Name: a cell-based assay to investigate non-muscle myosin ii contractility via the folded-gastrulation signaling pathway in drosophila s2r+ cells
Uploaded: 2018-08-19T15:00:00
Duration: 7 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Cell-based Assay to Investigate Non-muscle Myosin II Contractility via the Folded-gastrulation Signaling Pathway in Drosophila S2R+ Cells at JoVE.com

Författarna vill tacka medlemmarna i Rogers labbet och Applewhite labbet, Greta Glover och studenterna i Reed Akademins våren 2018 cellulära biologi kurs, som har bidragit till utvecklingen av detta protokoll. Författarna vill dessutom tacka medlemmarna i Ritz lab för noggrant läsa och redigera Detta manuskript. Forskning som redovisas i denna publikation stöddes av National Science Foundation award nummer 716964 D.A.A. och A.R. och Reed College biologi institutionen.

1. underhåll av Drosophila vävnadsodling celler
<ol><li>Underhålla S2R +, S2R +: RLC-andra och S2:Fog-Myc celler vid rumstemperatur, helst mellan 20 ° C och 25 ° C, i skölden och sjöng M3 insekt medium kompletteras med 10% fetalt bovint serum, 100 enheter/mL av penicillin, 100 µg/mL streptomycin och 0,25 amfotericin B på en densitet inte lägre än 5 x 105 celler/mL. Obs: Lägre cell tätheter leda till döden.</li>
	<li>Snabbt Tina cryo-bevarade injektionsflaskor av celler och överföra dem till en vävnadskultur kolv. Börja med en liten vävnadsodling kolv (12,5 cm2 eller 25 cm2) i en volym på 4-5 mL cellodlingsmedium tills kulturen är etablerad och tecken på celldöd på grund av upptining har avtagit. Obs: Tecken på celldöd på grund av upptining inkluderar icke-anhängare celler som saknar en slät, rundad form och små mörka bitar av cellulära skräp i det vävnadsodling medium vägledande av nekrotiska celler.</li>
	<li>Långsamt skala upp storleken på vävnadskultur genom att låta cellerna att växa ostört i flera dagar (4-8 d) till 100% konfluens, där det finns lite till ingen utrymmet mellan cellerna och de börjar stapla upp på en annan. Överföra alla celler från denna 100% konfluenta mindre 12,5 cm2 eller 25 cm2 kolv till en större vävnadsodling kolv (av 75 cm2) kompletteras med 10 mL cellodlingsmedium. Obs: Att behålla cellerna i en 75 cm2 kolv kommer att ge tillräckligt med celler för de flesta experiment.</li>
	<li>Passagen cellerna varje 3-4 d genom pipettering i cellodlingsmedium upp och ner, använder det för att få bort någon löst följs celler från vävnadsodling plasten. Överför detta medium, som nu innehåller återsuspenderade celler, i en färsk kolv. Späd cellerna 1:4 med färska cellodlingsmedium med varje passage och upprepa vid behov.</li>
</ol>2. RNAi behandling av Drosophila S2R + celler
Obs: Se Rogers och Rogers6 för detaljerade instruktioner om hur att producera dsRNA passar insekt kultur.
<ol><li>Överföra S2R + celler till en 6-väl eller 12-brunn vävnadsodling tallrik med en täthet som är gynnsam för livskraft, inte är lägre än 5 x 105 celler/mL, med komplett sköld och sjöng M3 cell Odlingsmedier för RNAi behandlingar.</li>
	<li>Arbetar i en vävnadskultur huva, ta bort den gamla cellodlingsmedium genom att försiktigt luta 6-väl eller 12-brunn vävnadsodling plattan och aspirera i cellodlingsmedium med en pipett. Snabbt ersätta denna gamla cellodlingsmedium med 1 mL av färska cellodlingsmedium med pipett det till varje brunn. Obs: Detta kan ske utan betydande förlust efter cellerna har tillåtits att löst följa för 30-45 min före utbyta cellodlingsmedium.</li>
	<li>Tillsätt 10 µg/mL dsRNA som har genererats efter det detaljerade protokollet i Rogers och Rogers6 av pipettering det direkt i vävnadsodling medlet av varje brunn celler per RNAi skick.</li>
	<li>Upprepa proceduren dagligen, ersätta cellodlingsmedium med 1 mL färsk medium och 10 µg/mL dsRNA per RNAi skick. Obs: RNAi experimenten vanligtvis utförs för 7 d; den exakta tidpunkten är dock beroende av protein omsättningen och effekten av dsRNA. RNAi behandlingar så kort som 3 d bryter effektivt ned cellerna av vissa proteiner, medan andra mål kräver längre behandlingar6.</li>
</ol>3. dimma produktion och skörd
<ol><li>Skala upp tillväxten av S2:Fog-Myc celler genom att låta dem växa ostört för 4-8 d att erhålla en nästan 100% konfluenta 75 cm2 kolv av celler i 10 mL av cell odlingsmedium (eller alternativt en 150 cm2 kolv i 20 mL cellodlingsmedium) till maxi Mize dimma produktion.</li>
	<li>Tillsätt 50 µL av 100 mM CuSO4 (eller 100 µL av 100 mM CuSO4 för en 150 cm2 kolv) till nästan 100% konfluenta 75 cm2 kolven för induktion av metallothionine arrangören. Inkubera i 48 h i rumstemperatur.</li>
	<li>Ta bort Fog-Myc-innehållande mediet från vävnadsodling kolven genom pipettering och överföra den till en 15 mL eller 50 mL koniska rör. Centrifugera vid 2500 x g vid 4 ° C i 10-15 min att rensa medlet av celler och cellulära skräp.</li>
	<li>Överföra clearade cell mediet till en ny konisk tub och underhålla det på is. Arbeta i omgångar, överföra 5 mL av rensat medium till 15 mL 3 000 MW koncentratorer med regenererad cellulosa membran och centrifugera det 2500 x g vid 4 ° C i 30 min i taget, att koncentrera sig på medellång. Obs: Alternativt en koncentrator med en större volymkapacitet kan vara begagnade (50 mL). Under koncentration, kommer att en mörkare färgade medium, som är berikad med dimma, börja bygga upp längst ned i det V-formade filtret.</li>
	<li>Infoga pipettspetsen längst ned på ”V” av anrikningsverket och ta bort mörkare färgade materialet mellan varje omgång av centrifugering och överföra den till en färsk 1,7 mL mikrofugrör. Upprätthålla media på isen.</li>
	<li>Använda samma anrikningsverket, upprepa steg 3,4 och 3,5 genom att ta bort den mörka färgat koncentrerad dimma-Myc media och ersätta den med mer precleared medium, tills medlet har koncentrerats till 1/10 av dess ursprungliga volym (dvs, det 1 mL från 10 mL utgångsmaterial).</li>
	<li>Lagra den koncentrerad dimma-Myc vid 4 ° C. Obs: Efter lagring, vara säker på att övervaka för bakteriell kontamination, följd av längre perioder av lagring.</li>
	<li>Utföra SDS-PAGE genom att blanda 10 µL av koncentrerad dimma-Myc medium med 10 µL av denatureringen SDS-innehållande buffert att bilda en lysate. Kör SDS-PAGE gelen vid 35 mA för ca 1 h. överföra gelen till ett nitrocellulosa membran (eller alternativt en PVDF membran) för 1 h vid 120 mA. Utföra en western blot med någon kommersiellt tillgänglig Myc-antikroppen för att upptäcka ett 150-kDa band. Obs: Koncentrationen av Fog-Myc i konditionerat mediet kan variera per batch. Det är inte nödvändigt att bestämma den exakta koncentrationen av Fog-Myc för att utföra analysen, men effekten av varje parti bör testas innan du utför ett experiment.</li>
	<li>Följande steg 3,1-3,2, förbereda kontroll S2-villkorade media genom att samla 10 mL cellodlingsmedium från en nästan 100% konfluenta 75 cm2 kolv med S2 celler (eller alternativt 20 mL från en 150 cm2 kolv) av pipettering. Överföra kontrollen S2 cellodlingsmedium till ett färskt 15 mL eller 50 mL koniska rör.</li>
	<li>Följande steg 3.4-3.7, rensa den lysate celler och cellulära skräp genom centrifugering (vid 2500 x g vid 4 ° C i 30 min i taget) och sedan överföra den rensade cellen lysate till koncentratorer och centrifugera dem för att koncentrera kontroll mediet i omgångar till 1/10th den ursprungliga volymen. Obs: Tillämpningen av S2-villkorade media inte leder till betydande cell kontraktilitet i analysen.</li>
