Name: laminectomy and spinal cord window implantation in the mouse
Uploaded: 2019-10-23T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse at JoVE.com

ويدعم S.E. لوتس من قبل المركز الوطني للنهوض بالعلوم الانتقالية, المعاهد الوطنية للصحة, تحت منحه KL2TR002002 وجامعه إلينوي شيكاغو كليه الطب بدء الأموال. ويدعم سيمون الفورد من قبل RO1 MH084874. المحتوي هو فقط مسؤوليه المؤلفين ولا يمثل بالضرورة الآراء الرسمية لمعاهد القومية للصحة. ويشكر المؤلفان دراتان اغاليو في قسم علم الأعصاب في المركز الطبي بجامعه كولومبيا لأجهزه الفئران التي تعمل بالرنين العصبي الليفي: كلوبين-5 ، والمناقشات العلمية ، والرؤى في تطوير البروتوكول الجراحي وتطبيقات التصوير. ويشكر المؤلفون سونيل ب. غاندي في قسم بيولوجيا الأعصاب والسلوك في جامعه كاليفورنيا ، ايرفين لتصميم النموذج الاولي للجهاز المجسم ووحده تحكم درجه الحرارة الحيوانية ، ومناقشه البروتوكول الجراحي ، التدريب في المجهر الثنائي الفوتون. ويشكر المؤلفون أيضا ستيف بيكنز (w. Nuhsbaum, Inc.) للحصول علي المساعدة في تخصيص المجسم الفراغي الجراحي ، و Ron Lipinski (صناعه الحيتان) للأجزاء المجسمة بالقطع.

جميع التجارب تتبع جامعه إلينوي ، شيكاغو المؤسسية الرعاية الحيوانية والبروتوكولات لجنه الاستخدام. هذا هو اجراء المحطة الطرفية.
1. اعداد كاشف
<ol><li>اعداد السائل النخاعي الدماغي الاصطناعي (aCSF) لاحتواء 125 mM كلوريد الصوديوم ، 5 ملم KCl ، 10 ملم الجلوكوز ، 10 مم HEPES ، 2 مم MgCl2· 6h2<...

