tools and assays for the study of human diseases.</a> Disease Model Mechanisms. 9 (3), 235-244 (2016).</li><li>Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila,+the+golden+bug,+emerges+as+a+tool+for+human+genetics.">Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics.</a> Nature Reviews Genetics. 6 (1), 9-23 (2005).</li><li>Millburn, G. H., Crosby, M. A., Gramates, L. S., Tweedie, S., FlyBase, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FlyBase+portals+to+human+disease+research+using+Drosophila+models.">FlyBase portals to human disease research using Drosophila models.</a> Disease Model Mechanisms. 9 (3), 245-252 (2016).</li><li>Perrimon, N., Mathey-Prevot, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+high-throughput+RNA+interference+screens+to+problems+in+cell+and+developmental+biology.">Applications of high-throughput RNA interference screens to problems in cell and developmental biology.</a> Genetics. 175 (1), 7-16 (2007).</li><li>Currie, J. D., Rogers, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+the+Drosophila+melanogaster+D17-c3+cell+culture+system+to+study+cell+motility.">Using the Drosophila melanogaster D17-c3 cell culture system to study cell motility.</a> Nature Protocols. 6 (10), 1632-1641 (2011).</li><li>Rogers, S. L., Rogers, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+Drosophila+S2+cells+and+their+use+for+RNAi-mediated+loss-of-function+studies+and+immunofluorescence+microscopy.">Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence microscopy.</a> Nature Protocols. 3 (4), 606-611 (2008).</li><li>Applewhite, D. A., Davis, C. A., Griffis, E. R., Quintero, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+the+Cytoskeleton+Using+Live+and+Fixed+Drosophila+Tissue+Culture+Cells.">Imaging of the Cytoskeleton Using Live and Fixed Drosophila Tissue Culture Cells.</a> Methods Molecular Biology. 1365, 83-97 (2016).</li><li>Rogers, S. L., Wiedemann, U., Stuurman, N., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+requirements+for+actin-based+lamella+formation+in+Drosophila+S2+cells.">Molecular requirements for actin-based lamella formation in Drosophila S2 cells.</a> The Journal of Cell Biology. 162 (6), 1079-1088 (2003).</li><li>Yi, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+RNAi+screen+reveals+multiple+regulators+of+caspase+activation.">A genome-wide RNAi screen reveals multiple regulators of caspase activation.</a> The Journal of Cell Biology. 179 (4), 619-626 (2007).</li><li>Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+RNAi+screen+reveals+CD36+family+member+required+for+mycobacterial+infection.">Drosophila RNAi screen reveals CD36 family member required for mycobacterial infection.</a> Science. 309 (5738), 1251-1253 (2005).</li><li>Nir, O., Bakal, C., Perrimon, N., Berger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inference+of+RhoGAP/GTPase+regulation+using+single-cell+morphological+data+from+a+combinatorial+RNAi+screen.">Inference of RhoGAP/GTPase regulation using single-cell morphological data from a combinatorial RNAi screen.</a> Genome Research. 20 (3), 372-380 (2010).</li><li>Manning, A. J., Peters, K. A., Peifer, M., Rogers, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+epithelial+morphogenesis+by+the+G+protein-coupled+receptor+mist+and+its+ligand+fog.">Regulation of epithelial morphogenesis by the G protein-coupled receptor mist and its ligand fog.</a> Science Signaling. 6 (301), 98 (2013).</li><li>Leptin, M., Grunewald, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+shape+changes+during+gastrulation+in+Drosophila.">Cell shape changes during gastrulation in Drosophila.</a> Development. 110 (1), 73-84 (1990).</li><li>Leptin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrulation+movements:+the+logic+and+the+nuts+and+bolts.">Gastrulation movements: the logic and the nuts and bolts.</a> Developmental Cell. 8 (3), 305-320 (2005).</li><li>Martin, A. C., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical+constriction:+themes+and+variations+on+a+cellular+mechanism+driving+morphogenesis.">Apical constriction: themes and variations on a cellular mechanism driving morphogenesis.</a> Development. 141 (10), 1987-1998 (2014).</li><li>Dawes-Hoang, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=folded+gastrulation,+cell+shape+change+and+the+control+of+myosin+localization.">folded gastrulation, cell shape change and the control of myosin localization.</a> Development. 132 (18), 4165-4178 (2005).</li><li>Rogers, S. L., Wiedemann, U., H&#228;cker, U., Turck, C., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+RhoGEF2+associates+with+microtubule+plus+ends+in+an+EB1-dependent+manner.">Drosophila RhoGEF2 associates with microtubule plus ends in an EB1-dependent manner.</a> Current Biology. 14 (20), 1827-1833 (2004).</li><li>Coravos, J. S., Martin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical+Sarcomere-like+Actomyosin+Contracts+Nonmuscle+Drosophila+Epithelial+Cells.">Apical Sarcomere-like Actomyosin Contracts Nonmuscle Drosophila Epithelial Cells.</a> Developmental Cell. 39 (3), 346-358 (2016).</li><li>Mason, F. M., Tworoger, M., Martin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical+domain+polarization+localizes+actin-myosin+activity+to+drive+ratchet-like+apical+constriction.">Apical domain polarization localizes actin-myosin activity to drive ratchet-like apical constriction.</a> Nature Cell Biology. 15 (8), 926-936 (2013).