Name: a cell-based assay to investigate non-muscle myosin ii contractility via the folded-gastrulation signaling pathway in drosophila s2r+ cells
Uploaded: 2018-08-19T15:00:00
Duration: 7 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Cell-based Assay to Investigate Non-muscle Myosin II Contractility via the Folded-gastrulation Signaling Pathway in Drosophila S2R+ Cells at JoVE.com

Los autores desean agradecer a miembros del laboratorio de Rogers y el laboratorio de Applewhite, Greta Glover y los estudiantes en el curso de biología celular de Reed College primavera 2018, que han contribuido al desarrollo de este protocolo. Además, los autores desean agradecer a miembros del laboratorio de Ritz para lectura y edición de este manuscrito. Investigación en esta publicación fue apoyada por la National Science Foundation bajo el número de concesión 716964 a D.A.A. y A.R. y el Departamento de Biología de la Universidad de Reed.

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Aquí, presentamos un protocolo detallado para un análisis de la contractilidad celular utilizando una línea de celular del cultivo de tejidos Drosophila (S2R + células), que se somete constricción II de miosina no musculares como respuesta a niebla de señalización. Este análisis es útil para investigar el camino de la niebla, así como mecanismos que regulan la contractilidad del músculo no miosina II.
Consideraciones del cultivo celular: Las condiciones bajo cuales S2R + se mantienen las células es fundamental para lograr datos confiables de este ensayo. Al momento de realizar el análisis de la contractilidad, lo mejor mantener las células S2R + en escudo y cantó M3 medio insectos. Mientras que las células S2R + pueden prosperar en otros medios de cultivo de células de insecto (por ejemplo, medio insectos SF900 o Schneider), a menudo pierden su capacidad de respuesta a la niebla. S2R + células que tienen un número de paso alta, generalmente más de 20-25 pasajes, empiezan a perder sensibilidad a ARNi. Es mejor usar células de paso temprano para todos los experimentos. Otro aspecto importante a los experimentos de RNAi agotamiento es escoger los controles adecuados. Controles negativos comunes incluyen dsRNA dirigido a EGFP o pBlueScript, ni de que tienen homología con el genoma de la mosca. Dirigidos a las proteínas en el camino de la niebla (Rho, Rok, etc.), que, cuando agota, evitar la activación de la contractilidad de la miosina no muscular, son también útiles controles. S2:Fog-células Myc pueden mantenerse en un medio de cultivo celular alternativo como SF900 complementado con 100 unidades/mL de penicilina, estreptomicina 100 en μg/mL, y 0.25 anfotericina B. Nota que FBS es no requiere cultivo de células en SF900. Densidad celular también es un componente crítico para todos los aspectos de las células de cultivo tisular de Drosophila . A diferencia de las células de cultivo de tejidos de mamíferos, Drosophila-cultivo de tejidos derivados de células prosperan mejor bajo mayores densidades de células (densidad no inferior a 5 x 105 células/mL). Sin embargo, al realizar este análisis, es fundamental que las células no se platean con-A-revestida con fondo de cristal platos por encima de 80% de confluencia, como la cuantificación de los contratados y no contratados células será extremadamente tediosa.
Aspectos críticos y alternativas de la prueba de la contractilidad celular: La producción de niebla, el ligando que desencadena la contractilidad de la miosina no muscular II, es un componente clave de este ensayo. El niebla gen codifica una proteína de 730 aminoácidos con un peso molecular predicho de ~ 78 kDa26. Análisis de la hidropatía reveló un tramo de 12 residuos hidrofóbicos en el amino-terminus que podría funcionar como una secuencia de la señal de secreción de niebla. Además, la secuencia de codificación también contiene múltiples sitios de glicosilación potenciales N - y O-linked, sugiriendo además que la niebla es una proteína secretada26. En apoyo de esto, niebla fue localizada en vesículas secretoras en células epidérmicas presuntos sometidos a constricción apical16. Expresión de niebla-Myc fue inducida con adición de sulfato de cobre al medio, y anticuerpos contra niebla o Myc reconocieron una proteína de 150 kD de medio de cultivo cosechado de cultivos inducidos pero no de la inducida por los medios de comunicación de las células S2 falta la construcción de la niebla-Myc. Este peso molecular fue más alto que el predicho peso molecular de 80 kD de la niebla y sugiere que la maquinaria secretora de las células S2 puede glycosylate la proteína antes de la exocitosis. Debido a la variabilidad potencial en la purificación de la niebla, es recomendable utilizar el mismo lote de medios condicionados de niebla para todos los experimentos. Fabricación de grandes lotes de concentrados medios de niebla-Myc ayudará a mantener la consistencia a través de rondas de experimentos.