<ol>
	<li>Weinger, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+cellular+dynamics+in+the+mouse+spinal+cord.">Two-photon imaging of cellular dynamics in the mouse spinal cord.</a> Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).</li><li>Davalos, D., Akassoglou, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+the+mouse+spinal+cord+using+two-photon+microscopy.">In vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), (2012).</li><li>Farrar, M. J., Schaffer, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+procedure+for+implanting+a+spinal+chamber+for+longitudinal+in+vivo+imaging+of+the+mouse+spinal+cord.">A procedure for implanting a spinal chamber for longitudinal in vivo imaging of the mouse spinal cord.</a> Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).</li><li>Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implanting+glass+spinal+cord+windows+in+adult+mice+with+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">Implanting glass spinal cord windows in adult mice with experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Journal of Visualized Experiments. (82), e50826 (2013).</li><li>Figley, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+spinal+cord+window+chamber+model+for+in+vivo+longitudinal+multimodal+optical+and+acoustic+imaging+in+a+murine+model.">A spinal cord window chamber model for in vivo longitudinal multimodal optical and acoustic imaging in a murine model.</a> PLOS ONE. 8 (3), e58081 (2013).</li><li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+tissue+two-photon+microscopy.">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).</li><li>Liebner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+morphology+of+the+blood-brain+barrier+in+health+and+disease.">Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease.</a> Acta Neuropathologica. 135 (3), 311-336 (2018).</li><li>Shen, L., Weber, C. R., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tight+junction+protein+complex+undergoes+rapid+and+continuous+molecular+remodeling+at+steady+state.">The tight junction protein complex undergoes rapid and continuous molecular remodeling at steady state.</a> Journal of Cell Biology. 181 (4), 683-695 (2008).</li><li>Knowland, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stepwise+recruitment+of+transcellular+and+paracellular+pathways+underlies+blood-brain+barrier+breakdown+in+stroke.">Stepwise recruitment of transcellular and paracellular pathways underlies blood-brain barrier breakdown in stroke.</a> Neuron. 82, 1-15 (2014).</li><li>Lutz, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caveolin1+Is+Required+for+Th1+Cell+Infiltration,+but+Not+Tight+Junction+Remodeling,+at+the+Blood-Brain+Barrier+in+Autoimmune+Neuroinflammation.">Caveolin1 Is Required for Th1 Cell Infiltration, but Not Tight Junction Remodeling, at the Blood-Brain Barrier in Autoimmune Neuroinflammation.</a> Cell Reports. 21 (8), 2104-2117 (2017).</li><li>Harrison, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebral+landmarks+for+the+identification+of+spinal+cord+segments+in+the+mouse.">Vertebral landmarks for the identification of spinal cord segments in the mouse.</a> Neuroimage. 68, 22-29 (2013).</li><li>Cupido, A., Catalin, B., Steffens, H., Kirchhoff, F., Bakota, L., Brandt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laser Scanning Microscopy and Quantitative Image Analysis of Neuronal Tissue. , 37-50 (2014).</li><li>Sekiguchi, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+large-scale+cellular+activity+in+spinal+cord+of+freely+behaving+mice.">Imaging large-scale cellular activity in spinal cord of freely behaving mice.</a> Nature Communications. 7, 11450 (2016).</li><li>Nadrigny, F., Le Meur, K., Schomburg, E. D., Safavi-Abbasi, S., Dibaj, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser-scanning+microscopy+for+single+and+repetitive+imaging+of+dorsal+and+lateral+spinal+white+matter+in+vivo.">Two-photon laser-scanning microscopy for single and repetitive imaging of dorsal and lateral spinal white matter in vivo.</a> Physiological Research. 66 (3), 531-537 (2017).</li><li>Adelsperger, A. R., Bigiarelli-Nogas, K. J., Toore, I., Goergen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+Low-flow+Digital+Anesthesia+System+for+Mice+and+Rats.">Use of a Low-flow Digital Anesthesia System for Mice and Rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).</li><li>Damen, F. W., Adelsperger, A. R., Wilson, K. E., Goergen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Traditional+and+Integrated+Digital+Anesthetic+Vaporizers.">Comparison of Traditional and Integrated Digital Anesthetic Vaporizers.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (6), 756-762 (2015).</li><li>Miyamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+COX-2+inhibitor+celecoxib+prevents+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+through+COX-2-independent+pathway.">Selective COX-2 inhibitor celecoxib prevents experimental autoimmune encephalomyelitis through COX-2-independent pathway.</a> Brain. 129 (Pt 8), 1984-1992 (2006).</li><li>Muthian, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COX-2+inhibitors+modulate+IL-12+signaling+through+JAK-STAT+pathway+leading+to+Th1+response+in+experimental+allergic+encephalomyelitis.">COX-2 inhibitors modulate IL-12 signaling through JAK-STAT pathway leading to Th1 response in experimental allergic encephalomyelitis.</a> Journal of Clinical Immunology. 26 (1), 73-85 (2006).</li></ol>

الطريقة الموصوفة هنا تسمح للتصوير مستقره من الحبل الشوكي في الفئران من خلال نافذه زجاجيه. وقد تم تطبيق هذه الطريقة لتقييم BBB أعاده عرض في eGFP المحورة وراثيا: Claudin5 +/-الفئران التي تعبر عن الفلورية BBB البروتين مفرق ضيق ، ولكن يمكن تطبيقها بشكل جيد علي قدم المساواة للدراسات من اي البروتينات الفل...

