Name: laminectomy and spinal cord window implantation in the mouse
Uploaded: 2019-10-23T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse at JoVE.com

Het nationaal centrum voor de bevordering van translationele wetenschappen, National Institutes of Health, onder Grant KL2TR002002 en University of Illinois Chicago College of Medicine start-up fondsen Simon Alford wordt ondersteund door RO1 MH084874. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de NIH. De auteurs bedanken Dritan Agalliu in het departement Neurology van Columbia University Medical Center voor de TG eGFP: Claudin-5 muizen, wetenschappelijke discussies, en inzichten in de ontwikkeling van de chirurgische protocol en imaging toepassingen. De auteurs bedanken Sunil P. Gandhi in het departement neurobiologie en gedrag aan de Universiteit van Californië, Irvine voor het ontwerpen van het eerste prototype van het stereo-apparaat en de controller voor dier temperatuur, bespreking van het chirurgische protocol, en training in Two-photon microscopie. De auteurs bedanken ook Steve Pickens (W. Nuhsbaum, Inc.) voor hulp bij het aanpassen van de chirurgische stereomicroscoop, en Ron Lipinski (walvis productie) voor het bewerken van stereotactische onderdelen.

Alle experimenten volgen de protocollen van de Universiteit van Illinois, de instellingen van het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité van Chicago. Dit is een terminale procedure.
1. bereiding van het reagens
<ol><li>Maak kunstmatige cerebrale spinale vloeistof (aCSF) voor het bevatten van 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM glucose, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl2· 6h2o, 2 mm CACL2· 2H2o in DDH2o. steriel filter en Vries in individuele-gebr...

