Name: laminectomy and spinal cord window implantation in the mouse
Uploaded: 2019-10-23T12:30:00
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S.E. Lutz wird vom National Center for Advancing Translational Sciences, National Institutes of Health, unter dem Grant KL2TR002002 und den Start-up-Fonds des University of Illinois Chicago College of Medicine unterstützt. Simon Alford wird von RO1 MH084874 unterstützt. Der Inhalt liegt allein in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offiziellen Ansichten des NIH dar. Die Autoren danken Dritan Agalliu in der Abteilung für Neurologie am Columbia University Medical Center für die Tg eGFP:Claudin-5 Mäuse, wissenschaftliche Diskussionen und Einblicke in die Entwicklung des chirurgischen Protokolls und bildgebende Anwendungen. Die Autoren danken Sunil P. Gandhi im Department of Neurobiology and Behavior der University of California, Irvine für die Entwicklung des ersten Prototyps des stereotaktischen Apparats und des Tiertemperaturreglers, die Diskussion des operationsischen Protokolls und Ausbildung in der Zwei-Photonen-Mikroskopie. Die Autoren danken auch Steve Pickens (W. Nuhsbaum, Inc.) für die Unterstützung bei der Anpassung des chirurgischen Stereomikroskops und Ron Lipinski (Whale Manufacturing) für die Bearbeitung stereotaktischer Teile.

Alle Experimente folgen den Protokollen des Institutional Animal Care and Use Committee der University of Illinois, Chicago. Dies ist ein Terminalverfahren.
1. Reagenz-Vorbereitung
<ol><li>Bereiten Sie künstliche zerebrale Rückenmarksflüssigkeit (aCSF) vor, die 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM Glucose, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl26H2O, 2 mM CaCl22Oin ddH2O. Sterilfilter und Einfrieren in individuellen Aliquots enthält. ACSF in einem Wasserbad...

<ol>
	<li>Weinger, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+cellular+dynamics+in+the+mouse+spinal+cord.">Two-photon imaging of cellular dynamics in the mouse spinal cord.</a> Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).</li><li>Davalos, D., Akassoglou, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+the+mouse+spinal+cord+using+two-photon+microscopy.">In vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), (2012).</li><li>Farrar, M. J., Schaffer, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+procedure+for+implanting+a+spinal+chamber+for+longitudinal+in+vivo+imaging+of+the+mouse+spinal+cord.">A procedure for implanting a spinal chamber for longitudinal in vivo imaging of the mouse spinal cord.</a> Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).</li><li>Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implanting+glass+spinal+cord+windows+in+adult+mice+with+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">Implanting glass spinal cord windows in adult mice with experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Journal of Visualized Experiments. (82), e50826 (2013).</li><li>Figley, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+spinal+cord+window+chamber+model+for+in+vivo+longitudinal+multimodal+optical+and+acoustic+imaging+in+a+murine+model.">A spinal cord window chamber model for in vivo longitudinal multimodal optical and acoustic imaging in a murine model.</a> PLOS ONE. 8 (3), e58081 (2013).</li><li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+tissue+two-photon+microscopy.">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).</li><li>Liebner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+morphology+of+the+blood-brain+barrier+in+health+and+disease.">Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease.</a> Acta Neuropathologica. 135 (3), 311-336 (2018).</li><li>Shen, L., Weber, C. R., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tight+junction+protein+complex+undergoes+rapid+and+continuous+molecular+remodeling+at+steady+state.">The tight junction protein complex undergoes rapid and continuous molecular remodeling at steady state.</a> Journal of Cell Biology. 181 (4), 683-695 (2008).</li><li>Knowland, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stepwise+recruitment+of+transcellular+and+paracellular+pathways+underlies+blood-brain+barrier+breakdown+in+stroke.">Stepwise recruitment of transcellular and paracellular pathways underlies blood-brain barrier breakdown in stroke.</a> Neuron. 82, 1-15 (2014).</li><li>Lutz, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caveolin1+Is+Required+for+Th1+Cell+Infiltration,+but+Not+Tight+Junction+Remodeling,+at+the+Blood-Brain+Barrier+in+Autoimmune+Neuroinflammation.">Caveolin1 Is Required for Th1 Cell Infiltration, but Not Tight Junction Remodeling, at the Blood-Brain Barrier in Autoimmune Neuroinflammation.