النماذج الحيوانية المحورة وراثيا التعبير عن البروتينات الفلورية ، عندما يقترن مع المجهر الانترافيتال ، توفر منصة قويه لمعالجه علم الاحياء والفيزيولوجيا المرضية. لتطبيق هذه التقنيات علي الحبل الشوكي ، والبروتوكولات المتخصصة مطلوبه لاعداد الحبل الشوكي للتصوير. وتتمثل أحدي هذه الاستراتيجيات في اجراء عمليه استئصال الصفيحة الفقرية وغرس الحبل الشوكي. وتشمل الميزات الرئيسية للبروتوكول المثالي لاستئصال الصفيحة المجهرية الحفاظ علي بنيه الانسجه الاصليه ووظيفتها ، واستقرار حقل التصوير ، ووقت المعالجة السريع ، واستنساخ النتائج. ويتمثل أحد التحديات الخاصة في تحقيق الاستقرار في مجال التصوير مقابل الحركة المستحثة بالتنفس ونبض القلب. وقد تم الإبلاغ عن استراتيجيات متعددة السابقين وفي الجسم الفيفو لتحقيق هذه الأهداف1,2,3,4,5. معظم في الأساليب المجرية تنطوي علي لقط الجانبين من العمود الفقري2,4 وغالبا ما يعقبه زرع جهاز معدني جامد3,4 للاستقرار اثناء الجراحة تطبيقات التصوير النهائي. لقط العمود الفقري يمكن ان يضر بتدفق الدم والحث علي أعاده عرض البروتين حاجز الدم في الدماغ (BBB).
والغرض من هذا الأسلوب هو جعل الحبل الشوكي سليمه متاحه للتصوير البصري في الماوس الحية مع التقليل من غزو البروتوكول وتحسين النتائج. ونحن وصف استئصال الصفيحة واحده والغطاء الزجاجي الاجراء غرس يقترن البيضاوي الحد الأدنى من البلاستيك 3D-مطبوعه الخلفية التي لا تزال تحقق الاستقرار الميكانيكية القوية. يتم التزام باللوحة الخلفية مباشره بالعمود الفقري الامامي والخلفي مع الاسمنت السني. وقد تم تجهيز اللوحة الخلفية مع أذرع التمديد الجانبية مع ثقوب المسمار التي نعلق بشكل صارم علي مرحله المجهر عن طريق ذراع معدنيه. هذا المراسي بشكل فعال الفقرة الاماميه والخلفية السليمة إلى مرحله المجهر ، وتوفير المقاومة الميكانيكية للقطع المصنوعة الحركة التي لولا ذلك سيتم إدخالها عن طريق التنفس وضربات القلب. وقد تم تحسين هذه الطريقة لاستئصال الصفيحة الفقرية لفقره واحده في المستوي الصدري 12 ، وحذف المشابك المستخدمة في استراتيجيات بديله للاستقرار اثناء التصوير في الجسم المجري . الاجراء سريع ، أخذ ما يقرب من 30 دقيقه لكل ماوس.
ويمكن استخدام هذا البروتوكول لدراسة أليات الامراض من BBB. و BBB هو نظام الاوعيه الدقيقة الديناميكية التي تتالف من الخلايا البطانية, العضلات الملساء الاوعيه الدموية, pericytes, وعمليات القدم تموت التي توفر بيئة انتقائية للغاية للجهاز العصبي المركزي (CNS). البيانات التمثيلية تصور تطبيق هذا البروتوكول في الفئران المحورة وراثيا المهندسة للتعبير عن البروتين الفلوري الأخضر المعزز (eGFP): العرج-5 ، وهو البروتين تقاطع الضيق BBB. يمكن أيضا تخصيص ملفات الطباعة الخلفية المتوفرة للتطبيقات البديلة.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D printer</td>
			<td>Raise3D</td>
			<td>Pro2</td>
			<td>For printing backplates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLA 3D printing filament</td>
			<td>Inland</td>
			<td>PLA+-175-B</td>
			<td>Black plastic 3D printing material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D CAD software</td>
			<td>Dassault Systemes</td>
			<td>Solidworks software</td>
			<td>used to design 3D shapes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printer software</td>
			<td>Raise3D</td>
			<td>Ideamaker software</td>
			<td>software used to interface with the 3D printer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printed oval backplate</td>
			<td>custom</td>
			<td></td>
			<td>Stabilizing imaging field</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M205 C</td>
			<td>Equipped with Leica FusionOptics, Planapo 0.63x M-series objective, and gliding stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MC170</td>
			<td>HD color camera for visualizing surgical field</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gliding stage</td>
			<td>Leica</td>
			<td>10446301</td>
			<td>The gliding stage is constructed of two metal plates. The base plate is fixed. The upper plate slides on greased interface to allow rotational and linear movement.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical station and stabilization fork</td>
			<td>Whale Manufactoring</td>
			<td>custom</td>
			<td>Laminectomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SomnoSuite low-flow isoflurane delivery unit</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>SS-01</td>
			<td>Surgical anesthesia administration with integrated digitial vaporizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel 1.5 inch mounting post</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>P50/M</td>
			<td>For mounting surgical station onto optical table for two-photon imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counterbored Clamping Fork for 1.5&#34; mounting Post</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>PF175</td>