	<li>Lagra koncentrerad S2 kontroll media vid 4 ° C i flera månader. Obs: Efter lagring, vara säker på att övervaka för föroreningen.</li>
</ol>4. beredning av Concanavalin-A-belagd glasbotten rätter och plätering av S2R + celler
<ol><li>Gör 10 mL av concanavalin en (con A) lösning genom upplösning 5 mg con A i 10 mL vatten för en slutlig koncentration på 0,5 mg/mL. Alikvotens denna lösning i bekvämare volymer (500 µL 1 ml) och lagra den på-20 ° C.</li>
	<li>Förbereda 35 mm glasbotten rätter genom beläggning glas portion av varje maträtt med 200 µL av con A lösningen och inkubera rätter för ca 2 min i rumstemperatur i en vävnadskultur huva. Nästa, ta bort alla de con en lösning (som kan sparas och återanvändas för framtida experiment) och låt disken lufttorka helt. ANTECKNINGAR: Rätter kan tillagas i stora serier och kan lagras i upp till 6 månader i en torr plats såsom en lab bänk låda.</li>
	<li>Tillsätt cirka 2 mL färsk cell kultur media till varje glasbotten maträtt. Att resuspendera cellerna S2R + ska testas av analysen av pipettering i cellodlingsmedium upp och ner, använder det för att lossa någon löst vidhäftande celler.</li>
	<li>Överföra de återsuspenderade S2R +-cellerna till 35 mm glasbotten rätter som innehåller den fräscha cellodlingsmedium så de är mellan 50-70% konfluenta. Kontrollera cell densiteten under mikroskopet vävnadskultur genom fokusering upp och ned genom flera slätten av cellerna upphängd på medellång till få en uppskattning av antalet celler. Obs: Genom trial and error, den lämpliga djurtäthet celler krävs för att uppnå 50% - 70% konfluens kan uppnås.</li>
	<li>Att cellerna att bifoga till con-A-belagd glasbotten rätter för 45-60 min. Obs: Fullt bifogade S2R + celler visas 'stekt-ägg-liknande,' tillplattad och fas-mörk.</li>
</ol>5. effekt Test av Fog-villkorade Medium och cellulära kontraktilitet analysen
<ol><li>Om du vill bekräfta avkastningen av Fog-Myc produceras och koncentrerade från S2:Fog-Myc Stabil celler linjer av SDS-PAGE och western blotting. Tillsätt 10 µL av SDS-innehållande prov buffert till 10 µL av koncentrerad dimma-Myc och koka det för 5 min. följer standard SDS-PAGE och western blotting protokoll och blot för anti Myc bekräfta dimma-Myc produktion.</li>
	<li>Ta bort alla sköld och sjöng M3 medium från de bifogade S2R +-cellerna från steg 4,3 genom försiktigt pipettering och tillsätt försiktigt tillbaka 75 µL av färska sköld och Sang medium att begränsa mängden dimma-villkorade medium som används.</li>
	<li>Tillsätt 75 µL av Fog-villkorade media till glas delen av glasbotten skålen från steg 5.2 att föra den totala volymen till 150 µL, i förhållandet 1:1 av Fog-villkorade media Shield och sjöng M3 media. Obs: En total volym på 150-200 µL behövs för att helt täcka glas delen av en typisk glasbotten maträtt; Detta beror dock på måtten på glasbotten skålen används.</li>
	<li>Övervaka kontraktiliteten av cellerna med faskontrast mikroskopi med 20 X eller 40 X förstoring för att iaktta ett helt fält av celler. Spåra morfologi av celler och leta efter det alternerande mönstret av fas mörka och fas ljus rufsa vägledande av formförändringen. Obs: Tillämpningen av dimma leder vanligtvis till 30% - 50% av S2R + celler som genomgår cellulära sammandragning, och efter 10 min, cellerna börjar slappna av, återvänder till sin mjuka kanter, stekt-ägg-liknande morfologi.</li>
	<li>Övervaka robustheten av den cellulära kontraktiliteten. Om cellssvar är mycket stark med förhållandet 1:1 på Fog-villkorade medelstora färska sköld och Sang medium, minska mängden dimma-villkorade medium för att bevara det koncentrerad dimma-Myc-mediet för framtida experiment. Använd outspädd dimma-villkorade medel om förhållandet 1:1 inte leder till robust cellulära sammandragning; generellt producerar ett förhållande av 1:3 tillräckligt svar att framgångsrikt genomföra experimentet. Obs: När lämpliga förhållandet på Fog-villkorade medelstora färska sköld och Sang medium är etablerad tanke batch av Fog-villkorade medium, använda detta förhållande för alla andra experiment.</li>
	<li>Övervaka icke-muskel myosin II dynamics under cellulära kontraktilitet analysen med hjälp av den stabila S2R + cellinje som uttrycker GFP-märkta reglerande ljusslinga (S2R +: Sqh-andra).</li>
	<li>Med etablerade förhållandet av Fog-villkorade medium till färska sköld och sjöng M3 medium från steg 5,2-5,5, ta bort cell-odlade medium med en pipett och lägga tillbaka färska sköld och Sang medium i vydelen glas inglasad botten skålen. BEGJUTA dimma-villkorade medium på förutbestämda förhållandet medan förvärva en bildsekvens av levande celler; ta hand om inte flytta glasbotten skålen under perfusionen.</li>
</ol>6. fastställande och färgning av förträngda S2R +-celler
<ol><li>Fixa S2R + celler med en 10% PARAFORMALDEHYD lösning i PEM buffert (100 mM rör, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl2, pH 6,9). Obs: PEM buffert görs normalt vid 2 x stamlösning och kan lagras i månader vid 4 ° C.</li>
	<li>Ta bort cellodlingsmedium från dimma-behandlade S2R + celler genom pipettering och omedelbart ersätta det med 1,5-2,0 mL 10% PARAFORMALDEHYD. Inkubera i 15 min i rumstemperatur. Obs: Fast celler kan lagras i fixering lösning vid 4 ° C i flera dagar; Det är dock viktigt att de inledande 15-min fixeringen görs vid rumstemperatur före överföring cellerna till 4 ° C.</li>
	<li>Ta bort 10% PARAFORMALDEHYD lösningen genom pipettering och avyttra denna organiska avfall produkt ordentligt. Skölj cellerna av försiktigt pipettering 1,5-2,0 mL fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) till 35 mm glasbotten skålen. Ta bort den gamla PBS genom pipettering och ersätta det med 1,5-2,0 mL färsk PBS 2 x mer att ta bort kvarvarande fixering lösning. Obs: Det är viktigt att cellerna inte torkar ut från denna punkt på i protokollet.</li>
	<li>Blockera cellerna med cirka 200 µL 5% normala get serum utspätt i PBS som har kompletterats med 0,1% icke-joniskt rengöringsmedel (PBST) i 20 min i rumstemperatur. Obs: Normalt blockerande lösningar innehåller serum som matchar organismen sekundära antikropparna är uppvuxen i.</li>
	<li>Bered den primär antikropp genom att späda ut det i PBST. Använda en volym av ca 200 µL för att helt täcka glas delen av glasbotten skålen.<ol>
<li>Ta bort blockering lösningen genom pipettering och Lägg till primär antikropp lösningen direkt till glas delen av skålen. Inkubera i 1 h i rumstemperatur eller, alternativt, inkubera över natten vid 4 ° C.</li>
		<li>När ruvar över natten vid 4 ° C, Linda 35 mm glasbotten skålen med parafilm att förhindra avdunstning.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ta bort primär antikropp lösningen genom pipettering och skölj cellerna genom pipettering 1,5-2,0 mL färsk PBS till 35 mm glasbotten skålen. Ta bort PBS genom pipettering och ersätta det med 1,5-2,0 mL färsk PBS 2 x mer.</li>
	<li>Bered en lösning av sekundära antikroppar genom att späda ut det i PBST. En volym på 200 µL är lämpligt att bara täcka glas delen av skålen.<ol>