El éxito de este ensayo depende también con confianza, identificar las células que han sido sometidos a constricción. Mientras que se pueden observar células estrechas por microscopía de fluorescencia, mediante tinción para actina o miosina no muscular II, la forma más segura para identificar y cuantificar células estrechas es mediante contraste de fase o microscopio DIC. Cuenta exacta puede lograrse utilizando 20 X - 40 aumentos en la mayoría de los microscopios ópticos. Aunque el protocolo escrito aquí utiliza platos con fondo de cristal, el ensayo puede realizarse también usando cubreobjetos de vidrio 1.5 estándar revestido con c. La adición de la niebla puede hacer en 35 mm de cultivo de tejidos en un cubreobjetos a parafilm, para limitar la cantidad de niebla utilizada para cada ensayo. La calidad de la fijación es un componente crítico de la prueba, como las células mal fijas pueden llevar a falsos positivos. Utilizando solución de fijación fresco y asegurándose de que las células nunca seco fijadas una vez conducirá a resultados más confiables. Finalmente, es importante contar un gran número de células. Por lo general, sólo el 30% - 50% de tratamiento o control células tratadas con ARNi constricción después de la perfusión de la niebla. Sin embargo, existe un nivel basal de constricción que se produce en las células S2R +, así que un gran número de células es necesario para asegurar que cualquier cambio en la fracción de células estrechas es debido a los tratamientos. Además, el agotamiento de algunas proteínas implicadas en la regulación de la contractilidad de la miosina no muscular II puede producir hiper-contractilidad, incluso en la ausencia de niebla. Los datos presentados aquí son más de 3.600 células que fueron contadas en tres sucesivos tratamientos de RNAi usando el mismo lote de medios condicionados de niebla.
Aplicaciones del análisis de la contractilidad celular: Este análisis de la contractilidad, cuando está juntado con RNAi, los métodos de detección ofrece un potente sistema para estudiar la señalización de las células, la morfogénesis y la contractilidad celular. Previamente, se ha utilizado para identificar a uno de dos receptores Co de niebla21. Una pantalla específica de 138 G-proteína-juntó los receptores (GPCRs) se agota por RNAi en células de S2R +, y su capacidad para responder a niebla fue analizado como se describe en el protocolo presentado aquí. De los 138 GPCRs, un solo gen previamente desacostumbrada, ahora conocido como niebla, fue descubierto. Más investigación sobre la función de niebla demostró que no sólo era necesaria para la contractilidad celular inducida por la niebla en S2R + células, pero también es esencial para la gastrulación en el desarrollo de Drosophila21. Además, este análisis fue utilizado para demostrar que Ric-8, un GEF no canónico, es también un componente en la niebla señalización vía27. Una serie de experimentos de RNAi de epistasis juntada con el análisis de la contractilidad demostró que Ric-8 interacciona con la subunidad de12/13 de Gα Cta y funciones para localizar dentro de la célula, que es fundamental para la contractilidad celular inducida por la niebla31 .
Cultivo de tejidos de Drosophila es idóneo para principiantes, como las células se mantienen fácilmente a temperatura ambiente, no requieren CO2 o tamponado con medio de cultivo celular y son robustas como se mantienen densidades de cultivo celular adecuado. El análisis de la contractilidad celular fue realizado con éxito por la sección de laboratorio de un curso de biología celular Licenciatura, donde los estudiantes no tenían poca o ninguna experiencia con células de cultivo o microscopia. El análisis de la contractilidad celular presentado aquí representa una herramienta poderosa, basada en la célula que puede ser empleada en el descubrimiento de genes o para interrogar la niebla vía de señalización, nos ayuda a mejor comprender procesos de desarrollo, como la constricción apical y contractilidad de músculo no miosina II, en general.