</a> Cell Reports. 21 (8), 2104-2117 (2017).</li><li>Harrison, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebral+landmarks+for+the+identification+of+spinal+cord+segments+in+the+mouse.">Vertebral landmarks for the identification of spinal cord segments in the mouse.</a> Neuroimage. 68, 22-29 (2013).</li><li>Cupido, A., Catalin, B., Steffens, H., Kirchhoff, F., Bakota, L., Brandt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laser Scanning Microscopy and Quantitative Image Analysis of Neuronal Tissue. , 37-50 (2014).</li><li>Sekiguchi, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+large-scale+cellular+activity+in+spinal+cord+of+freely+behaving+mice.">Imaging large-scale cellular activity in spinal cord of freely behaving mice.</a> Nature Communications. 7, 11450 (2016).</li><li>Nadrigny, F., Le Meur, K., Schomburg, E. D., Safavi-Abbasi, S., Dibaj, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser-scanning+microscopy+for+single+and+repetitive+imaging+of+dorsal+and+lateral+spinal+white+matter+in+vivo.">Two-photon laser-scanning microscopy for single and repetitive imaging of dorsal and lateral spinal white matter in vivo.</a> Physiological Research. 66 (3), 531-537 (2017).</li><li>Adelsperger, A. R., Bigiarelli-Nogas, K. J., Toore, I., Goergen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+Low-flow+Digital+Anesthesia+System+for+Mice+and+Rats.">Use of a Low-flow Digital Anesthesia System for Mice and Rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).</li><li>Damen, F. W., Adelsperger, A. R., Wilson, K. E., Goergen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Traditional+and+Integrated+Digital+Anesthetic+Vaporizers.">Comparison of Traditional and Integrated Digital Anesthetic Vaporizers.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (6), 756-762 (2015).</li><li>Miyamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+COX-2+inhibitor+celecoxib+prevents+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+through+COX-2-independent+pathway.">Selective COX-2 inhibitor celecoxib prevents experimental autoimmune encephalomyelitis through COX-2-independent pathway.</a> Brain. 129 (Pt 8), 1984-1992 (2006).</li><li>Muthian, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COX-2+inhibitors+modulate+IL-12+signaling+through+JAK-STAT+pathway+leading+to+Th1+response+in+experimental+allergic+encephalomyelitis.">COX-2 inhibitors modulate IL-12 signaling through JAK-STAT pathway leading to Th1 response in experimental allergic encephalomyelitis.</a> Journal of Clinical Immunology. 26 (1), 73-85 (2006).</li></ol>

Das hier beschriebene Verfahren ermöglicht eine stabile Bildgebung des Rückenmarks bei Mäusen durch ein Glasfenster. Diese Methode wurde angewendet, um die BBB-Umgestaltung in transgenen eGFP:Claudin5+/- Mäusen zu bewerten, die ein fluoreszierendes BBB-Protein mit fester Verbindung ausdrücken, aber es könnte ebenso gut für Studien von fluoreszierenden Proteinen oder Zellen im Rückenmark angewendet werden.
Es wurden mehrere Methoden zur Laminektomie und Rückenmarksstabilisierung entwic...

Transgene Tiermodelle, die fluoreszierende Proteine exezieren, bieten in Kombination mit der intravitalen Mikroskopie eine leistungsstarke Plattform für die Auseinandersetzung mit Biologie und Pathophysiologie. Um diese Techniken auf das Rückenmark anzuwenden, sind spezielle Protokolle erforderlich, um das Rückenmark für die Bildgebung vorzubereiten. Eine solche Strategie ist die Durchführung einer Laminektomie und rückenmarksfensterimplantation. Zu den Hauptmerkmalen eines idealen Laminektomieprotokolls für die Mikroskopie gehören die Erhaltung der nativen Gewebestruktur und -funktion, die Stabilität des Bildgebungsfeldes, die schnelle Verarbeitungszeit und die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse. Eine besondere Herausforderung besteht darin, das Bildgebungsfeld gegen die durch Atmung und Herzschlag induzierte Bewegung zu stabilisieren. Mehrere ex vivo und in vivo Strategien wurden berichtet, um diese Ziele zu erreichen1,2,3,4,5. Die meisten In-vivo-Methoden beinhalten das Spannen der Seiten der Wirbelsäule2,4 und wird oft durch die Implantation eines starren Metallapparates3,4 zur Stabilität während der Operation und nachgeschaltete Bildgebungsanwendungen. Das Spannen der Wirbelsäule kann den Blutfluss beeinträchtigen und eine Protein-Umgestaltung der Blut-Hirn-Schranke (BBB) induzieren.