<li>Lägg till sekundära antikroppar lösningen direkt glas delen av skålen. Inkubera cellerna med sekundär antikropp lösning för 1 h i rumstemperatur eller över natten vid 4 ° C.</li>
		<li>Wrap 35 mm skålen med parafilm om ruvar över natten, för att förhindra avdunstning.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ta bort sekundär antikropp lösningen genom pipettering och skölj cellerna med PBS pipettering 1,5-2,0 ml av färska PBS till skålen. Ta bort den gamla PBS och ersätta det 2 x mer, efter samma förfarande.</li>
	<li>Bevara de fasta och färgade cellerna genom att lägga till nog av en anti fade fluorescerande monteringsmedium att täcka glas delen av glasbotten 35mm skålen.</li>
	<li>Lagra proverna vid 4 ° C och bort från ljuset. Obs: Fluorescerande signalen kommer långsamt sönderfalla under månaderna även om lagras på lämpligt sätt. För bästa resultat, bilden inom en vecka.</li>
</ol>7. imaging och kvantifiering av cellulära kontraktilitet analysens
<ol><li>Bilden fast S2R + celler som använder en standard inverterad ljusmikroskop med faskontrast, DIC eller fluorescens imaging funktioner. Med 20 X eller 40 X förstoring, fånga 10-30 kalkeras bildfält celler beroende på cell densiteten, med målet att förvärva bilderna av 200 eller fler celler per tillstånd.</li>
	<li>Använder en standard cellen räknare, räkna och registrera antalet kontrakterade (fas-mörk, motorhuv) och noncontracted celler per varje fält som fångas. Obs: Det är bäst att ha två forskare ta oberoende räkningarna av kontrakterade och noncontracted celler per fält, eller alternativt samma forskaren kan räkna fältet samma bild av celler tre gånger, vilket möjliggör ett genomsnittligt antal kontrakterade och noncontracted celler per fält ska beräknas.</li>
	<li>Förbereda rätter för flera con-A-belagd glasbotten per experimentella villkor som beskrivs i steg 4,2. Pipettera upp och ner i cellodlingsmedium att få bort löst vidhäftande S2R +: Sqh-andra celler och platta dem så de är 50-70% konfluenta i 35-mm glasbotten maträtter. Att cellerna att bifoga för 30-45 minuter.</li>
	<li>Den S2R +: Sqh-andra bildcellerna live med spinning-disk, svepte fältet confocal Mikroskop eller med hjälp av ljus-ark mikroskopi använda 60 X - 100 X förstoring. Ta bort alla sköld och sjöng M3 medium från glasbotten maträtt som innehåller bifogade S2R +: Sqh-andra celler.<ol>
<li>BEGJUTA förutbestämda förhållandet av Fog-Myc luftkonditionerade medium till färska sköld och sjöng M3 medium från steg 5,2-5,5 direkt på glas portion av glasbotten skålen med pipett, noga med att inte störa positionen för skålen på målet. Hämta bilder för 12-15 min för att fånga initiering och fullständig kontraktion av S2R +: Sqh-andra celler. Obs: Om färgning för icke-muskel myosin eller myosin-pRLC, bildandet av en stram myosin ring på ytan av celler är också vägledande för kontraktilitet. Om imaging S2R +: Sqh-andra celler live, den andra-taggade RLC kommer att bilda liknande tight ringar (se figur 3) tyder på kontraktilitet. Formförändringen som uppstår kommer att orsaka cellerna att ”bonnet”, tar upp 3D form; planet av fokus i mikroskopet kan behöva justeras för att spåra ändringen cell form. Under kontroll RNAi villkor, normalt 30-50% av cellerna genomgår sammandragning vid tillägg av dimma. Tänk på att vissa RNAi villkor kan leda till förträngning i avsaknad av dimma.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+tools+and+assays+for+the+study+of+human+diseases.">Drosophila tools and assays for the study of human diseases.</a> Disease Model Mechanisms. 9 (3), 235-244 (2016).</li><li>Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila,+the+golden+bug,+emerges+as+a+tool+for+human+genetics.">Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics.</a> Nature Reviews Genetics. 6 (1), 9-23 (2005).</li><li>Millburn, G. H., Crosby, M. A., Gramates, L. S., Tweedie, S., FlyBase, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FlyBase+portals+to+human+disease+research+using+Drosophila+models.">FlyBase portals to human disease research using Drosophila models.</a> Disease Model Mechanisms. 9 (3), 245-252 (2016).</li><li>Perrimon, N., Mathey-Prevot, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+high-throughput+RNA+interference+screens+to+problems+in+cell+and+developmental+biology.">Applications of high-throughput RNA interference screens to problems in cell and developmental biology.</a> Genetics. 175 (1), 7-16 (2007).</li><li>Currie, J. D., Rogers, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+the+Drosophila+melanogaster+D17-c3+cell+culture+system+to+study+cell+motility.">Using the Drosophila melanogaster D17-c3 cell culture system to study cell motility.</a> Nature Protocols. 6 (10), 1632-1641 (2011).</li><li>Rogers, S. L., Rogers, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+Drosophila+S2+cells+and+their+use+for+RNAi-mediated+loss-of-function+studies+and+immunofluorescence+microscopy.">Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence microscopy.</a> Nature Protocols. 3 (4), 606-611 (2008).</li><li>Applewhite, D. A., Davis, C. A., Griffis, E. R., Quintero, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+the+Cytoskeleton+Using+Live+and+Fixed+Drosophila+Tissue+Culture+Cells.">Imaging of the Cytoskeleton Using Live and Fixed Drosophila Tissue Culture Cells.</a> Methods Molecular Biology. 1365, 83-97 (2016).</li><li>Rogers, S. L., Wiedemann, U., Stuurman, N., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+requirements+for+actin-based+lamella+formation+in+Drosophila+S2+cells.">Molecular requirements for actin-based lamella formation in Drosophila S2 cells.</a> The Journal of Cell Biology. 162 (6), 1079-1088 (2003).</li><li>Yi, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+RNAi+screen+reveals+multiple+regulators+of+caspase+activation.">A genome-wide RNAi screen reveals multiple regulators of caspase activation.</a> The Journal of Cell Biology. 179 (4), 619-626 (2007).</li><li>Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+RNAi+screen+reveals+CD36+family+member+required+for+mycobacterial+infection.">Drosophila RNAi screen reveals CD36 family member required for mycobacterial infection.</a> Science. 309 (5738), 1251-1253 (2005).</li><li>Nir, O., Bakal, C., Perrimon, N., Berger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inference+of+RhoGAP/GTPase+regulation+using+single-cell+morphological+data+from+a+combinatorial+RNAi+screen.">Inference of RhoGAP/GTPase regulation using single-cell morphological data from a combinatorial RNAi screen.</a> Genome Research. 20 (3), 372-380 (2010).</li><li>Manning, A. J., Peters, K. A., Peifer, M., Rogers, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+epithelial+morphogenesis+by+the+G+protein-coupled+receptor+mist+and+its+ligand+fog.">Regulation of epithelial morphogenesis by the G protein-coupled receptor mist and its ligand fog.</a> Science Signaling. 6 (301), 98 (2013).</li><li>Leptin, M., Grunewald, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+shape+changes+during+gastrulation+in+Drosophila.">Cell shape changes during gastrulation in Drosophila.</a> Development. 110 (1), 73-84 (1990).