Estudios de la embriogénesis conducido organismos modelo genética han sido inestimables para nuestra comprensión de cómo las células se montan en los tejidos. Estudios de la Drosophila melanogaster, en particular, han llevado a la identificación de genes clave y principios biológicos que dirigen la morfogénesis y el desarrollo de los organismos desde la fecundación hasta la edad adulta1,2 , 3. Paralelamente a la investigación genética realizada con Drosophila, líneas de cultivo de células derivadas de tejidos de la mosca de la fruta también han emergido como un poderoso sistema para abordar una amplia gama de molecular y biológico celular preguntas4, 5 , 6. las células de cultivo tisular de drosophila tienen mínimos requisitos de mantenimiento, ya que son cultivados a temperatura ambiente y sin CO2. Como tal, son susceptibles de proyección de imagen de alta resolución, y tienen un alto grado de susceptibilidad a la inhibición de genes de ARNi6,7. Muchos grupos han utilizado las células de cultivo tisular de Drosophila como una herramienta para descubrir genes implicados en la definición de forma de la célula, citoesqueleto dinámica, viabilidad, fagocitosis y señal transduction pathways4,8, 9,10,11. Cuando se empleó como modelo junto con el animal entero, líneas de células de Drosophila cultivadas ofrecen un conjunto de enfoques muy complementarios que acelerar la identificación de moléculas importantes para el desarrollo y proporcionar un marco en el que se determinar sus funciones mecánicas12. Aquí, describimos un ensayo basado en células para estudiar las vías de señalización que provocan constricción apical mediante la gastrulación doblado (niebla) vía13,14. Este análisis de la contractilidad celular permite a los investigadores a investigar tanto la niebla señalización de vía y los mecanismos moleculares que regulan la contractilidad del músculo no miosina II.
Gastrulación del embrión temprano de Drosophila se ha estudiado durante muchos años como un modelo genético para la morfogénesis epitelial y el celular transición de epitelial a la identidad de células mesenquimales. Uno de los eventos clave de la gastrulación es la morfogénesis de un subconjunto de las células epiteliales a lo largo de la embrionaria línea media ventral desde columnar a piramidal en forma15,16,17,18. Esta forma de la célula simple cambiar resultados en la internalización de las células mesodérmicas presuntos y es conducido por la actividad motora de la miosina no muscular II constricting la actina red16,19,20. Décadas de la investigación genética ha identificado los componentes moleculares de esta vía y se colocan secuencialmente en el siguiente orden: 1) niebla es secretada desde el dominio apical de las células epiteliales en la línea media ventral; 2) niebla se une a los receptores Co g-proteína-juntados, niebla y Smog y señala a través de un heterotriméricas G-proteína compleja que contiene la subunidad Gα de12/13 Concertina (Cta), que es acompañada por el Ric no canónico de GEF-8; 3) Cta activa un factor de intercambio del nucleótido guanina y RhoGEF2, que a su vez activa la pequeña proteína G Rho1; 4) Rho1 activa Rho cinasa (Rok); 5) Rok activa contractilidad II de miosina no muscular en el dominio apical mediante la fosforilación de la cadena ligera reguladora (RLC), así produciendo constricción apical (figura 1)15,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29. Mutaciones en varios de estos componentes interfieran el gastrulation normal y otros movimientos morfogenéticos, incluyendo la formación del disco de ala y las glándulas salivales, lo que indica que esta vía se utiliza en varias etapas de Drosophila embriogénesis de31,de30,32. El camino de la niebla es uno de los modelos mejor estudiados para formar epitelio y ha proporcionado penetraciones importantes en cómo a nivel de tejido morfogénesis es regulado de transcripción genética, basada en el citoesqueleto de la célula movimientos14,15 ,21.
Hemos desarrollado un análisis de la contractilidad celular que recoge muchas de las respuestas celulares aguas abajo de la niebla que se han observado en el desarrollo de embriones de mosca17. Hemos diseñado un S2 estable línea celular que expresa la niebla con la etiqueta en su c-terminal con myc bajo el control de un promotor inducible metallothionine que puede ser cosechado en la adición de sulfato de cobre (CuSO4) al medio. Cuando los medios condicionados de niebla ectópicamente a receptores S2 + (S2R +) las células, que son una sublínea de S2 células distinguidas por su expresión diferencial de receptores como subunidades freido y integrin, las células experimentan una reorganización de la citoesqueleto de constricción apical12,17,27,33. Estos cambios se pueden observar por microscopía de contraste de fase en que niebla tratamiento conduce a la aparición de volantes de fase oscura indicativas de un aumento del radial en la contractilidad del músculo no miosina II, o por microscopía de fluorescencia donde niebla tratamiento conduce a la formación de la miosina no muscular II anillos en las células que expresan EGFP-tagged RLC34. Estos anillos contienen una cadena ligera reguladora miosina fosforilada (pRLC) visible mediante inmunotinción23,34,35. Esta respuesta inducida por la niebla requiere Cta, RhoGEF2, Rho y Rok; así, usando recombinante niebla-Myc y S2R + células, hemos establecido a fin de investigar la constricción inducida por la niebla en un sistema basado en la cultura de tejido24,25,34.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1159px;" width="1157">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">S2R+ cells</td>