			<td>For stabilizing surgical station mount onto optical table for two-photon imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ideal bone microdrill</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>72-6065</td>
			<td>Thinning bone for laminectomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-462-10</td>
			<td>Warming saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cautery gun</td>
			<td>FST</td>
			<td>18010-00</td>
			<td>Cauterizing minor bleeds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>BF11222</td>
			<td>1.9&#8221; x 4.5&#8221; silicone heater with 20&#8221; Teflon leads, 10W, 5V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K type thermocoupled rectal probe</td>
			<td>Physitemp</td>
			<td>RET3</td>
			<td>Measuring mouse body temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petroleum jelly</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>8009-03-8</td>
			<td>Lubricating rectal probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feedback-regulated thermal controller</td>
			<td>custom</td>
			<td>NA</td>
			<td>Commercially available alternatives include the Physitemp TCAT series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVA Surgical eye spears</td>
			<td>Beaver-visitec international</td>
			<td>40400-8</td>
			<td>Absorbing blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric trimmer</td>
			<td>Wahl</td>
			<td>41590-0438</td>
			<td>Trimming mouse fur</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blade, #11</td>
			<td>FST</td>
			<td>14002-14</td>
			<td>Surgical tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, #5</td>
			<td>FST</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>Surgical tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, #4</td>
			<td>FST</td>
			<td>14002-14</td>
			<td>Surgical tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titatnium toothed forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>555047FT</td>
			<td>Surgical tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium Iris scissors</td>
			<td>WPI</td>
			<td>555562S</td>
			<td>Surgical tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond tissue adhesive</td>
			<td>3M</td>
			<td>084-1469SB</td>
			<td>Preparing tissue surface for dental acrylic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic mixing tray</td>
			<td>Jack Richeson</td>
			<td>420716</td>
			<td>Mixing dental acrylic agent with accelerant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orthojet dental acrylic</td>
			<td>Lang Dental</td>
			<td>1520BLK, 1503BLK</td>
			<td>Permanently bonding backplate to tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small round cover glass, #1 thickness, 3 mm</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>64-0720</td>
			<td>optical window</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td>For aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td>For aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td>For aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td>For aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#183;6H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td>For aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10035-04-8</td>
			<td>For aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen</td>
			<td>Rimadyl</td>
			<td>QM01AE91</td>
			<td>Analgesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriostatic water</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>2587428</td>
			<td>Diluent for carprofen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>11695-6776-2</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactated ringer solution</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>0338-0117-04</td>
			<td>Hydration for mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose High EEO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9793</td>
			<td>gel point 34-37 degrees C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opthalmic lubricating ointment</td>
			<td>Akwa Tears</td>
			<td>68788-0697</td>
			<td>Prevent corneal drying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOM Two-Photon Microscope</td>
			<td>Sutter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laminectomy and spinal cord window implantation in the mouse