</li><li>Leptin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrulation+movements:+the+logic+and+the+nuts+and+bolts.">Gastrulation movements: the logic and the nuts and bolts.</a> Developmental Cell. 8 (3), 305-320 (2005).</li><li>Martin, A. C., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical+constriction:+themes+and+variations+on+a+cellular+mechanism+driving+morphogenesis.">Apical constriction: themes and variations on a cellular mechanism driving morphogenesis.</a> Development. 141 (10), 1987-1998 (2014).</li><li>Dawes-Hoang, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=folded+gastrulation,+cell+shape+change+and+the+control+of+myosin+localization.">folded gastrulation, cell shape change and the control of myosin localization.</a> Development. 132 (18), 4165-4178 (2005).</li><li>Rogers, S. L., Wiedemann, U., H&#228;cker, U., Turck, C., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+RhoGEF2+associates+with+microtubule+plus+ends+in+an+EB1-dependent+manner.">Drosophila RhoGEF2 associates with microtubule plus ends in an EB1-dependent manner.</a> Current Biology. 14 (20), 1827-1833 (2004).</li><li>Coravos, J. S., Martin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical+Sarcomere-like+Actomyosin+Contracts+Nonmuscle+Drosophila+Epithelial+Cells.">Apical Sarcomere-like Actomyosin Contracts Nonmuscle Drosophila Epithelial Cells.</a> Developmental Cell. 39 (3), 346-358 (2016).</li><li>Mason, F. M., Tworoger, M., Martin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical+domain+polarization+localizes+actin-myosin+activity+to+drive+ratchet-like+apical+constriction.">Apical domain polarization localizes actin-myosin activity to drive ratchet-like apical constriction.</a> Nature Cell Biology. 15 (8), 926-936 (2013).</li><li>Fox, D. T., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abelson+kinase+(Abl)+and+RhoGEF2+regulate+actin+organization+during+cell+constriction+in+Drosophila.">Abelson kinase (Abl) and RhoGEF2 regulate actin organization during cell constriction in Drosophila.</a> Development. 134 (3), 567-578 (2007).</li><li>Manning, A. J., Rogers, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Fog+signaling+pathway:+insights+into+signaling+in+morphogenesis.">The Fog signaling pathway: insights into signaling in morphogenesis.</a> Developmental Biology. 394 (1), 6-14 (2014).</li><li>Xie, S., Mason, F. M., Martin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+G&#945;12/13+exacerbates+apical+area+dependence+of+actomyosin+contractility.">Loss of G&#945;12/13 exacerbates apical area dependence of actomyosin contractility.</a> Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3526-3536 (2016).</li><li>Vasquez, C. G., Tworoger, M., Martin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+myosin+phosphorylation+regulates+contractile+pulses+and+tissue+integrity+during+epithelial+morphogenesis.">Dynamic myosin phosphorylation regulates contractile pulses and tissue integrity during epithelial morphogenesis.</a> The Journal of Cell Biology. 206 (3), 435-450 (2014).</li><li>Parks, S., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+gastrulation+gene+concertina+encodes+a+G+alpha-like+protein.">The Drosophila gastrulation gene concertina encodes a G alpha-like protein.</a> Cell. 64 (2), 447-458 (1991).</li><li>Barrett, K., Leptin, M., Settleman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rho+GTPase+and+a+putative+RhoGEF+mediate+a+signaling+pathway+for+the+cell+shape+changes+in+Drosophila+gastrulation.">The Rho GTPase and a putative RhoGEF mediate a signaling pathway for the cell shape changes in Drosophila gastrulation.</a> Cell. 91 (7), 905-915 (1997).</li><li>Costa, M., Wilson, E. T., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+putative+cell+signal+encoded+by+the+folded+gastrulation+gene+coordinates+cell+shape+changes+during+Drosophila+gastrulation.">A putative cell signal encoded by the folded gastrulation gene coordinates cell shape changes during Drosophila gastrulation.</a> Cell. 76 (6), 1075-1089 (1994).</li><li>Peters, K. A., Rogers, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Ric-8+interacts+with+the+G&#945;12/13+subunit,+Concertina,+during+activation+of+the+Folded+gastrulation+pathway.">Drosophila Ric-8 interacts with the G&#945;12/13 subunit, Concertina, during activation of the Folded gastrulation pathway.</a> Molecular Biology of the Cell. 24 (21), 3460-3471 (2013).</li><li>Jha, A., van Zanten, T. S., Philippe, J. M., Mayor, S., Lecuit, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Control+of+GPCR+Organization+and+Signaling+by+Endocytosis+in+Epithelial+Morphogenesis.">Quantitative Control of GPCR Organization and Signaling by Endocytosis in Epithelial Morphogenesis.</a> Current Biology. 28 (10), 1570-1584 (2018).</li><li>Kerridge, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+activation+of+Rho1+by+GPCR+signalling+imparts+polarized+myosin+II+activation+during+morphogenesis.">Modular activation of Rho1 by GPCR signalling imparts polarized myosin II activation during morphogenesis.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 261-270 (2016).</li><li>Myat, M. M., Andrew, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+shape+in+the+Drosophila+salivary+gland+is+controlled+by+regulated,+sequential+internalization+of+the+primordia.">Organ shape in the Drosophila salivary gland is controlled by regulated, sequential internalization of the primordia.</a> Development. 127 (4), 679-691 (2000).</li><li>Kanesaki, T., Hirose, S., Grosshans, J., Fuse, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotrimeric+G+protein+signaling+governs+the+cortical+stability+during+apical+constriction+in+Drosophila+gastrulation.">Heterotrimeric G protein signaling governs the cortical stability during apical constriction in Drosophila gastrulation.</a> Mechanisms of Development. 130 (2-3), 132-142 (2013).</li><li>Nikolaidou, K. K., Barrett, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rho+GTPase+signaling+pathway+is+used+reiteratively+in+epithelial+folding+and+potentially+selects+the+outcome+of+Rho+activation.">A Rho GTPase signaling pathway is used reiteratively in epithelial folding and potentially selects the outcome of Rho activation.</a> Current Biology. 14 (20), 1822-1826 (2004).</li><li>Yanagawa, S., Lee, J. S., Ishimoto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+novel+line+of+Drosophila+Schneider+S2+cells+that+respond+to+wingless+signaling.">Identification and characterization of a novel line of Drosophila Schneider S2 cells that respond to wingless signaling.</a> Journal Biological Chemistry. 273 (48), 32353-32359 (1998).</li><li>Mason, F. M., Xie, S., Vasquez, C. G., Tworoger, M., Martin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RhoA+GTPase+inhibition+organizes+contraction+during+epithelial+morphogenesis.">RhoA GTPase inhibition organizes contraction during epithelial morphogenesis.</a> The Journal of Cell Biology. 214 (5), 603-617 (2016).</li><li>Martin, A. C., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsed+contractions+of+an+actin-myosin+network+drive+apical+constriction.">Pulsed contractions of an actin-myosin network drive apical constriction.</a> Nature. 457 (7228), 495-499 (2009).</li></ol>

Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.

Här presenterar vi ett detaljerade protokoll för en cell-baserad kontraktilitet analys med hjälp av en cellinje för Drosophila -vävnadskultur (S2R + celler), som genomgår en icke-muskel myosin II sammandragning som svar på dimma signalering. Denna analys är användbar för att undersöka den dimma väg, samt mekanismer som reglerar icke-muskel myosin II kontraktilitet.
Cell-odling överväganden: De villkor under vilka S2R + celler upprätthålls är avgörande för att uppnå tillförlitlig data från denna analys. När du planerar att utföra kontraktilitet analysen, det bästa att upprätthålla S2R + celler i sköld och sjöng M3 insekt medium. Medan S2R +-celler kan trivs i andra insekt cell kultur media (t.ex., SF900 eller Schneiders insekt medium), förlorar de ofta sin lyhördhet till Fog. S2R + celler som har en hög passage-nummer, i allmänhet mer än 20-25 passager, börjar förlora känslighet att RNAi. Det är bäst att använda tidig-passage celler för alla experiment. En annan viktig aspekt att RNAi utarmning experiment är att välja lämpliga kontroller. Gemensamma negativa kontroller inkluderar dsRNA riktar sig till andra eller pBlueScript, varken av som har homologi att flyga genomet. Inriktning proteiner i dimma väg (Rho, Rok, etc.), som, när utarmat, förhindra aktivering av icke-muskel myosin kontraktilitet, är också användbara kontroller. S2:fog-Myc celler kan bibehållas i en alternativa cellodlingsmedium såsom SF900 kompletteras med 100 enheter/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, och 0,25 amfotericin B. Observera att FBS krävs inte när odling av celler i SF900. Cell densiteten är också en viktig komponent till alla aspekter av Drosophila vävnadsodling celler. Till skillnad från däggdjur vävnadsodling celler, Drosophila-härledda vävnadsodling cellerna trivs bäst under högre cell tätheter (densiteter inte lägre än 5 x 105 celler/mL). Men, när du utför detta test, det är kritiskt att cellerna inte är klädd på con-A-belagd glasbotten rätter ovan 80% confluence, som kvantifiering av kontrakterade kontra icke-kontrakterade celler blir extremt tråkiga.
Kritiska aspekter och alternativa metoder för cellulära kontraktilitet analysen: Produktionen av dimma, liganden som utlöser icke-muskel myosin II kontraktilitet, är en nyckelkomponent i denna analys. Den dimma genen kodar ett protein av 730 aminosyror med en förutsedd molekylvikt av ~ 78 kDa26. Hydropathy analys visade på en sträcka av 12 hydrofoba rester på Fog's amino-terminus som kunde fungera som en sekretion signal sekvens. Kodande sekvens innehåller dessutom också flera platser för potentiella N - och O-länkade glycosylation, ytterligare föreslår Fog är en utsöndrade proteinet26. Till stöd för detta, var dimma lokaliserad till sekretoriska vesikler i presumtiva epidermala celler som genomgår apikala sammandragning16. Dimma-Myc uttryck förmåddes vid tillägg av kopparsulfat till medium och antikroppar mot dimma eller Myc igen ett 150-kD protein från odlingssubstratet skördas från inducerade kulturer men inte från inducerad media från S2 celler saknar den Fog-Myc-konstruktionen. Detta molekylvikt var högre än den förutspådda 80-kD molekylvikten av dimma och föreslår att sekretoriska S2 celler kan det glycosylate proteinet innan exocytos. På grund av det potentiella variabilitet i dimma rening är det lämpligt att använda samma parti av Fog-villkorade media för alla experiment. Att göra upp stora partier av koncentrerad dimma-Myc media hjälper att upprätthålla konsekvens i hela rundor av experiment.
Framgången för denna analys beror också på att tryggt identifiera celler som har genomgått sammandragning. Medan förträngda celler kan observeras genom fluorescensmikroskopi, genom färgning för aktin eller icke-muskel myosin II, är det mest tillförlitliga sättet att identifiera och kvantifiera förträngda celler genom faskontrast eller DIC mikroskopi. Exakt antal kan uppnås med 20 X - 40 X förstoring på de flesta vanliga ljus Mikroskop. Även om protokollet skriven här använder glasbotten rätter, kan analysen också utföras med hjälp av standard 1,5 glas coverslips belagd med con A. Tillägg av Fog kan göras i 35 mm av vävnadsodling på ett täckglas placeras på parafilm, för att begränsa mängden Fog används för varje analys. Kvaliteten på fixering är en kritisk komponent i analysen, som dåligt fast celler kan leda till falskt positiva. Använder färska fixering lösning och se till att kommer att cellerna aldrig torr en gång fast leda till mer tillförlitliga resultat. Slutligen är det viktigt att räkna ett stort antal celler. Vanligtvis endast 30% - 50% av obehandlade eller kontroll RNAi-behandlade celler tygla efter perfusionen i dimma. Det finns dock en basal nivå av sammandragning som uppstår i S2R + celler, så ett stort antal celler som behövs för att säkerställa att varje förändring i fraktionen av förträngda celler beror på behandlingar. Utarmning av vissa proteiner som är involverade i regleringen av icke-muskel myosin II kontraktilitet kan dessutom leda till hyper-kontraktilitet, även i avsaknad av dimma. De data som presenteras här är från över 3 600 celler som räknades i tre successiva RNAi behandlingar med samma parti av Fog-villkorade media.
Tillämpningar av cellulära kontraktilitet analysen: Denna kontraktilitet analys, när den kombineras med RNAi screening metoder erbjuder ett kraftfullt system för att studera cellsignalering, morfogenes och cellulära kontraktilitet. Tidigare, det har använts för att identifiera en av två dimma samtidig receptorer21. En riktad skärm av 138 G-proteinkopplade receptorer (varandra) är slut av RNAi i S2R + celler och dess förmåga att bemöta dimma var analyseras som beskrivs i det protokoll som presenteras här. Av de 138 varandra, en enda, avslöjades tidigare uncharacterized gen, som nu kallas dimma. Ytterligare utredning av funktionen av Mist visade att inte bara krävdes det för Fog-inducerad cellulära kontraktilitet i S2R +-celler, men det var också viktigt för gastrulation utveckla Drosophila21. Dessutom användes denna analys som visar att Ric-8, en icke-kanoniska GEF, är också en komponent i dimman signalering väg27. En serie epistasis RNAi experiment tillsammans med kontraktilitet analys visat att Ric-8 interagerar med Gα12/13 subenhet Cta och funktioner för att lokalisera den i cellen, som är kritisk till Fog-inducerad cellulära kontraktilitet31 .
Drosophila vävnadsodling är väl lämpad för nybörjare, som cellerna är lätt upphäll vid rumstemperatur, kräver inte CO2 eller buffrat cellodlingsmedium och är robusta så länge rätt cell kultur tätheter bibehålls. Cellulära kontraktilitet analysen utfördes framgångsrikt av avsnittet laboratorium i en grundutbildningsprogram cellbiologi kurs, där eleverna hade liten till ingen erfarenhet av odling av celler eller mikroskopi. Cellulära kontraktilitet analysen presenteras här representerar ett kraftfullt och cell-baserat verktyg som kan användas i gen upptäckt, eller för att förhöra dimman signalering utbildningsavsnitt, hjälper oss att bättre förstå utvecklingsprocesser, såsom apikala sammandragning och icke-muskel myosin II kontraktilitet, i allmänhet.