			<td style="width:223px;">Drosophila Genomics Resorce Center&#160;</td>
			<td style="width:123px;">150</td>
			<td style="width:496px;">cell culture line, undergoes apical constriciton</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">S2:Fog-myc cells</td>
			<td style="width:223px;">Drosophila Genomics Resorce Center&#160;</td>
			<td>218</td>
			<td>cell culture line, produces Fog-myc under pMT promoter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">S2R+ :Sqh-EGFP cells</td>
			<td style="width:223px;">Drosophila Genomics Resorce Center&#160;</td>
			<td>196</td>
			<td>cell culture line, stably expresses Sqh(RLC of non-muscle myosin II) tagged with EGFP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Shield and Sang M3</td>
			<td style="width:223px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">S3652</td>
			<td>cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">SF900 insect medium</td>
			<td style="width:223px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>12658019</td>
			<td>alternative cell cutlure medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Schneider&#8217;s insect medium</td>
			<td style="width:223px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>21720024</td>
			<td>alternative cell cutlure medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:223px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>16000044</td>
			<td>media supplement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td style="width:223px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>15240112</td>
			<td>antimicrobial/antifugal media supplement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Concanavalin A</td>
			<td style="width:223px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:123px;">150710</td>
			<td>used to coat dishes and coverslip for cellular adhesion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Glass bottom plates</td>
			<td style="width:223px;">Maktek</td>
			<td style="width:123px;">P35G-1.5-10</td>
			<td>used for assay and for fixing and staining cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Glass cover slips</td>
			<td style="width:223px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">2940-225</td>
			<td>alternative to glass bottom dishes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Protein concentrators</td>
			<td style="width:223px;">Millipore</td>
			<td style="width:123px;">UFC903008</td>
			<td>30,000 molecular weight cutoff, used to concentrate media</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:317px;">25 cm2, 75 cm2, 150 cm2 tissue culture flasks</td>
			<td style="width:223px;">Genessee</td>
			<td style="width:123px;">25-204,25-206,25-208,25-210</td>
			<td>used to culture cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">6-well and 12-well tissue culture dishes</td>
			<td style="width:223px;">Genessee</td>
			<td style="width:123px;">25-105, 25-106</td>
			<td>used to culture cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Flourescent mounting medium</td>
			<td style="width:223px;">Dako</td>
			<td style="width:123px;">S3023</td>
			<td>to preserve fixed cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">32% Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:223px;">EMS</td>
			<td style="width:123px;">15714-S</td>
			<td>used to fix cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Pipes</td>
			<td style="width:223px;">EMS</td>
			<td style="width:123px;">19240</td>
			<td>used in PEM buffer for cell fixation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Anti-Myc Antibody</td>
			<td style="width:223px;">Drosophila Hybirdoma Bank</td>
			<td style="width:123px;">cat# 9E10</td>
			<td>used to dectect Fog-Myc&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">PhosphoSerine-19 antibody</td>
			<td style="width:223px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:123px;">3671</td>
			<td>antibody against phosphorylated regulatory light chain (RLC) serine 19</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">488-Phalloidin, 568-Phalloidin</td>
			<td style="width:223px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">A12379, A12380</td>
			<td>to stain for f-actin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hawk-VT multi-point array scanning confocal system&#160;</td>
			<td style="width:223px;">VisiTech International</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Used for live cell imaging of S2R+:Sqh cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Eclipse TE300 Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Used for live cell imaging of S2R+:Sqh cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a cell-based assay to investigate non-muscle myosin ii contractility via the folded-gastrulation signaling pathway in drosophila s2r+ cells