يصف هذا البروتوكول طريقه لاستئصال صفيحه الحبل الشوكي وغرس النوافذ الزجاجية لتصوير الحبل الشوكي للماوس في الجسم المجري . ويستخدم المبخر الرقمي المتكامل لتحقيق مستوي مستقر من التخدير بمعدل تدفق منخفض من الايزوفلواني. يتم أزاله عمود فقري واحد ، ويتم تراكب الغطاء الزجاجي المتاح تجاريا علي سرير رفيع. ثم تلصق الصفيحة الخلفية البلاستيكية المطبوعة ثلاثية الابعاد بالأشواك الفقرية المجاورة باستخدام لاصق الانسجه والاسمنت السني. يتم استخدام منصة التثبيت للحد من الحركة الملموسة من التنفس وضربات القلب. هذه الطريقة السريعة والخالية من المشبك مناسبه تماما لمجهر متعدد الفوتونات الحاد. يتم تضمين البيانات التمثيلية لتطبيق هذه التقنية علي اثنين من الفوتون المجهري من الاوعيه الدموية في الحبل الشوكي في الفئران المحورة وراثيا التعبير عن eGFP: العرج-5-بروتين تقاطع ضيق.

توفر النوافذ الزجاجية المزروعة والانترافيتال المجهري ثنائي الفوتون أداه مفيده لتقييم التغيرات الديناميكية في بروتينات الجهاز العصبي العام. تتاثر السلامة الوظيفية لل BBB بالتعبير ، والتعريب تحت الخلوي ، ومعدلات دوران البروتينات المفرقة الضيقة7. وقد أظهرت ا?...

Watch this Scientific Journal Video about Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse at JoVE.com

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

يصف هذا البروتوكول غرس نافذه زجاجيه علي الحبل الشوكي للماوس لتسهيل التصور بواسطة المجهر الانترافيتال.