Studier av embryogenes utförts med genetiska modellorganismer har visat sig vara ovärderligt för vår förståelse av hur celler är monterade i vävnader. Studier av Drosophila melanogaster, i synnerhet, har lett till identifiering av viktiga gener och biologiska principer som styr morfogenes och utveckling av organismer från befruktning till vuxenlivet1,2 , 3. parallellt med den genetiska forskningen med Drosophila, odlade cellinjer som härstammar från bananflugan vävnader har också framkommit som ett kraftfullt system att hantera ett brett utbud av molekylära och cell biologiska frågor4, 5 , 6. drosophila vävnadsodling celler har minimala krav på underhåll, eftersom de är odlade i rumstemperatur och utan CO2. Som sådan, de är mottagliga för högupplösta imaging, och de har en hög grad av känslighet för genen hämning av RNAi6,7. Många grupper har använt Drosophila vävnadsodling celler som ett verktyg för att upptäcka gener involverade i att definiera cell form, cytoskeletal dynamics, livskraft, fagocytos och signaltransduktion vägar4,8, 9,10,11. När anställd som modell tillsammans med hela djuret, erbjuder odlade Drosophila cell lines en uppsättning mycket kompletterande metoder att påskynda identifieringen av molekyler som är viktiga för att utveckla och tillhandahålla en ram för att Bestäm deras mekanistiska roller12. Här beskriver vi en cell-baserad analys för att studera de signalvägar som utlöser apikala sammandragning via den vikta-gastrulation (dimma) väg13,14. Denna cell-baserad kontraktilitet analys tillåter forskare att undersöka båda dimman signalering utbildningsavsnitt och de molekylära mekanismer som reglerar icke-muskel myosin II kontraktilitet.
Gastrulation tidiga Drosophila embryot har studerats under många år som en genetisk modell för den epiteliala morfogenes och cellulära övergången från epitelial till mesenkymala cellidentiteten. En av de viktigaste händelserna av gastrulation är morfogenes av en delmängd av epitelceller längs embryonala ventrala mittlinjen från columnar till pyramidal form15,16,17,18. Denna enkla cell formen ändra resultatet i internalisering av de presumtiva mesodermala cellerna och drivs av den motoriska aktiviteten av icke-muskel myosin II bromsande aktin nätverk16,19,20. Årtionden av genetisk forskning har identifierat molekylära komponenterna i denna väg och sekventiellt har placerat dem i följande ordning: 1) dimma utsöndras från domänen apikala av epitelceller vid ventrala mittlinjen; (2) dimma binder till G-protein-kopplade samtidig receptorer, dimma och Smog, och signaler via en heterotrimeric G-protein komplex som innehåller den Gα12/13 subuniten Concertina (Cta), som är chaperoned av den icke-kanoniska GEF Ric-8; (3) Cta aktiverar en guanin nukleotid exchange faktor, RhoGEF2, som i sin tur aktiverar de små G-protein-Rho1; (4) Rho1 aktiverar Rho kinase (Rok); (5) Rok aktiverar icke-muskel myosin II kontraktilitet på den apikala domänen genom fosforylering av den reglerande ljusslinga (RLC), sålunda producerande apikala sammandragning (figur 1)15,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29. Mutationer i flera av dessa komponenter störa den normala gastrulation och andra morphogenetic rörelser, däribland bildandet av wing skivan och saliv-körtlar, som visar att denna väg används i flera skeden av Drosophila embryogenes30,31,32. Dimma smittvägen är en av de bäst studerade modellerna för epitelial forma och har gett viktiga insikter i hur vävnad-nivå morfogenes regleras från gentranskription till cytoskelettet-driven cell rörelser14,15 ,21.
Vi utvecklade en cellbaserade kontraktilitet analysmetod som recapitulates många av de cellulära svar nedströms av dimma som har observerats i utveckla flyga embryon17. Vi konstruerade en stabil S2 cellinje som uttrycker dimma taggade på sitt C-terminus med myc under kontroll av en inducerbara metallothionine arrangören som kan skördas vid tillägg av kopparsulfat (CuSO4) till medium. När dimman-villkorade media appliceras ectopically på S2 receptorer + (S2R +) celler, som är en subrad S2 celler kännetecknas av deras differentiell uttryck av receptorer såsom Frizzled och integrin subenheter, cellerna genomgår en omorganisation av den cytoskelettet starkt påminner av apikala sammandragning12,17,27,33. Dessa förändringar kan observeras genom faskontrast mikroskopi i vilken dimma behandling leder till uppkomsten av fas-dark volanger vägledande av en radiell ökning i icke-muskel myosin II kontraktilitet eller genom fluorescensmikroskopi där dimma behandling leder till den bildandet av icke-muskel myosin II ringar i celler som uttrycker andra-taggade RLC34. Dessa ringar innehåller en myosin-fosforyleras reglerande ljusslinga (pRLC) synlig via immunfärgning23,34,35. Denna dimma-inducerad svar krävs Cta, RhoGEF2, Rho och Rok; Således har använder rekombinant dimma-Myc och S2R + celler, vi etablerat ett sätt att undersöka dimma-inducerad sammandragning i en vävnad-kultur-baserat system24,25,34.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1159px;" width="1157">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">S2R+ cells</td>
			<td style="width:223px;">Drosophila Genomics Resorce Center&#160;</td>
			<td style="width:123px;">150</td>
			<td style="width:496px;">cell culture line, undergoes apical constriciton</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">S2:Fog-myc cells</td>
			<td style="width:223px;">Drosophila Genomics Resorce Center&#160;</td>
			<td>218</td>
			<td>cell culture line, produces Fog-myc under pMT promoter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:317px;">S2R+ :Sqh-EGFP cells</td>
			<td style="width:223px;">Drosophila Genomics Resorce Center&#160;</td>
			<td>196</td>
			<td>cell culture line, stably expresses Sqh(RLC of non-muscle myosin II) tagged with EGFP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Shield and Sang M3</td>
			<td style="width:223px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">S3652</td>
			<td>cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">SF900 insect medium</td>
			<td style="width:223px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>12658019</td>
			<td>alternative cell cutlure medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Schneider&#8217;s insect medium</td>
			<td style="width:223px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>21720024</td>
			<td>alternative cell cutlure medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:223px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>16000044</td>
			<td>media supplement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td style="width:223px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>15240112</td>
			<td>antimicrobial/antifugal media supplement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Concanavalin A</td>
			<td style="width:223px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:123px;">150710</td>
			<td>used to coat dishes and coverslip for cellular adhesion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Glass bottom plates</td>
			<td style="width:223px;">Maktek</td>
			<td style="width:123px;">P35G-1.5-10</td>
			<td>used for assay and for fixing and staining cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Glass cover slips</td>
			<td style="width:223px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">2940-225</td>
			<td>alternative to glass bottom dishes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Protein concentrators</td>
			<td style="width:223px;">Millipore</td>
			<td style="width:123px;">UFC903008</td>
			<td>30,000 molecular weight cutoff, used to concentrate media</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:317px;">25 cm2, 75 cm2, 150 cm2 tissue culture flasks</td>
			<td style="width:223px;">Genessee</td>
			<td style="width:123px;">25-204,25-206,25-208,25-210</td>
			<td>used to culture cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">6-well and 12-well tissue culture dishes</td>
			<td style="width:223px;">Genessee</td>
			<td style="width:123px;">25-105, 25-106</td>
			<td>used to culture cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Flourescent mounting medium</td>
			<td style="width:223px;">Dako</td>
			<td style="width:123px;">S3023</td>
			<td>to preserve fixed cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">32% Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:223px;">EMS</td>
			<td style="width:123px;">15714-S</td>
			<td>used to fix cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Pipes</td>
			<td style="width:223px;">EMS</td>
			<td style="width:123px;">19240</td>
			<td>used in PEM buffer for cell fixation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Anti-Myc Antibody</td>
			<td style="width:223px;">Drosophila Hybirdoma Bank</td>
			<td style="width:123px;">cat# 9E10</td>
			<td>used to dectect Fog-Myc&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">PhosphoSerine-19 antibody</td>
			<td style="width:223px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:123px;">3671</td>
			<td>antibody against phosphorylated regulatory light chain (RLC) serine 19</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">488-Phalloidin, 568-Phalloidin</td>
			<td style="width:223px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">A12379, A12380</td>
			<td>to stain for f-actin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hawk-VT multi-point array scanning confocal system&#160;</td>
			<td style="width:223px;">VisiTech International</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Used for live cell imaging of S2R+:Sqh cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:317px;">Eclipse TE300 Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Used for live cell imaging of S2R+:Sqh cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a cell-based assay to investigate non-muscle myosin ii contractility via the folded-gastrulation signaling pathway in drosophila s2r+ cells