</li><li>Fox, D. T., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abelson+kinase+(Abl)+and+RhoGEF2+regulate+actin+organization+during+cell+constriction+in+Drosophila.">Abelson kinase (Abl) and RhoGEF2 regulate actin organization during cell constriction in Drosophila.</a> Development. 134 (3), 567-578 (2007).</li><li>Manning, A. J., Rogers, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Fog+signaling+pathway:+insights+into+signaling+in+morphogenesis.">The Fog signaling pathway: insights into signaling in morphogenesis.</a> Developmental Biology. 394 (1), 6-14 (2014).</li><li>Xie, S., Mason, F. M., Martin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+G&#945;12/13+exacerbates+apical+area+dependence+of+actomyosin+contractility.">Loss of G&#945;12/13 exacerbates apical area dependence of actomyosin contractility.</a> Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3526-3536 (2016).</li><li>Vasquez, C. G., Tworoger, M., Martin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+myosin+phosphorylation+regulates+contractile+pulses+and+tissue+integrity+during+epithelial+morphogenesis.">Dynamic myosin phosphorylation regulates contractile pulses and tissue integrity during epithelial morphogenesis.</a> The Journal of Cell Biology. 206 (3), 435-450 (2014).</li><li>Parks, S., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+gastrulation+gene+concertina+encodes+a+G+alpha-like+protein.">The Drosophila gastrulation gene concertina encodes a G alpha-like protein.</a> Cell. 64 (2), 447-458 (1991).</li><li>Barrett, K., Leptin, M., Settleman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rho+GTPase+and+a+putative+RhoGEF+mediate+a+signaling+pathway+for+the+cell+shape+changes+in+Drosophila+gastrulation.">The Rho GTPase and a putative RhoGEF mediate a signaling pathway for the cell shape changes in Drosophila gastrulation.</a> Cell. 91 (7), 905-915 (1997).</li><li>Costa, M., Wilson, E. T., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+putative+cell+signal+encoded+by+the+folded+gastrulation+gene+coordinates+cell+shape+changes+during+Drosophila+gastrulation.">A putative cell signal encoded by the folded gastrulation gene coordinates cell shape changes during Drosophila gastrulation.</a> Cell. 76 (6), 1075-1089 (1994).</li><li>Peters, K. A., Rogers, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Ric-8+interacts+with+the+G&#945;12/13+subunit,+Concertina,+during+activation+of+the+Folded+gastrulation+pathway.">Drosophila Ric-8 interacts with the G&#945;12/13 subunit, Concertina, during activation of the Folded gastrulation pathway.</a> Molecular Biology of the Cell. 24 (21), 3460-3471 (2013).</li><li>Jha, A., van Zanten, T. S., Philippe, J. M., Mayor, S., Lecuit, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Control+of+GPCR+Organization+and+Signaling+by+Endocytosis+in+Epithelial+Morphogenesis.">Quantitative Control of GPCR Organization and Signaling by Endocytosis in Epithelial Morphogenesis.</a> Current Biology. 28 (10), 1570-1584 (2018).</li><li>Kerridge, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+activation+of+Rho1+by+GPCR+signalling+imparts+polarized+myosin+II+activation+during+morphogenesis.">Modular activation of Rho1 by GPCR signalling imparts polarized myosin II activation during morphogenesis.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 261-270 (2016).</li><li>Myat, M. M., Andrew, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+shape+in+the+Drosophila+salivary+gland+is+controlled+by+regulated,+sequential+internalization+of+the+primordia.">Organ shape in the Drosophila salivary gland is controlled by regulated, sequential internalization of the primordia.</a> Development. 127 (4), 679-691 (2000).</li><li>Kanesaki, T., Hirose, S., Grosshans, J., Fuse, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotrimeric+G+protein+signaling+governs+the+cortical+stability+during+apical+constriction+in+Drosophila+gastrulation.">Heterotrimeric G protein signaling governs the cortical stability during apical constriction in Drosophila gastrulation.</a> Mechanisms of Development. 130 (2-3), 132-142 (2013).</li><li>Nikolaidou, K. K., Barrett, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rho+GTPase+signaling+pathway+is+used+reiteratively+in+epithelial+folding+and+potentially+selects+the+outcome+of+Rho+activation.">A Rho GTPase signaling pathway is used reiteratively in epithelial folding and potentially selects the outcome of Rho activation.</a> Current Biology. 14 (20), 1822-1826 (2004).</li><li>Yanagawa, S., Lee, J. S., Ishimoto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+novel+line+of+Drosophila+Schneider+S2+cells+that+respond+to+wingless+signaling.">Identification and characterization of a novel line of Drosophila Schneider S2 cells that respond to wingless signaling.</a> Journal Biological Chemistry. 273 (48), 32353-32359 (1998).</li><li>Mason, F. M., Xie, S., Vasquez, C. G., Tworoger, M., Martin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RhoA+GTPase+inhibition+organizes+contraction+during+epithelial+morphogenesis.">RhoA GTPase inhibition organizes contraction during epithelial morphogenesis.</a> The Journal of Cell Biology. 214 (5), 603-617 (2016).</li><li>Martin, A. C., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsed+contractions+of+an+actin-myosin+network+drive+apical+constriction.">Pulsed contractions of an actin-myosin network drive apical constriction.</a> Nature. 457 (7228), 495-499 (2009).</li></ol>