Hemos desarrollado un ensayo celular utilizando células de Drosophila que recapitula la constricción apical iniciada por gastrulación doblado (niebla), un morfógeno secretado epitelial. En este ensayo, la niebla se utiliza como un agonista para activar Rho a través de una cascada de señalización que incluye un receptor g-proteína-juntado (niebla), una proteína Gα de12/13 (Concertina/Cta) y que contiene el dominio PDZ Guanina Nucleótido cambio factor (RhoGEF2). Resultados de señalización en la reorganización del citoesqueleto de actina para formar una cadena del monedero contráctil rápida y dramática de la niebla. Niebla soluble es recogido de una línea celular estable y aplicado ectopically S2R + células, conduciendo a cambios morfológicos como la constricción apical, un proceso observado durante procesos de desarrollo como gastrulación. Este ensayo es favorable a la proyección de alto rendimiento y con RNAi, puede facilitar la identificación de genes adicionales implicados en esta vía.

S2 y S2:Fog-Myc células crecieron a cerca de condiciones confluentes en un matraz de cultivo de tejido de 150 cm2 y fueron tratadas con 25-75 μm CuSO4 durante un periodo de 24-48 horas para inducir la expresión de niebla-Myc (figura 2). Muestras de células de S2 (figura 2A) y S2:Fog-se retiraron células Myc (figura 2B) y producción de niebla-Myc fue supervisado por western blot. Como era de esperar, no pudimos detectar niebla-Myc en los medios de comunicación de células S2 bajo cualquier condición. Sin embargo, detectamos niebla en medio de la S2:Fog-línea de Myc celular estable tan pronto como 24 horas después de la inducción con 75 μm CuSO4. Células de S2R + a con A recubierto con fondo de cristal platos expresando una etiquetado EGFP regulador cadena ligera (GFP-RLC) de la miosina no muscular II (figuras 3A y 3B). Proyección de imagen de células vivas se realizó en un microscopio invertido, dotado de 100 X / 1.4 NA objetivo durante la perfusión de medios condicionados de niebla. Aproximadamente 5 minutos después del tratamiento con niebla-Myc, el RLC formado anillos de constricción II de miosina no muscular. Estos anillos pueden observarse a través de immunostaining S2R + células con un anticuerpo contra un fosfopéptidos sintético correspondiente a residuos que rodean Ser19 de miosina humana RLC (figuras 4A y 4B). Este anticuerpo cross-reacts con Drosophila RLC.
Aquí tenemos un ejemplo representativo del análisis de la contractilidad celular siguiendo un tratamiento de 7 días de células con control ARNi y dsRNA contra Rho1 (figuras 5A - 5E). S2R + células fueron plateadas con-A-revestida con fondo de cristal platos y tratados con niebla-condicionada (+ niebla) los medios de comunicación o medios de control (-niebla). Luego se cuantificó el número de células contratados después de la fijación. El indicativo de fase densa volantes de constricción era prominente en las células control agotado tratadas con medios condicionados de niebla (figura 5B). En la figura 5C, Rho-agotado las células tratadas con medio S2-condicionados son un ejemplo típico de la morfología con bordes lisos, forma de huevo frito. Tenga en cuenta que Rho juega un papel en la vía de señalización de niebla, así como en la citocinesis; así, las células Rho-agotado a menudo no se divide correctamente, provocando un aumento en el tamaño celular y ploidía. Tratamiento de control de las células agotadas con medios condicionados de niebla típicas lleva a 30% - 50% de las células que experimentan la constricción, considerando que no pudimos observar la constricción importante en células Rho-agotado.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58325/58325fig1.jpg"> Figura 1:la supuesta niebla señalización vía. En la ausencia de niebla, la subunidad Gα de12/13 , Concertina (Cta), junto con sus socios de la Unión Gϒ y Gβ, son inactivos y asociada a los receptores de la niebla y Smog. Ric-8 Cta de chaperonas y regula su localización subcelular. Sobre niebla vinculante, Cta disassociates de Gϒ y Gβ reclutas RhoGEF2 a la membrana celular que cataliza el intercambio del PIB para el GTP en el GTPase Rho1 pequeño. Rho1 GTP-limite, ahora activa, activa Rho cinasa (Rok), que fosforila el RLC de la miosina no muscular, llevando a su activación y la contractilidad celular subsecuente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58325/58325fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58325/58325fig2.jpg"> Figura 2 : Tiempo-curso de producción de niebla-Myc. Estos paneles muestran el medio de cultivo celular de un frasco confluente cerca de 100% de las células del control S2 (A) o (B) S2:Fog-células estables Myc. Las células fueron tratadas con 25-75 μm CuSO4 durante un periodo de 24-48 horas. El medio de cultivo celular fue recogido y preparado para SDS-PAGE y western blot. Niebla-Myc fue detectado por un anticuerpo anti-Myc. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58325/58325fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58325/58325fig3.jpg"> Figura 3 : Proyección de imagen de células vivas de la constricción inducida por la niebla. Estable S2R + líneas celulares que expresan EGFP-tagged RLC de la miosina no muscular II fue reflejada por microscopía confocal de barrido de campo durante la perfusión de medios condicionados de niebla. Tiempo se muestra en minutos y segundos. (A) este panel muestra una imagen de un plano focal cerca de la interfaz del celular-cubreobjetos en el tiempo 0:00 antes de la perfusión de niebla-Myc. (B) este panel muestra una serie de tiempo (0:30-10:00) de imágenes tomadas en un plano focal en la parte superior de la célula. Las flechas blancas indican la reorganización de la miosina no muscular II según lo indicado por EGFP-RLC en anillos contráctiles durante la constricción. La barra de escala es 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58325/58325fig3large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58325/58325fig4.jpg"> Figura 4 : RLC fosforilada se localiza a anillos contráctiles por inducción de constricción de niebla-Myc. S2R + células eran fijos y manchadas de actina mediante phalloidin (rojo), fosforilada RLC usando un anticuerpo de la fosfoserina 19 (verde) y DAPI (DNA, azul), después del tratamiento con (A) o (B) medios de niebla-Myc-condicionada. Tenga en cuenta la reorganización del RLC fosforilada en aros sobre la adición de la niebla-Myc. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58325/58325fig4large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58325/58325fig5.jpg"> Figura 5 : Representante de cuantificación del ensayo contractilidad celular inducida por la niebla. S2R + las células trataron con control (A y B) ARNi o dsRNA (C y D) contra el GTPase Rho1 pequeño durante 7 días. Después de este tiempo, las células fueron plateadas con-A-revestida con fondo de cristal platos y trataron con los medios de control (A y C) o medios (B y D) niebla-Myc-condicionada. La escala de la barra representa 10 μm. (E) A diagrama de dispersión indica las media y el 95% intervalos de confianza de la fracción de células contratadas por condición. Los puntos individuales representan la fracción de células contratadas por campo de visión con 40 aumentos (10-120 células por campo) y los números entre paréntesis indican que el número total de células contado por células contratadas y no contratadas se separa en tres Experimentos de RNAi. Asteriscos denotan una diferencia estadísticamente significativa entre tratados de RNAi y de niebla condiciones según lo determinado por ANOVA de una vía (p < 0.0001) con análisis de post hoc de comparación múltiple de Tukey. Tenga en cuenta que no hubo diferencias estadísticamente significativas (n.s.) entre tratados con ARNi Rho1 muestras tratadas con control o con niebla-Myc-condicionado de los medios de comunicación. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58325/58325fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Cell-based Assay to Investigate Non-muscle Myosin II Contractility via the Folded-gastrulation Signaling Pathway in Drosophila S2R+ Cells at JoVE.com

A Cell-based Assay to Investigate Non-muscle Myosin II Contractility via the Folded-gastrulation Signaling Pathway in Drosophila S2R+ Cells

Aquí describimos un análisis de la contractilidad con Drosophila S2R + células. La aplicación de un ligando exógeno, gastrulación doblado (niebla), conduce a la activación de la contractilidad celular y la vía de señalización de niebla. Este ensayo puede utilizarse para investigar la regulación de las proteínas de la contractilidad celular en la vía de señalización de niebla.

Un ensayo basado en células para investigar la miosina no muscular II contractilidad a través de la gastrulación doblado señalización camino en Drosophila S2R + células

We have developed a cell-based assay using Drosophila cells that recapitulates apical constriction initiated by folded gastrulation (Fog), a secreted ...

Research

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