Vi har utvecklat en cell-baserad analys använder Drosophila celler som recapitulates apikala sammandragning initierats av vikta gastrulation (dimma), en utsöndrade epitelial morphogen. I denna analys används Fog som en agonist för att aktivera Rho genom en signalering kaskad som inkluderar en G-protein-kopplade receptor (dimma), ett Gα12/13 protein (Concertina/Cta), och en PDZ-domän-innehållande guanin nukleotid exchange faktor (RhoGEF2). Dimma signalering resulterar i snabba och dramatiska omorganiseringen av aktin cytoskelettet att bilda en kontraktila handväska sträng. Lösliga dimma samlas in från en stabil cellinje och tillämpas ectopically på S2R + celler, vilket leder till morfologiska förändringar som apikala sammandragning, en process som observerats under utvecklingsprocesser såsom gastrulation. Denna analys är mottagliga för high-throughput screening och, med hjälp av RNAi, kan underlätta identifiering av ytterligare gener involverade i denna väg.

S2 och S2:Fog-Myc celler odlades till nära konfluenta villkor i en 150 cm2 vävnadsodling kolv och behandlades med 25-75 µM CuSO4 under en period på 24-48 timmar att framkalla uttryck för Fog-Myc (figur 2). Prover från S2 celler (figur 2A) och S2:Fog-Myc celler (figur 2B) togs bort och dimma-Myc produktion övervakades av western blot. Som förväntat, misslyckats vi med att upptäcka dimma-Myc i media som skördas från S2 celler under alla förhållanden. Dock gjorde vi upptäcka dimma i media som skördats från S2:Fog-Myc Stabil cellinje så tidigt som 24 timmar efter induktion med 75 µM CuSO4. S2R + celler bifogas con-A-belagd glasbotten rätter att uttrycka ett andra-taggade reglerande ljusslinga (GFP-RLC) av icke-muskel myosin II (siffror 3A och 3B). Live-cell imaging utfördes på ett inverterat Mikroskop utrustat med en 100 X / 1.4 objektiv NA under perfusionen i dimma-villkorade media. Cirka 5 minuter efter behandling med Fog-Myc, RLC bildade ringar vägledande av icke-muskel myosin II sammandragning. Dessa ringar kan observeras genom immunfärgning S2R + celler med en antikropp mot ett syntetiskt phosphopeptide som motsvarar rester kring Ser19 av mänskliga myosin RLC (figurerna 4A och 4B). Denna antikropp cross-reacts med Drosophila RLC.
Här har vi ett representativt exempel på cellulära kontraktilitet analysen efter en 7-dagars behandling av celler med kontroll RNAi och dsRNA mot Rho1 (siffror 5A - 5E). S2R + celler var klädd på con-A-belagd glasbotten rätter och behandlade med Fog-villkorade (+ dimma) media eller kontroll media (-Fog). Antalet kontrakterade celler kvantifierades sedan efter fixering. Fas-tät volanger vägledande av sammandragning var framstående i kontroll utarmat celler behandlas med Fog-villkorade media (figur 5B). I figur 5Cär Rho-utarmat celler behandlas med S2-villkorade medium ett typiskt exempel på mjuka kanter, stekt-ägg-liknande morfologi. Observera att Rho spelar en roll i den dimma signalvägen samt cytokines; Således, Rho-utarmat celler ofta inte korrekt dividera, leder till en ökad Cellstorlek och ploiditeten. Behandling av kontroll utarmat celler med Fog-villkorade media typiska leder till 30% - 50% av celler som genomgår sammandragning, medan vi har åsidosatt betydande förträngning i Rho-utarmat celler.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58325/58325fig1.jpg"> Figur 1:förmodade dimman signalering utbildningsavsnitt. I avsaknad av dimma, den Gα12/13 subuniten, Concertina (Cta), tillsammans med dess bindande partner Gϒ och Gβ, är inaktiva och associerade med samtidig receptorerna Mist och Smog. Ric-8 chaperones Cta och reglerar dess subcellulär lokalisering. Vid dimma bindande, Cta disassociates från Gϒ och Gβ rekryterar RhoGEF2 till cellmembranet där det katalyserar utbyte av BNP för GTP i de små GTPase Rho1. GTP-bundna Rho1, nu aktiv, aktiverar Rho Kinase (Rok), som phosphorylates RLC av icke-muskel myosin, leder till dess aktivering och efterföljande cellulära kontraktilitet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58325/58325fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58325/58325fig2.jpg"> Figur 2 : Tid-jaga av Fog-Myc produktion. Dessa paneler Visa cellodlingsmedium skördas från en nära 100% konfluenta kolven (A) kontroll S2 celler eller (B) S2:Fog-Myc Stabil celler. Cellerna som behandlades med 25-75 µM CuSO4 under en period på 24-48 timmar. Cellodlingsmedium samlades in och förberett för SDS-PAGE och western blotting. Dimma-Myc upptäcktes av en anti Myc-antikropp. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58325/58325fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58325/58325fig3.jpg"> Figur 3 : Live-cell avbildning av Fog-inducerad sammandragning. Stabil S2R + cellinjer som uttrycker andra-taggade RLC av icke-muskel myosin II var fotograferad av svepte fältet konfokalmikroskopi under perfusionen i dimma-villkorade media. Tiden visas i minuter och sekunder. (A) denna panel visar en bild av ett fokalplan nära gränssnittet cell-täckglas på tiden 0:00 innan perfusionen i dimma-Myc. (B) denna panel visar en tidsserie (0:30-10:00) av bilder tagna på ett fokalplan nära toppen av cellen. De vita pilarna visar omorganiseringen av icke-muskel myosin II som indikeras av andra-RLC i kontraktila ringar under sammandragning. Skalstapeln är 10 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58325/58325fig3large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58325/58325fig4.jpg"> Figur 4 : Fosforyleras-RLC lokaliserar till kontraktila ringar efter induktion av sammandragning av Fog-Myc. S2R + celler var fixeras och färgas för aktin använder phalloidin (röd), fosforylerade RLC använder en phosphoserine-19 antikropp (grön) och DAPI (DNA, blå), efter behandling med (A) kontroll eller (B), Fog-Myc-villkorade media. Observera omorganiseringen av fosforylerade RLC i ringar vid tillägg av Fog-Myc. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58325/58325fig4large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58325/58325fig5.jpg"> Figur 5 : Representativ kvantifiering av Fog-inducerad cellulära kontraktilitet analysens. S2R + celler behandlades med (A och B) kontroll RNAi eller (C och D) dsRNA mot de små GTPase Rho1 i 7 dagar. Efter denna tid, cellerna var klädd på con-A-belagd glasbotten rätter och behandlades med (A och C) kontroll media eller (B och D) dimma-Myc-villkorade media. Skala bar representerar 10 µm. (E) A spridningsdiagram visar medelvärde och 95% konfidensintervallen för fraktionen av kontrakterade celler per tillstånd. Enskilda punkter representerar fraktionen av kontrakterade celler per synfält på 40 X förstoring (10-120 celler per fält) och siffrorna inom parentes anger det totala antalet celler räknas för både avtalade och icke-kontrakterade celler över tre separata RNAi experiment. Asterisker betecknar en statistiskt signifikant skillnad mellan RNAi - och dimma-behandlade villkor som bestäms av envägs ANOVA (p < 0,0001) med Tukeys flera jämförelse post hoc analys. Observera att det fanns ingen statistiskt signifikant skillnad (n.s.) mellan Rho1 RNAi-behandlade prover behandlade med kontroll eller med Fog-Myc-villkorade media. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58325/58325fig5large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Cell-based Assay to Investigate Non-muscle Myosin II Contractility via the Folded-gastrulation Signaling Pathway in Drosophila S2R+ Cells at JoVE.com