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול מפורט עבור וזמינותו contractility מבוססת תא באמצעות דרוזופילה תרביות רקמה קו תא (S2R + תאים), אשר עובר שרירים שאינם צולבות הקישור חוטים שרירן לתעוקה II בתגובה ערפל איתות. Assay זו שימושית עבור חוקרים את מסלול ערפל, וכן מנגנונים המסדירים שרירים שאינם צולבות הקישור חוטים שרירן II contractility.
תא culturing שיקולים: התנאים תחת אילו S2R + תאים נשמרים חיוני להשגת נתונים אמין זה וזמינותו. בעת תכנון לבצע את הבדיקה contractility, זה הכי טוב לשמור על S2R + תאים במדיום חרקים מגן ו- M3 שרו. בעוד S2R + תאים יכולים לשגשג בתקשורת תרבות אחרים תא חרקים (למשלSF900 או של שניידר חרקים בינוני), הם לעיתים קרובות מאבדים את ההיענות שלהם כדי ערפל. S2R + תאים המכילים מספר מעבר גבוה, בדרך כלל יותר מ 20-25 קטעים, מתחילים להפסיד רגישות RNAi. עדיף להשתמש במעבר מוקדם תאים עבור כל הניסויים. היבט חשוב נוסף ולניסויים דלדול RNAi היא בחירת הפקדים המתאימים. פקדים שלילי נפוצים כוללים dsRNA מיקוד EGFP או pBlueScript, וגם את אשר יש לי הומולוגיה כדי הגנום לעוף. פילוח חלבונים במסלול ערפל (רו, רוק, וכו '), אשר, כאשר דלה, למנוע את ההפעלה של שרירים שאינם צולבות הקישור חוטים שרירן contractility, הם גם פקדים שימושיים. S2:Fog-Myc תאים יכול להישמר במדיום תרבות התא אלטרנטיביות כגון SF900 בתוספת 100 יחידות/mL הפניצילין, סטרפטומיצין µg/mL 100, ו 0.25 שהוא גוסס ב' הערה FBS הזה נדרש לא כאשר culturing בתאים SF900. תא צפיפות היא גם מרכיב קריטי לכל ההיבטים של תאים תרביות רקמה דרוזופילה . בניגוד תרביות רקמה בתרבית של תאים, דרוזופילה-תרביות רקמה נגזר תאים לשגשג הטוב תחת צפיפויות תא גבוה יותר (צפיפות לא נמוך מ 5 x 105 תאים/מ ל...). עם זאת, בעת ביצוע וזמינותו הזה, זה קריטי כי תאים לא מצופה ב- con A-מצופים מנות עם תחתית זכוכית מעל 80% הנהרות, כפי כימות של חוזה לעומת תאים שאינו מתכווץ מאוד מייגע
היבטים קריטיים, גישות אלטרנטיביות של וזמינותו Contractility הסלולר: הייצור של ערפל, ליגנד שמפעיל שרירים שאינם צולבות הקישור חוטים שרירן II contractility, היא מרכיב מרכזי של זה וזמינותו. הגן ערפל מקודד חלבון של חומצות אמינו 730 עם משקל מולקולרי החזוי של ~ 78 kDa26. ניתוח hydropathy גילה רצועה של שאריות הידרופובי 12-הערפל אמינו-terminus יכול לתפקד כרצף הפרשת אות. בנוסף, רצף קידוד מכיל גם באתרים מרובים עבור פוטנציאל גליקוזילציה N-O-מקושרים, נוסף רומז שערפל הוא חלבון המופרש26. כדי לתמוך בזה, ערפל מקומי שלפוחית הפרשה הרב, שעורר תאים באפידרמיס בתהליך הכיווץ הפסגה16. ערפל-Myc ביטוי הושרה על תוספת של נחושת גופרתית למדיום, נוגדנים נגד ערפל או Myc מוכר חלבון 150-kD מאמצעי התרבות שנקטפו מתרבויות המושרה אבל לא מ המושרה מדיה מתאי S2 חסר הבונה ערפל-Myc. משקל מולקולרי הזה היה גבוה יותר מאשר המשקל המולקולרי של 80-kD החזוי של ערפל, מרמז כי המנגנונים הפרשה של תאים S2 עשוי glycosylate החלבון לפני אקסוציטוזה. לאור ההשתנות פוטנציאליים טיהור ערפל, רצוי להשתמש מאותה אצווה של ערפל ממוזגים מדיה עבור כל הניסויים. ממציא גדול אצוות של מדיה ערפל-Myc מרוכז תסייע בשמירה על עקביות לאורך כל הסיבובים של ניסויים.
ההצלחה של assay זו תלויה גם בביטחון זיהוי תאים שעברו הכיווץ. בעוד תאים מכווץ יכול להיות שנצפו על ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ, על ידי צביעת אקטין או שרירים שאינם צולבות הקישור חוטים שרירן II, הדרך האמינה ביותר כדי לזהות ולכמת תאים מכווץ הוא דרך שלב-ניגודיות או מיקרוסקופ DIC. ספירות מדויק יכולה להיות מושגת באמצעות 20 X - 40 X הגדלה על מיקרוסקופ אור רגיל ביותר. למרות בפרוטוקול נכתב משתמשת כאן מנות תת, וזמינותו ניתן גם לבצע באמצעות תקן 1.5 coverslips זכוכית דקה מצופה con א התוספת של ערפל יכולה להיעשות 35 מ מ של תרביות רקמה על coverslip מניחים על מצלמות-מיקרוסקופים, כדי להגביל את כמות ערפל המשמש עבור כל וזמינותו. האיכות של קיבעון הוא מרכיב קריטי וזמינותו, כפי תאים גרוע קבוע יכול להוביל תוצאות חיוביות שגויות. באמצעות פתרון קיבוע טריים ולוודא התאים לא יבש מתקבעת יוביל תוצאות אמינות יותר. לבסוף, חשוב לספור את מספר גדול של תאים. בדרך כלל, רק 30% - 50% של מטופל או תאים שטופלו RNAi שליטה מתכווצים בעקבות זלוף של ערפל. עם זאת, יש רמה הבזליים של הכיווץ המתרחשת ב- S2R + תאים, כך מספר גדול של תאים יש צורך להבטיח כל שינוי השבר תאים מכווץ עקב טיפולים. יתר על כן, דלדול של כמה חלבונים מעורב ברגולציה של שרירים שאינם צולבות הקישור חוטים שרירן II contractility עלול להוביל hyper-contractility, גם בהיעדר של ערפל. הנתונים המובאים כאן הם מעל התאים 3,600 נמנו שלושה טיפולים רצופים RNAi באמצעות מאותה אצווה של מדיה ממוזגים ערפל.
יישומים של וזמינותו Contractility הסלולר: זה וזמינותו contractility, בשילוב עם RNAi הקרנת שיטות, מציע מערכת חזקה ללמוד איתות התא, מורפוגנזה ו contractility הסלולר. בעבר, זה שימש כדי לזהות אחד של ערפל שני רצפטורים שיתוף21. מסך יישוב של 138 G-חלבון בשילוב קולטנים (GPCRs) תיגמר ידי RNAi S2R + בתאים, יכולתו להגיב הערפל היה לבדיקה כמפורט בפרוטוקול המוצג כאן. של GPCRs 138, יחיד, ג'ין uncharacterized בעבר, כיום ידוע ערפל, נחשפה. חקירה נוספת הפונקציה של ערפל הוכיח כי לא רק היה זה נדרש עבור ערפל-induced contractility התאית בתאים S2R +, אבל זה גם היה חיוני gastrulation בפיתוח דרוזופילה21. יתר על כן, וזמינותו הזה שימש כדי להדגים כי ריק-8, של גף קאנונית, היא גם מרכיב בערפל איתות לשביל27. סדרה של ניסויים RNAi אפיסטזה בשילוב עם וזמינותו contractility הפגינו ריק-8 אינטראקציה עם יחידת משנה12/13 Gα Cta, פונקציות כדי לאתר אותו בתוך התא, אשר הינה קריטית ערפל-induced contractility הסלולר31 .
תרביות רקמה דרוזופילה הוא מתאים במיוחד טירונים, התאים נשמרים בקלות בטמפרטורת החדר, אינם דורשים CO2 או buffered תא תרבות בינוני, מוצקים כל עוד התא הנכון תרבות צפיפויות נשמרים. וזמינותו contractility הסלולר בוצעה בהצלחה באמצעות המקטע מעבדה של קורס ביולוגיה לתואר ראשון תא, שבו התלמידים היו ללא ניסיון עם תאים culturing או מיקרוסקופ. וזמינותו contractility הסלולר המובאת כאן מייצג כלי רב עוצמה, המבוססים על התא יכול להיות מועסק גילוי הגן, או לחקור את הערפל איתות, עוזר לנו טוב יותר להבין תהליכים התפתחותיים, כגון לתעוקה הפסגה ו שרירים שאינם צולבות הקישור חוטים שרירן contractility II, באופן כללי.