Der Zweck dieser Methode ist es, das intakte Rückenmark für die optische Bildgebung in der lebenden Maus zur Verfügung zu stellen und gleichzeitig die Invasivität des Protokolls zu minimieren und die Ergebnisse zu verbessern. Wir beschreiben ein einziges Laminektomie- und Deckglas-Implantationsverfahren gepaart mit einer minimalinvasiven ovalen 3D-gedruckten 3D-gedruckten Rückplatte, die dennoch eine robuste mechanische Stabilität erreicht. Die Rückplatte wird direkt an den vorderen und hinteren Wirbeldornen mit Zahnzement aufgehalten. Die Rückwand ist mit seitlichen Verlängerungsarmen mit Schraublöchern ausgestattet, die über einen Metallarm fest an der Mikroskopbühne befestigt werden. Dadurch wird der intakte vordere und hintere Wirbel effektiv an der Mikroskopstufe verankert und bietet eine mechanische Beständigkeit gegen das Bewegungsartefakt, das sonst durch Atmung und Herzschlag eingeführt würde. Das Verfahren wurde für die Laminektomie eines einzelnen Wirbels auf Thoraxstufe 12 optimiert, wodurch die In-vivo-Bildgebung in alternativen Stabilitätsstrategien ausgelassen wird. Das Verfahren ist schnell und dauert ca. 30 min pro Maus.
Dieses Protokoll kann verwendet werden, um Krankheitsmechanismen der BBB zu untersuchen. Das BBB ist ein dynamisches mikrovaskuläres System, das aus Endothelzellen, vaskulären glatten Muskeln, Pericyten und Astrozytenfußprozessen besteht, die eine hochselektive Umgebung für das zentrale Nervensystem (ZNS) bieten. Repräsentative Daten zeigen die Anwendung dieses Protokolls bei transgenen Mäusen, die entwickelt wurden, um verbessertes grünes fluoreszierendes Protein (eGFP) auszudrücken:Claudin-5, ein BBB-Protein mit fester Verbindung. Die mitgelieferten Backplate-Druckdateien können auch für alternative Anwendungen angepasst werden.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D printer</td>
			<td>Raise3D</td>
			<td>Pro2</td>
			<td>For printing backplates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLA 3D printing filament</td>
			<td>Inland</td>
			<td>PLA+-175-B</td>
			<td>Black plastic 3D printing material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D CAD software</td>
			<td>Dassault Systemes</td>
			<td>Solidworks software</td>
			<td>used to design 3D shapes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printer software</td>
			<td>Raise3D</td>
			<td>Ideamaker software</td>
			<td>software used to interface with the 3D printer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printed oval backplate</td>
			<td>custom</td>
			<td></td>
			<td>Stabilizing imaging field</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M205 C</td>
			<td>Equipped with Leica FusionOptics, Planapo 0.63x M-series objective, and gliding stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MC170</td>
			<td>HD color camera for visualizing surgical field</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gliding stage</td>
			<td>Leica</td>
			<td>10446301</td>
			<td>The gliding stage is constructed of two metal plates. The base plate is fixed. The upper plate slides on greased interface to allow rotational and linear movement.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical station and stabilization fork</td>
			<td>Whale Manufactoring</td>
			<td>custom</td>
			<td>Laminectomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SomnoSuite low-flow isoflurane delivery unit</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>SS-01</td>
			<td>Surgical anesthesia administration with integrated digitial vaporizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel 1.5 inch mounting post</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>P50/M</td>
			<td>For mounting surgical station onto optical table for two-photon imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counterbored Clamping Fork for 1.5&#34; mounting Post</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>PF175</td>
			<td>For stabilizing surgical station mount onto optical table for two-photon imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ideal bone microdrill</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>72-6065</td>
			<td>Thinning bone for laminectomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-462-10</td>
			<td>Warming saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cautery gun</td>
			<td>FST</td>
			<td>18010-00</td>
			<td>Cauterizing minor bleeds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>BF11222</td>
			<td>1.9&#8221; x 4.5&#8221; silicone heater with 20&#8221; Teflon leads, 10W, 5V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K type thermocoupled rectal probe</td>