<ol>
	<li>Weinger, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+cellular+dynamics+in+the+mouse+spinal+cord.">Two-photon imaging of cellular dynamics in the mouse spinal cord.</a> Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).</li><li>Davalos, D., Akassoglou, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+the+mouse+spinal+cord+using+two-photon+microscopy.">In vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), (2012).</li><li>Farrar, M. J., Schaffer, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+procedure+for+implanting+a+spinal+chamber+for+longitudinal+in+vivo+imaging+of+the+mouse+spinal+cord.">A procedure for implanting a spinal chamber for longitudinal in vivo imaging of the mouse spinal cord.</a> Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).</li><li>Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implanting+glass+spinal+cord+windows+in+adult+mice+with+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">Implanting glass spinal cord windows in adult mice with experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Journal of Visualized Experiments. (82), e50826 (2013).</li><li>Figley, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+spinal+cord+window+chamber+model+for+in+vivo+longitudinal+multimodal+optical+and+acoustic+imaging+in+a+murine+model.">A spinal cord window chamber model for in vivo longitudinal multimodal optical and acoustic imaging in a murine model.</a> PLOS ONE. 8 (3), e58081 (2013).</li><li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+tissue+two-photon+microscopy.">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).</li><li>Liebner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+morphology+of+the+blood-brain+barrier+in+health+and+disease.">Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease.</a> Acta Neuropathologica. 135 (3), 311-336 (2018).</li><li>Shen, L., Weber, C. R., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tight+junction+protein+complex+undergoes+rapid+and+continuous+molecular+remodeling+at+steady+state.">The tight junction protein complex undergoes rapid and continuous molecular remodeling at steady state.</a> Journal of Cell Biology. 181 (4), 683-695 (2008).</li><li>Knowland, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stepwise+recruitment+of+transcellular+and+paracellular+pathways+underlies+blood-brain+barrier+breakdown+in+stroke.">Stepwise recruitment of transcellular and paracellular pathways underlies blood-brain barrier breakdown in stroke.</a> Neuron. 82, 1-15 (2014).</li><li>Lutz, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caveolin1+Is+Required+for+Th1+Cell+Infiltration,+but+Not+Tight+Junction+Remodeling,+at+the+Blood-Brain+Barrier+in+Autoimmune+Neuroinflammation.">Caveolin1 Is Required for Th1 Cell Infiltration, but Not Tight Junction Remodeling, at the Blood-Brain Barrier in Autoimmune Neuroinflammation.</a> Cell Reports. 21 (8), 2104-2117 (2017).</li><li>Harrison, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebral+landmarks+for+the+identification+of+spinal+cord+segments+in+the+mouse.">Vertebral landmarks for the identification of spinal cord segments in the mouse.</a> Neuroimage. 68, 22-29 (2013).</li><li>Cupido, A., Catalin, B., Steffens, H., Kirchhoff, F., Bakota, L., Brandt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laser Scanning Microscopy and Quantitative Image Analysis of Neuronal Tissue. , 37-50 (2014).</li><li>Sekiguchi, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+large-scale+cellular+activity+in+spinal+cord+of+freely+behaving+mice.">Imaging large-scale cellular activity in spinal cord of freely behaving mice.</a> Nature Communications. 7, 11450 (2016).</li><li>Nadrigny, F., Le Meur, K., Schomburg, E. D., Safavi-Abbasi, S., Dibaj, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser-scanning+microscopy+for+single+and+repetitive+imaging+of+dorsal+and+lateral+spinal+white+matter+in+vivo.">Two-photon laser-scanning microscopy for single and repetitive imaging of dorsal and lateral spinal white matter in vivo.</a> Physiological Research. 66 (3), 531-537 (2017).</li><li>Adelsperger, A. R., Bigiarelli-Nogas, K. J., Toore, I., Goergen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+Low-flow+Digital+Anesthesia+System+for+Mice+and+Rats.">Use of a Low-flow Digital Anesthesia System for Mice and Rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).</li><li>Damen, F. W., Adelsperger, A. R., Wilson, K. E., Goergen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Traditional+and+Integrated+Digital+Anesthetic+Vaporizers.">Comparison of Traditional and Integrated Digital Anesthetic Vaporizers.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (6), 756-762 (2015).</li><li>Miyamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+COX-2+inhibitor+celecoxib+prevents+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+through+COX-2-independent+pathway.">Selective COX-2 inhibitor celecoxib prevents experimental autoimmune encephalomyelitis through COX-2-independent pathway.</a> Brain. 129 (Pt 8), 1984-1992 (2006).</li><li>Muthian, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COX-2+inhibitors+modulate+IL-12+signaling+through+JAK-STAT+pathway+leading+to+Th1+response+in+experimental+allergic+encephalomyelitis.">COX-2 inhibitors modulate IL-12 signaling through JAK-STAT pathway leading to Th1 response in experimental allergic encephalomyelitis.</a> Journal of Clinical Immunology. 26 (1), 73-85 (2006).</li></ol>

De hier beschreven methode zorgt voor een stabiele beeldvorming van het ruggenmerg bij muizen door middel van een glazen ruit. Deze methode is toegepast om BBB-remodellering in transgene eGFP te beoordelen: Claudin5 +/-muizen die een fluorescerende BBB-nauwe Junction-eiwit uitdrukken, maar het zou even goed kunnen worden toegepast voor studies van fluorescerende eiwitten of cellen in het ruggenmerg.
Er zijn meerdere methoden ontwikkeld voor het stabiliseren van laminectomie en ruggenmerg. Alle...