מחקרים של מופרה שנערך עם מודל גנטי אורגניזמים הוכיחו שלא יסולא בפז להבנתנו כיצד התאים מתלכדות רקמות. מחקרים של דרוזופילה melanogaster, בפרט, הובילו את הזיהוי של גנים מרכזיים ועקרונות ביולוגי אשר יכוונו את מורפוגנזה ופיתוח של אורגניזמים מן ההפריה לבגרות1,2 , 3. במקביל למחקר גנטי שנערך עם דרוזופילה, שורות תאים בתרבית נגזר זבוב הפירות רקמות הופיעו גם כמערכת רב עוצמה כדי לטפל בקשת רחבה של מולקולרית של התא הביולוגי שאלות4, 5 , 6. דרוזופילה תרביות רקמה תאים יש דרישות מינימליות עבור תחזוקה, כפי שהם בתרבית בטמפרטורת החדר, ללא CO2. ככאלה, הן נתונות דימות ברזולוציה גבוהה, ויש להם רמה גבוהה של רגישות גן עיכוב על ידי RNAi6,7. קבוצות רבות השתמשו דרוזופילה תרביות רקמה תאים ככלי לגלות גנים המעורבים, הגדרת צורת התא, cytoskeletal dynamics, הכדאיות, phagocytosis והאות התמרה חושית מסלולים4,8, 9,10,11. כאשר מועסק כמודל לצד כל החיות, שורות בתרבית של תאים דרוזופילה מציעים קבוצת גישות משלימות מאוד להאיץ את הזיהוי של מולקולות חשוב לפיתוח ומספקים מסגרת שבה לקבוע את תפקידי מכניסטית12. כאן, אנו מתארים וזמינותו מבוססת תא ללמוד את איתות המסלולים המפעילות לתעוקה הפסגה דרך 13,14מסלול (ערפל) מקופל-gastrulation. Assay contractility מבוססת-תא הזה מאפשר לחוקרים לחקור שניהם הערפל איתות לשביל, את המנגנונים המולקולריים המסדירים שרירים שאינם צולבות הקישור חוטים שרירן II contractility.
Gastrulation של העובר דרוזופילה מוקדם נחקרה במשך שנים רבות כמודל גנטית את מורפוגנזה אפיתל, הסלולר המעבר אפיתל תא mesenchymal זהות. אחד האירועים מפתח של gastrulation הוא מורפוגנזה של קבוצת משנה של תאים אפיתל לאורך הקו האמצעי הגחון עובריים של טורי כדי כפירמידה צורה15,16,17,18. צורת תא פשוט לשנות תוצאות ההפנמה של התאים mesodermal הרב, שעורר ואת מונעת על ידי פעילות מוטורית של שרירים שאינם צולבות הקישור חוטים שרירן II הג'נס19,2016,רשת אקטין. עשורים של מחקר גנטי זיהה את ההרכב המולקולרי של מסלול זה, ברצף מיקמה אותם לפי הסדר הבא: 1) ערפל מופרש מהתחום הפסגה של תאי אפיתל בקו האמצע הגחון; 2) ערפל נקשר לקולטנים G-חלבון בשילוב שיתוף, ערפל, ערפיח, ואת אותות באמצעות heterotrimeric G-חלבון כמתחם יחידת משנה של12 – 13 Gα מפוחית יד (Cta), אשר היא ליוותה אותך על-ידי גף קאנונית ריק-8; 3) Cta ומפעילה פקטור המרת נוקלאוטיד גואנין, RhoGEF2, אשר בתורו מפעיל את Rho1 G-חלבון קטן; 4) Rho1 מפעיל קינאז רו (Rok); 5) Rok מפעיל שרירים שאינם צולבות הקישור חוטים שרירן contractility II התחום הפסגה דרך זירחון של שרשרת אור רגולטוריות (RLC), ובכך לייצר לתעוקה הפסגה (איור 1)15,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29. מוטציות בכמה מרכיבים אלה להפריע את gastrulation נורמלי ותנועות morphogenetic אחרים, כולל היווצרות של דיסק כנף, בלוטות הרוק, המציין כי מסלול זה משמש מספר שלבי דרוזופילה מופרה30,31,32. מסלול ערפל הוא אחד הדגמים הכי למד לעיצוב אפיתל, סיפקה תובנות חשובות איך רקמות ברמת מורפוגנזה מוסדר של שעתוק גנים מונחה שלד התא תא תנועות14,15 ,21.
פיתחנו וזמינותו contractility מבוססת-תא זה recapitulates רבים של הסלולר התגובות במורד הזרם של ערפל נצפו בפיתוח עוברי לטוס17. אנחנו מתוכנן של S2 יציב שורת התאים המבטאת ערפל מתויג ב שלה קרבוקסילי עם myc תחת השליטה של יזם inducible metallothionine ניתן לקצור על התוספת של נחושת גופרתית (CuSO4) למדיום. כאשר ממוזגים ערפל מדיה מוחל ectopically לתאים קולטנים S2 + (S2R +), אשר subline של תאים S2 מאופיינת שלהם ביטוי דיפרנציאלי של קולטנים כגון Frizzled ואינטגרין subunits, התאים עוברים ארגון מחדש של שלד התא מאוד מזכיר את הכיווץ הפסגה12,17,27,33. שינויים אלה יכול להיות שנצפו מיקרוסקופ שלב-ניגודיות בערפל איזה טיפול מוביל המראה של שלב-כהה קפלים מעידה על עלייה רדיאלי ב contractility II שרירים שאינם צולבות הקישור חוטים שרירן, או על ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ לאן הערפל טיפול מוביל צורה של שרירים שאינם צולבות הקישור חוטים שרירן טבעות II בתאים המבטאים RLC מתויג EGFP34. טבעות אלו מכילים phosphorylated צולבות הקישור חוטים שרירן רגולטוריות שרשרת אור (pRLC) גלוי ויה immunostaining23,34,35. תגובה זו ערפל-induced נדרש Cta, RhoGEF2, רו ו Rok; לפיכך, שימוש רקומביננטי ערפל-Myc S2R + תאים, הקמנו אמצעי לחקור ערפל-induced כיווץ24,25,של מערכת מבוססת על רקמות-תרבות34.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1159px;" width="1157">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">S2R+ cells</td>
			<td style="width:223px;">Drosophila Genomics Resorce Center&#160;</td>
			<td style="width:123px;">150</td>
			<td style="width:496px;">cell culture line, undergoes apical constriciton</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">S2:Fog-myc cells</td>
			<td style="width:223px;">Drosophila Genomics Resorce Center&#160;</td>
			<td>218</td>