استئصال الصفيحة الفقرية وغرس نافذه الحبل الشوكي في الماوس

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

هذه الطريقة تمكن من فحص ديناميات البروتين في الجسم الحي داخل الجهاز العصبي المركزي سليمة لمعالجة الأسئلة في علم الأعصاب وعلم المناعة. المزايا الرئيسية لهذا الإجراء هي استقرار الحركة ممتازة للحصول على صورة، وقت جراحية قصيرة، وانخفاض تعرض المشغل للتخدير الغازي، واللوحات الخلفية غير مكلفة للتخصيص. المرئية مظاهرة من هذه الطريقة أمر بالغ الأهمية لأنه من الصعب إزالة العظام دون إتلاف الأنسجة العصبية الكامنة بشكل وثيق خلال خطوات استئصال لامينيك من الإجراء.قبل البدء في الإجراء، استخدم برنامج تصميم حاسوبي ثلاثي الأبعاد يساعد على إنشاء نموذج للأبعاد المشار إليها. اذاً لدينا جسم، وهو الكائن ثلاثي الأبعاد، هذا ما يمكننا ان نبدأ به. ما يمكنني القيام به بعد ذلك هو أننا يمكن أن تضع على أن إعدادات لإصدار الطباعة.حتى إذا فتحت هذا تحرير، انتقل إلى خيارات متقدمة، وفتح نافذة التي تمكنني من إلقاء نظرة على كل من هذه الإعدادات. تعيين درجة حرارة فوهة إلى 205 درجة مئوية، ودرجة حرارة السرير إلى 45 درجة مئوية، وسرعة الطباعة إلى 45 ملليمتر في الثانية على طابعة 3D. استخدم فوهة ent 0.4 millimeter الساخنة وارتفاع طبقة 0.2 ملليمتر لطباعة اللوحات الخلفية.ثم تقييم لوحات الظهر المطبوعة بصريا لسلامتها الهيكلية. تشير الأعطال الهيكلية الإجمالية إلى عيوب الطباعة. عندما تكون اللوحات الخلفية جاهزة، ضع رأس فأر تخدير عمره ثمانية إلى 12 أسبوعًا على وسادة حرارية بين قضبان الأذن لمقيد جراحي وطبق مرهم على عيني الحيوان.بعد التأكد من عدم وجود استجابة لقرصة إصبع القارص، استخدم شفرة رقم 11 لصنع فتحة 1.5 سنتيمترًا من الضمور إلى خط الوسط السفلي فوق المنطقة القطنية العليا الصدرية السفلية وفصل الجلد عن الصفاق. استخدام ملقط لقشر مرة أخرى أي الأنسجة الضامة الشفافة المتبقية تحت الجلد لفضح العضلات السطحية. ازاح العضلات برمح رغوة الجراحية جنبا إلى جنب مع العضلات العميقة المتبقية من الفقرات المستهدفة.لإنشاء مقعد لللوحة الخلفية، امسح العضلة من الجانب الخلفي من الصدر 11 والجانب الأمامي من الصدر 13. استخدام ملقط لإزالة العضلات المتبقية من الأوتار حسب الضرورة. عندما تم إزالة كل من العضلات، وقطع بعناية الأوتار مع ملقط حتى يتم تحقيق مساحة كافية لتصور والتلاعب في الحبل الشوكي.تأكد من أن ماطر الجافية في الفضاء الفقري ، وعظم اللامينار شبه الشفاف ، والأوعية الدموية السطحية المركزية تحت العظم ، والشريان المشع الأمامي مرئية بوضوح. تبلل المنطقة بالسوائل الشوكية الدماغية الاصطناعية الدافئة واستخدم الثقب الدقيق لرقيقة عظم اللامينة باستخدام السكتات الدماغية المستقيمة الموازية للمحور الطويل للحبل الشوكي. الامساك بلطف عملية سطحية مع ملقط، ورفع الفقرات.يجب أن ترفع العظام بسهولة. استخدام عدد أربعة ملقط لمسح بعيدا أي شظايا العظام، والسيطرة على أي نزيف مع الرمح الجراحية وضغط ثابت لطيف حسب الضرورة. ثم شطف الأنسجة مع السائل الشوكي الدماغي الاصطناعي الدافئ.لزراعة الزجاج غطاء، وتطبيق بلطف ثلاثة ملليمتر بوروسيليكات غطاء الزجاج على الحبل المكشوف. استخدام ملعقة صغيرة لتطبيق 39 درجة مئوية درجة دافئة 2٪ agarose على حافة الزجاج والسماح للعمل الشعرية لرسم agarose تحت سطح الزجاج الغطاء. تطبيق لاصق الأنسجة على العمليات المفصلية العظمية المكشوفة من الفقرات المجاورة سليمة في مستوى الصدري 11 و 13 العمود الفقري.تطبيق لاصق الأنسجة إضافية في حلقة حول موقع استئصال لامينك على وتر المجاورة وعملية عرضية. بعد ذلك ، استخدم ملعقة جديدة لتطبيق أسمنت الأسنان مختلطة مع المسرّع على طبقة لاصقة الأنسجة ووضع لوحة خلفية على الحقل الجراحي الذي تركز على نافذة الزجاج الغطاء. تطبيق طبقات رقيقة متعددة من الاسمنت الأسنان النتائج في التصاق لوحة خلفية أقوى، ولكن تأكد من وضع لوحة الظهر بسرعة قبل أن يبدأ الاسمنت الأسنان لتجف.بعد السماح للأسمنت الأسنان لعلاج لمدة 10 دقائق، وملء في قاعدة الداخلية و الجانب السفلي من المكان الخلفي مع لاصقة إضافية. تطبيق الاسمنت الأسنان في طبقات رقيقة يمكن أن تساعد في الحد من خطر انتشار الاسمنت إلى الزجاج غطاء و agarose، والتي يمكن أن تعرض للخطر البروتوكول بأكمله. عندما جفف أسمنت الأسنان، تطبيق حامل لوحة الظهر شوك إلى الموضع المناسب على النافذة وبرغي لوحة الظهر في حامل لوحة الظهر.ثم تطبيق المالحة على لوحة خلفية لاختبار التسرب. يمكن بعد ذلك نقل الحيوان والمنصة الجراحية إلى الجدول البصري من مجهر فوتون اثنين للتصوير من خلال نافذة الزجاج الغطاء. في هذه التجربة التمثيلية ، تم تصور EGFP كلودين إيجابية - 5 داخل الوصلات الضيقة المسماة فلورية في جميع أنحاء الضفيرة الوعائية.يشير التحديد الواضح لهياكل الوصلات الضيقة في الإسقاط Z إلى أن الحد الأدنى من إزاحة الصورة XY يتم إنتاجه بعد استئصال لامينك ناجحة ووضع النافذة وغرس اللوحة الخلفية. أثناء محاولة هذا الإجراء من المهم أن نتذكر أن هذا الجراحة المجهرية أمر صعب وقد يستغرق وقتًا لإتقانه. ولكن بمجرد أن يتقن, يمكن إجراء هذه الجراحة في حوالي 30 دقيقة.بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى، مثل المجهر الفوتوني والتصوير في الجسم الحي، للإجابة على أسئلة إضافية حول إعادة عرض الأوعية العصبية والعمليات المرضية الأخرى التي تنطوي على الحبل الشوكي.