Transgene diermodellen die fluorescerende eiwitten uitdrukken, in combinatie met intravital microscopie, bieden een krachtig platform voor het aanpakken van biologie en pathofysiologie. Om deze technieken toe te passen op het ruggenmerg zijn gespecialiseerde protocollen vereist om het ruggenmerg voor te bereiden op beeldvorming. Een dergelijke strategie is het uitvoeren van een laminectomie en de implantatie van het ruggenmerg venster. De belangrijkste kenmerken van een ideaal laminectomie protocol voor microscopie omvatten behoud van native weefselstructuur en functie, stabiliteit van het beeldvormings veld, snelle verwerkingstijd en reproduceerbaarheid van resultaten. Een bijzondere uitdaging is om het beeldvormings veld te stabiliseren tegen de beweging geïnduceerd door ademhaling en hartslag. Er zijn meerdere ex vivo -en in vivo -strategieën gerapporteerd om deze doelen te bereiken1,2,3,4,5. De meeste in vivo -methoden omvatten het klemmen van de zijkanten van de wervelkolom2,4 en wordt vaak gevolgd door het implanteren van een rigide metalen apparaat3,4 voor stabiliteit tijdens chirurgie en downstreambeeldverwerkings toepassingen. Klemmen van de wervelkolom kan potentieel compromitteren bloedstroom en induceren bloed-hersen barrière (BBB) eiwit remodelleren.
Het doel van deze methode is om het intacte ruggenmerg beschikbaar te maken voor optische beeldvorming in de levende muis, terwijl de invasiviteit van het protocol wordt geminimaliseerd en de resultaten worden verbeterd. We beschrijven een enkele laminectomie en Cover-Glass implantatie procedure gecombineerd met een minimaal invasieve ovale kunststof 3D-gedrukte achterplaat die nog steeds robuuste mechanische stabiliteit bereikt. De achterplaat wordt direct aan de voorste en achterste wervel stekels met tand cement gehecht. De achterplaat is uitgerust met laterale verlengarmen met schroefgaten die stevig aan de Microscoop worden bevestigd via een metalen arm. Dit verankert effectief de intact voorste en posterieure wervel tot de Microscoop fase, het verstrekken van mechanische weerstand tegen het bewegings artefact dat anders zou worden geïntroduceerd door de ademhaling en hartslag. De methode is geoptimaliseerd voor laminectomie van een enkele wervel op thoracische niveau 12, weglaten van de klemmen gebruikt in alternatieve strategieën voor stabiliteit tijdens in vivo beeldvorming. De procedure is snel, met ongeveer 30 minuten per muis.
Dit protocol kan worden gebruikt voor het bestuderen van de ziekte-mechanismen van de BBB. De BBB is een dynamisch microvasculaire systeem bestaande uit endotheel cellen, vasculaire gladde spieren, pericytes, en astrociet voet processen die zorgen voor een zeer selectieve omgeving voor het centrale zenuwstelsel (CNS). Representatieve gegevens beschrijven de toepassing van dit protocol in transgene muizen die zijn ontwikkeld om verbeterde groene fluorescerende eiwitten (eGFP) uit te drukken: Claudin-5, een BBB-strakke Junction-proteïne. De geleverde achterplaat print bestanden kunnen ook worden aangepast voor alternatieve toepassingen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D printer</td>
			<td>Raise3D</td>
			<td>Pro2</td>
			<td>For printing backplates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLA 3D printing filament</td>
			<td>Inland</td>
			<td>PLA+-175-B</td>
			<td>Black plastic 3D printing material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D CAD software</td>
			<td>Dassault Systemes</td>
			<td>Solidworks software</td>
			<td>used to design 3D shapes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printer software</td>
			<td>Raise3D</td>
			<td>Ideamaker software</td>
			<td>software used to interface with the 3D printer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printed oval backplate</td>
			<td>custom</td>
			<td></td>
			<td>Stabilizing imaging field</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M205 C</td>
			<td>Equipped with Leica FusionOptics, Planapo 0.63x M-series objective, and gliding stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MC170</td>
			<td>HD color camera for visualizing surgical field</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gliding stage</td>
			<td>Leica</td>
			<td>10446301</td>
			<td>The gliding stage is constructed of two metal plates. The base plate is fixed. The upper plate slides on greased interface to allow rotational and linear movement.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical station and stabilization fork</td>
			<td>Whale Manufactoring</td>
			<td>custom</td>
			<td>Laminectomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SomnoSuite low-flow isoflurane delivery unit</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>SS-01</td>