			<td>cell culture line, produces Fog-myc under pMT promoter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">S2R+ :Sqh-EGFP cells</td>
			<td style="width:223px;">Drosophila Genomics Resorce Center&#160;</td>
			<td>196</td>
			<td>cell culture line, stably expresses Sqh(RLC of non-muscle myosin II) tagged with EGFP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Shield and Sang M3</td>
			<td style="width:223px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">S3652</td>
			<td>cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">SF900 insect medium</td>
			<td style="width:223px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>12658019</td>
			<td>alternative cell cutlure medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Schneider&#8217;s insect medium</td>
			<td style="width:223px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>21720024</td>
			<td>alternative cell cutlure medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:223px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>16000044</td>
			<td>media supplement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td style="width:223px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>15240112</td>
			<td>antimicrobial/antifugal media supplement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Concanavalin A</td>
			<td style="width:223px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:123px;">150710</td>
			<td>used to coat dishes and coverslip for cellular adhesion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Glass bottom plates</td>
			<td style="width:223px;">Maktek</td>
			<td style="width:123px;">P35G-1.5-10</td>
			<td>used for assay and for fixing and staining cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Glass cover slips</td>
			<td style="width:223px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">2940-225</td>
			<td>alternative to glass bottom dishes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Protein concentrators</td>
			<td style="width:223px;">Millipore</td>
			<td style="width:123px;">UFC903008</td>
			<td>30,000 molecular weight cutoff, used to concentrate media</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:317px;">25 cm2, 75 cm2, 150 cm2 tissue culture flasks</td>
			<td style="width:223px;">Genessee</td>
			<td style="width:123px;">25-204,25-206,25-208,25-210</td>
			<td>used to culture cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">6-well and 12-well tissue culture dishes</td>
			<td style="width:223px;">Genessee</td>
			<td style="width:123px;">25-105, 25-106</td>
			<td>used to culture cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Flourescent mounting medium</td>
			<td style="width:223px;">Dako</td>
			<td style="width:123px;">S3023</td>
			<td>to preserve fixed cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">32% Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:223px;">EMS</td>
			<td style="width:123px;">15714-S</td>
			<td>used to fix cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Pipes</td>
			<td style="width:223px;">EMS</td>
			<td style="width:123px;">19240</td>
			<td>used in PEM buffer for cell fixation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Anti-Myc Antibody</td>
			<td style="width:223px;">Drosophila Hybirdoma Bank</td>
			<td style="width:123px;">cat# 9E10</td>
			<td>used to dectect Fog-Myc&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">PhosphoSerine-19 antibody</td>
			<td style="width:223px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:123px;">3671</td>
			<td>antibody against phosphorylated regulatory light chain (RLC) serine 19</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">488-Phalloidin, 568-Phalloidin</td>
			<td style="width:223px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">A12379, A12380</td>
			<td>to stain for f-actin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hawk-VT multi-point array scanning confocal system&#160;</td>
			<td style="width:223px;">VisiTech International</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Used for live cell imaging of S2R+:Sqh cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Eclipse TE300 Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Used for live cell imaging of S2R+:Sqh cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a cell-based assay to investigate non-muscle myosin ii contractility via the folded-gastrulation signaling pathway in drosophila s2r+ cells