laminectomy-and-spinal-cord-window-implantation-in-the-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

تشريح والثقافة من الخلايا العصبية من النخاع الشوكي صواري الجنينية

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

في التصوير المجراة من الحبل الشوكي عن طريق الماوس ثنائي الفوتون المجهري

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central nervous system. We demonstrate a stereotaxic injection technique that allows targeted gene expression or silencing in the dorsal horn of the mouse spinal cord. The surgical procedure is brief. It requires laminectomy of a single vertebra, providing for quick recovery of the animal and unimpaired motility of the spine. Controlled injection of a small vector suspension volume at low speed and use of a microsyringe with beveled glass cannula minimize the tissue lesion. The local immune response to the vector depends on the intrinsic properties of the virus employed; in our experience, it is minor and short-lived when a recombinant adeno-associated virus is used. A reporter gene such as enhanced green fluorescent protein facilitates monitoring spatial distribution of the vector, and the efficacy and cellular specificity of the transfection.

Viral vectors allow for targeted gene manipulation. We demonstrate a method for conditional gene expression or ablation in the mouse spinal cord, using stereotaxic injection of a viral vector into the dorsal horn, a prominent site of synaptic contact between primary somatosensory afferents and neurons of the central nervous system.

التجسيمي حقن ناقل للتلاعب الجيني الفيروسي شرطي في الحبل الشوكي ماوس

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability to reinitiate spinal neurogenesis. However, some anamniotes including the zebrafish Danio rerio exhibit both sensory and functional recovery even after complete transection of the spinal cord. The adult zebrafish is an established model organism for studying regeneration following spinal cord injury, with sensory and motor recovery by 6&#160;weeks post-injury. To take advantage of in vivo analysis of the regenerative process available in the transparent larval zebrafish as well as genetic tools not accessible in the adult, we use the larval zebrafish to study regeneration after spinal cord transection. Here we demonstrate a method for reproducibly and verifiably transecting the larval spinal cord. After transection, our data shows sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury (dpi), with the C-bend movement detectable by 3 dpi and resumption of free swimming by 5 dpi. Thus we propose the larval zebrafish as a companion tool to the adult zebrafish for the study of recovery after spinal cord injury.

After spinal transection, adult zebrafish have functional recovery by six weeks post-injury. To take advantage of larval transparency and faster recovery, we present a method for transecting the larval spinal cord. After transection, we observe sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury, and C-bend movement by 3 days post-injury.

Transection الحبل الشوكي في اليرقات الزرد

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

In this video, we describe a procedure for implanting a chronic optical imaging chamber over the dorsal spinal cord of a live mouse. The chamber, surgical procedure, and chronic imaging are reviewed and demonstrated.

إجراء لغرس الدائرة العمود الفقري للالطولية<em&gt; في فيفو</em&gt; التصوير من الحبل الشوكي ماوس

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

التصوير ثنائي الفوتون الخلوية ديناميكية في الحبل الشوكي ماوس

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal cord of the majority of these fiber systems have not been thoroughly investigated in any species. Serotonergic fibers, which project to the spinal cord, have been studied in rats and opossums on histological sections and their functional significance has been deduced based on their fiber termination pattern in the spinal cord. With the development of CLARITY and CUBIC techniques, it is possible to investigate this fiber system and its distribution in the spinal cord, which is likely to reveal previously unknown features of serotonergic supraspinal pathways. Here, we provide a detailed protocol for imaging the serotonergic fibers in the mouse spinal cord using the combined CLARITY and CUBIC techniques. The method involves perfusion of a mouse with a hydrogel solution and clarification of the tissue with a combination of clearing reagents. Spinal cord tissue was cleared in just under two weeks, and the subsequent immunofluorescent staining against serotonin was completed in less than ten days. With a multi-photon fluorescent microscope, the tissue was scanned and a 3D image was reconstructed using Osirix software.