			<td>Surgical anesthesia administration with integrated digitial vaporizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel 1.5 inch mounting post</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>P50/M</td>
			<td>For mounting surgical station onto optical table for two-photon imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counterbored Clamping Fork for 1.5&#34; mounting Post</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>PF175</td>
			<td>For stabilizing surgical station mount onto optical table for two-photon imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ideal bone microdrill</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>72-6065</td>
			<td>Thinning bone for laminectomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-462-10</td>
			<td>Warming saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cautery gun</td>
			<td>FST</td>
			<td>18010-00</td>
			<td>Cauterizing minor bleeds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>BF11222</td>
			<td>1.9&#8221; x 4.5&#8221; silicone heater with 20&#8221; Teflon leads, 10W, 5V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K type thermocoupled rectal probe</td>
			<td>Physitemp</td>
			<td>RET3</td>
			<td>Measuring mouse body temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petroleum jelly</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>8009-03-8</td>
			<td>Lubricating rectal probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feedback-regulated thermal controller</td>
			<td>custom</td>
			<td>NA</td>
			<td>Commercially available alternatives include the Physitemp TCAT series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVA Surgical eye spears</td>
			<td>Beaver-visitec international</td>
			<td>40400-8</td>
			<td>Absorbing blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric trimmer</td>
			<td>Wahl</td>
			<td>41590-0438</td>
			<td>Trimming mouse fur</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blade, #11</td>
			<td>FST</td>
			<td>14002-14</td>
			<td>Surgical tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, #5</td>
			<td>FST</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>Surgical tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, #4</td>
			<td>FST</td>
			<td>14002-14</td>
			<td>Surgical tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titatnium toothed forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>555047FT</td>
			<td>Surgical tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium Iris scissors</td>
			<td>WPI</td>
			<td>555562S</td>
			<td>Surgical tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond tissue adhesive</td>
			<td>3M</td>
			<td>084-1469SB</td>
			<td>Preparing tissue surface for dental acrylic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic mixing tray</td>
			<td>Jack Richeson</td>
			<td>420716</td>
			<td>Mixing dental acrylic agent with accelerant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orthojet dental acrylic</td>
			<td>Lang Dental</td>
			<td>1520BLK, 1503BLK</td>
			<td>Permanently bonding backplate to tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small round cover glass, #1 thickness, 3 mm</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>64-0720</td>
			<td>optical window</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td>For aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td>For aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td>For aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td>For aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#183;6H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td>For aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10035-04-8</td>
			<td>For aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen</td>
			<td>Rimadyl</td>
			<td>QM01AE91</td>
			<td>Analgesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriostatic water</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>2587428</td>
			<td>Diluent for carprofen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>11695-6776-2</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactated ringer solution</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>0338-0117-04</td>
			<td>Hydration for mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose High EEO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9793</td>
			<td>gel point 34-37 degrees C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opthalmic lubricating ointment</td>
			<td>Akwa Tears</td>
			<td>68788-0697</td>
			<td>Prevent corneal drying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOM Two-Photon Microscope</td>
			<td>Sutter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laminectomy and spinal cord window implantation in the mouse