פיתחנו מבוססת-תא assay באמצעות תאים דרוזופילה זה recapitulates הפסגה לתעוקה שיזם מקופל gastrulation (ערפל), מורפוגן אפיתל המופרש. במהלך זה assay, ערפל משמש אגוניסט כדי להפעיל את רו דרך מפל איתות הכולל קולטן G-חלבון בשילוב (ערפל), חלבון12 – 13 Gα (מפוחית יד/Cta) ו- PDZ-מחשבים-המכילה גואנין נוקלאוטיד exchange פקטור (RhoGEF2). ערפל איתות תוצאות מהירה ודרמטית לארגונו מחדש של שלד התא אקטין כדי ליצור מחרוזת כויץ את הארנק. ערפל מסיס הוא שנאסף קו יציב תא ומוחלים ectopically S2R + תאים, המוביל שינויים מורפולוגיים כמו הכיווץ הפסגה, תהליך ציין במהלך תהליכים התפתחותיים כגון gastrulation. זה וזמינותו נוטה ההקרנה תפוקה גבוהה, באמצעות RNAi, יכול להקל על הזיהוי של גנים נוספים המעורבים במסלול זה.

S2 ו- S2:Fog-Myc התאים גדלו עד סמוך confluent תנאים בבקבוקון תרביות רקמה 150 ס מ2 ו שטופלו 25-75 מיקרומטר CuSO4 על פני תקופה של 24-48 שעות כדי לגרום ביטוי של ערפל-Myc (איור 2). דגימות תאים S2 (איור 2א) ו- S2:Fog-Myc תאים (איור 2B) הוסרו ו ערפל-Myc הייצור היה בפיקוח תספיג חלבון. כצפוי, נכשלנו לזהות ערפל-Myc בתקשורת שנקטפו מתאי S2 בשום תנאי. עם זאת, גילו ערפל בתקשורת שנקטפו את S2:Fog-Myc התא יציב קו מוקדם ככל 24 שעות לאחר אינדוקציה עם מיקרומטר 75 CuSO4. S2R + תאים מחוברת con A-מצופים תת מנות ביטוי מתויג EGFP תקינה אור בשרשרת (GFP-RLC) של שרירים שאינם צולבות הקישור חוטים שרירן II (דמויות 3A ו- 3B). בוצעה הדמיה לחיות תאים במיקרוסקופ הפוכה מצויד 100 X / 1.4 נה עדשה המטרה במהלך זלוף של מדיה ממוזגים ערפל. כ 5 דקות שלאחר הטיפול עם ערפל-Myc, ה-RLC נוצרו טבעות מעידה על שרירים שאינם צולבות הקישור חוטים שרירן II הכיווץ. טבעות אלו ניתן לצפות דרך immunostaining S2R + תאים עם נוגדן יותקף phosphopeptide סינתטי המתאים שאריות סביב Ser19 של האדם צולבות הקישור חוטים שרירן RLC (דמויות 4A , 4B). נוגדן זה cross-reacts עם דרוזופילה RLC.
יש לנו כאן דוגמה ייצוגית וזמינותו contractility הסלולר בעקבות טיפול 7 ימים של תאים עם שליטה RNAi dsRNA נגד Rho1 (דמויות 5A - 5E). S2R + תאים מצופים על קון-A-מצופה מנות תת, שטופלו ממוזגים ערפל (+ ערפל) מדיה או בקרת מדיה (-ערפל). מספר התאים מכווצים היו אז לכמת בעקבות קיבעון. הראשון קפלים צפוף שלב הכיווץ הייתה בולטת בתאים שליטה דלה שטופלו מדיה ממוזגים ערפל (איור 5B). איור 5C, מדולדל רו תאים שטופלו בינוני ממוזגים-S2 הם דוגמה טיפוסית של בעלות להב חלק, מטוגן-ביצה-כמו מורפולוגיה. שימו לב כי רו ממלא תפקיד מסלול איתות ערפל, וכן ציטוקינזה; לפיכך, תאים מדולדל רו לעיתים קרובות אינם מצליחים לחלק כראוי, מובילה לעלייה פלואידיות וגודל תא. טיפול של שליטה מדולדל תאים ממוזגים ערפל מדיה טיפוסי מוביל ל 30% - 50% של תאים שעברו הכיווץ, ואילו נכשלנו להתבונן לתעוקה משמעותית בתאים מדולדל רו.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58325/58325fig1.jpg"> איור 1:הערפל בשם איתות. בהיעדרו של ערפל, יחידת משנה12/13 Gα, מפוחית יד (Cta), יחד עם שותפיו איגוד Gϒ ו- Gβ, אינם פעילים המשויכים קולטני משותפת הערפל ואת הערפיח. ריק-8 מתלווה לשמור Cta ומסדיר לוקליזציה subcellular שלה. על ערפל מחייב, Cta disassociates מ Gϒ ו Gβ המתגייסים RhoGEF2 את קרום התא שבו זה מזרז את ההחלפה של התוצר המקומי הגולמי עבור GTP ב GTPase Rho1 קטן. GTP-מחויב Rho1, פעיל כעת, מפעיל קינאז רו (רוק), אשר phosphorylates ה-RLC של שרירים