Supraspinal projections are important for pain perception and other behaviors, and serotonergic fibers are one of these fiber systems. The present study focused on the application of the combined CLARITY/CUBIC protocol to the mouse spinal cord in order to investigate the termination of these serotonergic fibers.

التصوير ألياف هرمون السيروتونين في الحبل الشوكي الماوس عن طريق وضوح / تقنية مكعب

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

التصوير النشاط العصبي في القشرة الأولية Somatosensory باستخدام Thy1-GCaMP6s الفئران المحورة وراثيا

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to intracranial delivery, intra-arterial administration of NSCs is less invasive and produces a more diffuse distribution of NSCs within the brain parenchyma. Further, intra-arterial delivery allows the first-pass effect in the brain circulation, lessening the potential for trapping of cells in peripheral organs, such as liver and spleen, a complication associated with peripheral injections. Here, we detail the methodology, in both mice and rats, for delivery of NSCs through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) to the ipsilateral hemisphere after an ischemic stroke. Using GFP-labeled NSCs, we illustrate the widespread distribution achieved throughout the rodent ipsilateral hemisphere at 1 d, 1 week and 4 weeks after postischemic delivery, with a higher density in or near the ischemic injury site. In addition to long-term survival, we show evidence of differentiation of GFP-labeled cells at 4 weeks. The intra-arterial delivery approach described here for NSCs can also be used for administration of therapeutic compounds, and thus has broad applicability to varied CNS injury and disease models across multiple species.

A method for delivering neural stem cells, adaptable for injecting solutions or suspensions, through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) after ischemic stroke is reported. Injected cells are distributed broadly throughout the brain parenchyma and can be detected up to 30 d after delivery.

التسليم داخل الشرايين للخلايا الجذعية العصبية إلى الدماغ الفئران والفأر: تطبيق على الإقفاري الدماغي

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

استخراج وتنقية الأنزيمية من الخلايا الدبقية الصغيرة من الحبل الشوكي للفأر

Rapid and Efficient Enrichment of Mouse Spinal Cord Microglia

The vertebral column defines a vertebrate and shapes the spinal canal, a cavity that encloses and safeguards the spinal cord. Proper development and function of the mammalian central nervous system rely significantly on the activity of resident macrophages known as microglia. Microglia display heterogeneity and multifunctionality, enabling distinct gene expression and behavior within the spinal cord and brain. Numerous studies have explored cerebral microglia function, detailing purification methods extensively. However, the purification of microglia from the spinal cord in mice lacks a comprehensive description. In contrast, the utilization of a highly purified collagenase, as opposed to an unrefined extract, lacks reporting within central nervous system tissues. In this study, the vertebral column and spinal cord were excised from 8-10 week-old C57BL/6 mice. Subsequent digestion employed a highly purified collagenase, and microglia purification utilized a density gradient. Cells underwent staining for flow cytometry, assessing viability and purity through CD11b and CD45 staining. Results yielded an average viability of 80% and a mean purity of 95%. In conclusion, manipulation of mouse microglia involved digestion with a highly purified collagenase, followed by a density gradient. This approach effectively produced substantial spinal cord microglia populations.

تسليط الضوء على المؤلف: أبحاث الخلايا الدبقية الصغيرة حول عدم تجانس الحبل الشوكي وتنقيته 

Microglia are regarded as some of the most versatile cells in the body, capable of morphological and functional adaptation. Their heterogeneity and multifunctionality enable the maintenance of brain homeostasis, while also being linked to various neurological pathologies. Here, a technique for purifying spinal cord microglia is described.

الإثراء السريع والفعال للخلايا الدبقية الصغيرة للحبل الشوكي للفأر

The vertebral column defines a vertebrate and shapes the spinal canal, a cavity that encloses and safeguards the spinal cord. Proper development and ...