Dit protocol beschrijft een methode voor de implantatie van het ruggenmerg en de glazen ruit voor in vivo beeldvorming van het ruggenmerg van de muis. Een geïntegreerde digitale vaporizer wordt gebruikt om een stabiel vlak van anesthesie te bereiken bij een laag debiet van isoflurane. Er wordt een enkele wervel wervelkolom verwijderd en een in de handel verkrijgbare afdekglas wordt op een dun agarose bed gelegd. Een 3D-gedrukte kunststof achterplaat wordt vervolgens aangebracht op de aangrenzende wervel stekels met behulp van weefsellijm en tand cement. Een stabilisatie platform wordt gebruikt om bewegings artefact te verminderen van ademhaling en hartslag. Deze snelle en Clamp-Free methode is zeer geschikt voor acute multi-photon fluorescentiemicroscopie. Representatieve gegevens zijn opgenomen voor een toepassing van deze techniek op twee-Fobe microscopie van de ruggenmerg-vasculatuur in transgene muizen die eGFP uitdrukken: Claudin-5 — een strak koppelings eiwit.

Geïmplanteerde glasramen en intravital Two-photon microscopie biedt een nuttig instrument voor het beoordelen van dynamische veranderingen in CNS eiwitten. De functionele integriteit van de BBB wordt beïnvloed door de expressie, subcellulaire lokalisatie, en de omzet van nauwe Junction eiwitten7. Uit eerdere studies is gebleken dat nauwe junctie eiwitten snel en dynamisch remodelleren bij steady state8. De momenteel beschreven laminectomie...

Watch this Scientific Journal Video about Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse at JoVE.com

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

Dit protocol beschrijft implantatie van een glas venster op het ruggenmerg van een muis om visualisatie te vergemakkelijken door intravital microscopie.

Implantatie van de laminectomie en het ruggenmerg in de muis

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

Deze methode maakt het mogelijk om eiwitdynamica in vivo binnen het intacte centrale zenuwstelsel te onderzoeken om vragen in neurowetenschappen en immunologie aan te pakken. De belangrijkste voordelen van deze procedure zijn een uitstekende bewegingsstabiliteit voor beeldverwerving, korte chirurgische tijd, verminderde blootstelling van de operator aan gasvormige anesthesie en goedkope aanpasbare backplates. Visuele demonstratie van deze methode is van cruciaal belang omdat het moeilijk is om het bot te verwijderen zonder het nauw onderliggende zenuwweefsel tijdens de laminectomiestappen van de procedure te beschadigen.Gebruik voordat u met de procedure begint met 3D-computerondersteunde ontwerpsoftware om een model te maken naar de aangegeven afmetingen. Dus we hebben een object, dat het driedimensionale object is, waar we mee kunnen beginnen. Wat ik dan kan doen is kunnen we instellingen op dat voor de printversie.Dus als ik dit open, ga naar Advanced, open een venster dat me in staat stelt om te kijken naar al deze instellingen. Stel de mondtemperatuur in op 205 graden Celsius, de bedtemperatuur op 45 graden Celsius en de afdruksnelheid op 45 millimeter per seconde op een 3D-printer. Gebruik een 0,4 millimeter hete ent-nozzle en een laaghoogte van 0,2 millimeter om de achterplaten af te drukken.Beoordeel vervolgens de gedrukte rugplaten visueel op hun structurele integriteit. Grove structurele storingen wijzen op drukfouten. Wanneer de achterplaten klaar zijn, plaats het hoofd van een acht tot 12 weken oude verdoofde muis op een warmtekussen tussen de oorbalken van een chirurgische restrainer en breng zalf op de ogen van het dier.Na bevestiging van een gebrek aan respons op teensnuifje, gebruik een nummer 11 mes om een 1,5 centimeter rostral te maken naar caudal midline incisie over de onderste thoracale bovenste lendenstreek en de huid te scheiden van het buikvlies. Gebruik tangen om alle resterende transparante bindweefsel onder de huid terug te pellen om het oppervlakkige spierstelsel bloot te leggen. Verplaats de spieren met een schuim chirurgische speer samen met de resterende diepere spier van de doelwervel.Om een stoel voor de achterplaat te creëren, maak je de spier vrij van het achterste aspect van thoracale 11 en het voorste aspect van thoracale 13. Met behulp van tangen om de resterende spier te verwijderen uit de pezen als dat nodig is. Wanneer alle van de spier is verwijderd, zorgvuldig snijd de pezen met tangen totdat er voldoende ruimte voor het visualiseren en manipuleren van het ruggenmerg is bereikt.Bevestig dat de duramater van de tussenwervelruimte, het semitransparante laminaire bot, het centrale oppervlakkige bloedvat onder het bot en de voorste uitstralende slagader duidelijk zichtbaar