שאינם צולבות הקישור, מחוז חוטים שרירן, המוביל שלה הפעלה contractility הסלולר עוקבות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58325/58325fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58325/58325fig2.jpg"> איור 2 : הזמן-קורס הפקת ערפל-Myc. מראות אלה תא תרבות בינוני שנקטפו בקבוקון ליד של confluent 100% של תאים שליטה S2 (A) או S2:Fog (B)-Myc תאים יציב. התאים טופלו על-25-75 מיקרומטר CuSO4 על פני תקופה של 24-48 שעות. המדיום התרבות התאים שנאספו, מוכנים מרחביות-דף סופג המערבי. ערפל-Myc זוהה על ידי נוגדן אנטי-Myc. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58325/58325fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58325/58325fig3.jpg"> איור 3 : הדמיה לחיות תאים של הכיווץ ערפל-induced. יציב S2R + שורות תאים ביטוי מתויג EGFP ה-RLC של שרירים שאינם צולבות הקישור חוטים שרירן II היו עם תמונה על ידי סחף-שדה מיקרוסקופיה קונפוקלית במהלך זלוף של מדיה ממוזגים ערפל. הזמן מוצג דקות ושניות. (א) לוח זה מראה תמונה של מטוס מוקד בקרבת הממשק תא-coverslip בזמן 0:00 לפני זלוף של ערפל-Myc. (B) לוח זה מציג סידרת זמן (0:30-10:00) של תמונות שצולמו מטוס מוקד בסמוך לחלקו העליון של התא. החצים הלבנים מציינים לארגונו מחדש של השרירים שאינם צולבות הקישור חוטים שרירן II כפי שמציין EGFP-RLC לטבעות כויץ בזמן הכיווץ. סרגל קנה מידה הוא 10 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58325/58325fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58325/58325fig4.jpg"> איור 4 : Phosphorylated-ה-RLC. רגישה טבעות כויץ בעקבות אינדוקציה של הכיווץ ערפל-Myc. S2R + התאים היו קבועים, צבעונית אקטין באמצעות phalloidin (אדום), ה-RLC באמצעות נוגדן phosphoserine-19 (ירוק) phosphorylated של דאפי (DNA, כחול), בעקבות טיפול עם שליטה () או (B) מדיה ערפל-Myc-ממוזגים. שימו לב לארגונו מחדש של phosphorylated RLC לטבעות על התוספת של ערפל-Myc. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58325/58325fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58325/58325fig5.jpg"> איור 5 : נציג כימות וזמינותו ערפל-induced contractility הסלולר. S2R + תאים טופלו שליטה (A ו- B) RNAi או dsRNA (C ו- D) נגד GTPase Rho1 קטן במשך 7 ימים. בעקבות הפעם, התאים מצופים על קון-A-מצופה מנות תת וטופלו עם מדיה בקרה (A ו- C) או ערפל-Myc-ממוזגים מדיה (B ו- D). קנה המידה של בר מייצג 10 מיקרומטר. (E) של פיזור מגרש מציין את מרווחי הביטחון mean ו 95% של השבר תאים ומתפשט לכל תנאי. נקודות בודדות לייצג את השבר של תאים ומתפשט לכל שדה הראיה בהגדלה X 40 (10-120 תאים לכל שדה) ואת המספרים בסוגריים מציינים שהמספר הכולל של תאים נחשבו תאים מכווצים והן שאינו מתכווץ נפרד מעל שלוש RNAi ניסויים. הכוכביות מציינות הבדל משמעותי סטטיסטית בין תנאי RNAi, ערפל-שטופלו כפי שנקבע על ידי חד-כיווני אנובה (p < 0.0001) עם ניתוח השוואה פוסט הוק מרובים של Tukey. שימו לב כי היה הבדל משמעותי סטטיסטית (נ. ס) בין דגימות שטופלו Rho1 RNAi מטופלים עם שליטה או עם מדיה ערפל-Myc-ממוזגים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58325/58325fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Cell-based Assay to Investigate Non-muscle Myosin II Contractility via the Folded-gastrulation Signaling Pathway in Drosophila S2R+ Cells at JoVE.com