A Cell-based Assay to Investigate Non-muscle Myosin II Contractility via the Folded-gastrulation Signaling Pathway in Drosophila S2R+ Cells

Här beskriver vi en kontraktilitet analysen använder Drosophila S2R + celler. Tillämpningen av en exogen ligand, vikta gastrulation (dimma), leder till aktivering av dimman signalering utbildningsavsnitt och cellulära kontraktilitet. Denna analys kan användas för att undersöka reglering av cellulära kontraktilitet proteiner i dimman signalering utbildningsavsnitt.

En Cell-baserad analys att undersöka icke-muskel Myosin II kontraktilitet via den vikta-gastrulation signalering utbildningsavsnitt i Drosophila S2R + celler

We have developed a cell-based assay using Drosophila cells that recapitulates apical constriction initiated by folded gastrulation (Fog), a secreted ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

A Cell-based Assay to Investigate Non-muscle Myosin II Contractility via the Folded-gastrulation Signaling Pathway in Drosophila S2R+ Cells

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

Använda Konfokal Analys av<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Att undersöka modulatorer av Wnt och Shh Morfogen övertoningar

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Förlust- och Gain-of-funktionsansatsen att undersöka tidiga Cell Fate bestämmelse i preimplantatorisk musembryon

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Metoder för att undersöka lymfkörtel och hemocyter i<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics

Att bygga Finita Element Modeller för att undersöka Zebrafish Jaw biomekanik

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical ...

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

En 5-mC primärblottanalys som kvantifierar DNA-metyleringsnivån av kondrocyt-skillnad<em&gt; In Vitro</em

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissektion och Immunofluorescerande färgning av svamp kropp och ljusmätare nervceller i vuxen Drosophila melanogaster hjärnor

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation

En RANKL-baserade Osteoclast kultur analys av mus benmärgen att undersöka betydelsen av mTORC1 Osteoclast bildandet

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Tillämpningen av RNAi och värme-chock-inducerad transkription faktorn uttryck att omprogrammera könsceller att nervceller i C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational analys av den Caenorhabditis elegans könsceller att studera fördelningen av atomkärnor, proteiner och cytoskelettet

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

HUVEC Tube-formation Assay to Evaluate the Impact of Natural Products on Angiogenesis

HUVEC rör-bildande analys för att utvärdera effekterna av naturliga produkter på angiogenes

Angiogenesis is a phenomenon that includes different processes, such as endothelial cell proliferation, differentiation, and migration, that lead to the ...