zijn. Maak de regio nat met warm kunstmatig hersenmergvocht en gebruik een microboor om het laminaire bot te verdunnen met behulp van rechte slagen parallel aan de lange as van het ruggenmerg. Voorzichtig grijpen de oppervlakkige spinous proces met tangen, til de wervel.Het bot moet gemakkelijk weg te tillen. Gebruik nummer vier tangen om alle botscherven weg te ruimen, het beheersen van een bloeden met een chirurgische speer en zachte constante druk als dat nodig is. Spoel vervolgens het weefsel met warme kunstmatige cerebrale spinale vloeistof.Voor de implantatie van de afdekkingsglas breng u voorzichtig een drie millimeter borosilicaatdeksel aan op het blootgestelde snoer. Gebruik een kleine spatel om 39 graden Celsius opgewarmd 2% agarose aan de rand van het glas toe te passen en capillaire actie toe te staan om de agarose onder het oppervlak van het dekkingsglas te trekken. Breng weefselkleven aan op de blootgestelde benige articulaire processen van de intacte aangrenzende wervel op thoracale niveau 11 en 13 wervelwervels.Breng extra weefselkleven in een ring rond de laminectomie site over de aangrenzende pees en het transversale proces. Gebruik vervolgens een nieuwe spatel om tandcement gemengd met brandversneller op de weefselkleeflaag aan te brengen en plaats een achterplaat op het chirurgische veld gecentreerd over het glazen dekselvenster. Het toepassen van meerdere dunne lagen van tandcement resulteert in een sterkere achterplaat hechting, maar zorg ervoor dat de achterplaat snel te plaatsen voordat de tandheelkundige cement begint te drogen.Na het toestaan van de tandheelkundige cement te genezen voor 10 minuten, vul de binnenste basis en onderkant van de achterplaats met extra lijm. Het aanbrengen van het tandcement in dunne lagen kan helpen verminderen het risico van cement verspreiden naar de cover glas en agarose, die het hele protocol kan compromitteren. Wanneer het tandcement is gedroogd, breng dan een gevorkte achterplaathouder aan op de juiste positie over het raam en schroef de achterplaat in de achterste plaathouder.Breng vervolgens zout op de achterplaat aan om te testen op lekkage. Het dier en het chirurgische platform kunnen vervolgens worden overgebracht naar de optische tafel van een twee fotonmicroscoop voor beeldvorming door het glazen dekselraam. In dit representatieve experiment werd EGFP positieve claudin-5 gevisualiseerd in de fluorescerende strakke kruispunten in een vasculaire plexus.De duidelijke afbakening van de strakke verbindingsstructuren in de Z-projectie geeft aan dat minimale XY-beeldverplaatsing wordt geproduceerd na een succesvolle laminectomie, raamplaatsing en back plate implantatie. Tijdens een poging tot deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat deze microchirurgie moeilijk is en kan de tijd nemen om onder de knie. Maar eenmaal onder de knie, deze operatie kan worden uitgevoerd in ongeveer 30 minuten.Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals twee fotonmicroscopie en in vivo beeldvorming, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden over neurovasculaire remodellering en andere ziekteprocessen waarbij het ruggenmerg betrokken is.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Dissectie en Cultuur van Commissural neuronen van het ruggenmerg Embryonic

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Spinal Cord Elektrofysiologie II: Extracellulaire Suction Elektrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo beeldvorming van de muis ruggenmerg met behulp van twee-foton Microscopie

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Stereotactische injectie van een virale vector voor voorwaardelijke Gene Manipulation in de muis Spinal Cord

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Spinal Cord doorsnijding in het larvale zebravis

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Een procedure voor het implanteren van een Spinal Kamer voor Longitudinaal<em&gt; In Vivo</em&gt; Beeldvorming van de Muis Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Twee-foton Imaging van Cellular Dynamics in de Muis Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Beeldvorming Serotonerge vezels in de muis Spinal Cord Met behulp van de DUIDELIJKHEID / CUBIC Techniek

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging neurale activiteit in de primaire somatosensorische Cortex met behulp van Thy1-GCaMP6s transgene muizen

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Intra-arteriële levering van neurale stamcellen aan de Rat en Mouse Brain: Toepassing op cerebrale ischemie

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...