A Cell-based Assay to Investigate Non-muscle Myosin II Contractility via the Folded-gastrulation Signaling Pathway in Drosophila S2R+ Cells

כאן נתאר וזמינותו contractility באמצעות דרוזופילה S2R + תאי. היישום של ליגנד אקסוגני, gastrulation מקופל (ערפל), מוביל ההפעלה של הערפל איתות contractility מסלול וסלולר. Assay זה יכול לשמש כדי לחקור ברגולציה של חלבונים contractility הסלולר בערפל איתות.

וזמינותו מבוססת תא לחקור שרירים שאינם צולבות הקישור חוטים שרירן II Contractility ויה gastrulation מקופל איתות לשביל בתאים S2R + דרוזופילה

We have developed a cell-based assay using Drosophila cells that recapitulates apical constriction initiated by folded gastrulation (Fog), a secreted ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

A Cell-based Assay to Investigate Non-muscle Myosin II Contractility via the Folded-gastrulation Signaling Pathway in Drosophila S2R+ Cells

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

באמצעות ניתוח של Confocal<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; לחקירת מאפננים של עירובים מורפוגן Wnt וששש

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Loss- ו-של-פונקצית רווח גישה לחקר תא מוקדם קובעי גורל preimplantation עכבר עובר

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

שיטות לבדיקת בלוטת לימפה hemocytes ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; זחלים

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics

בניית מודלים אלמנטים סופיים לחקור ביומכניקה לסת דג הזברה

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical ...

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

5-mc נקודה כתם Assay לכמת את מתילציה DNA רמת Chondrocyte Dedifiationiation<em&gt; במבחנה</em

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

ניתוח Immunofluorescent מכתים של פטריות הגוף והנפש ומה קולט אור נוירונים במוח למבוגרים דרוזופילה melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation

מבוסס רנקל אוסטאוקלסט תרבות וזמינותו של העכבר מח העצם כדי לחקור את התפקיד של mTORC1 במבנה אוסטאוקלסט

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

היישום של RNAi חום-הלם-induced בביטוי פקטור שעתוק כדי לתכנת בתאי הנבט את הנוירונים C . elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

ניתוח חישובית של Germline Caenorhabditis elegans ללמוד הפצה של גרעינים, חלבונים ו את שלד התא

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

HUVEC Tube-formation Assay to Evaluate the Impact of Natural Products on Angiogenesis

מערכת שפופרת HUVEC להערכת השפעת מוצרים טבעיים על אנגיוגנזה

Angiogenesis is a phenomenon that includes different processes, such as endothelial cell proliferation, differentiation, and migration, that lead to the ...