			<td>Physitemp</td>
			<td>RET3</td>
			<td>Measuring mouse body temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petroleum jelly</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>8009-03-8</td>
			<td>Lubricating rectal probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feedback-regulated thermal controller</td>
			<td>custom</td>
			<td>NA</td>
			<td>Commercially available alternatives include the Physitemp TCAT series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVA Surgical eye spears</td>
			<td>Beaver-visitec international</td>
			<td>40400-8</td>
			<td>Absorbing blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric trimmer</td>
			<td>Wahl</td>
			<td>41590-0438</td>
			<td>Trimming mouse fur</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blade, #11</td>
			<td>FST</td>
			<td>14002-14</td>
			<td>Surgical tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, #5</td>
			<td>FST</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>Surgical tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, #4</td>
			<td>FST</td>
			<td>14002-14</td>
			<td>Surgical tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titatnium toothed forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>555047FT</td>
			<td>Surgical tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium Iris scissors</td>
			<td>WPI</td>
			<td>555562S</td>
			<td>Surgical tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond tissue adhesive</td>
			<td>3M</td>
			<td>084-1469SB</td>
			<td>Preparing tissue surface for dental acrylic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic mixing tray</td>
			<td>Jack Richeson</td>
			<td>420716</td>
			<td>Mixing dental acrylic agent with accelerant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orthojet dental acrylic</td>
			<td>Lang Dental</td>
			<td>1520BLK, 1503BLK</td>
			<td>Permanently bonding backplate to tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small round cover glass, #1 thickness, 3 mm</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>64-0720</td>
			<td>optical window</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td>For aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td>For aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td>For aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td>For aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#183;6H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td>For aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10035-04-8</td>
			<td>For aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen</td>
			<td>Rimadyl</td>
			<td>QM01AE91</td>
			<td>Analgesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriostatic water</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>2587428</td>
			<td>Diluent for carprofen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>11695-6776-2</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactated ringer solution</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>0338-0117-04</td>
			<td>Hydration for mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose High EEO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9793</td>
			<td>gel point 34-37 degrees C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opthalmic lubricating ointment</td>
			<td>Akwa Tears</td>
			<td>68788-0697</td>
			<td>Prevent corneal drying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOM Two-Photon Microscope</td>
			<td>Sutter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laminectomy and spinal cord window implantation in the mouse

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Rückenmarkslaminektomie und Glasfensterimplantation zur In-vivo-Bildgebung des Mausrückenmarks. Ein integrierter digitaler Verdampfer wird verwendet, um eine stabile Anästhesieebene bei einer niedrigen Durchflussrate von Isofluran zu erreichen. Eine einzelne Wirbelsäule wird entfernt und ein handelsübliches Deckglas auf einem dünnen Agarosebett überlagert. Anschließend wird eine 3D-gedruckte Kunststoff-Rückplatte mit Gewebekleber und Zahnzement an den angrenzenden Wirbeldornen befestigt. Eine Stabilisierungsplattform wird verwendet, um Bewegungsartefakte durch Atmung und Herzschlag zu reduzieren. Diese schnelle und klemmfreie Methode eignet sich gut für die akute Multiphotonenfluoreszenzmikroskopie. Repräsentative Daten sind für eine Anwendung dieser Technik auf die Zwei-Photonen-Mikroskopie der Rückenmarksvaskulatur bei transgenen Mäusen enthalten, die eGFP:Claudin-5 exzessiv exzessiv exzessither exemiten: ein enges Knotenprotein.

Implantierte Glasfenster und die intravitale Zwei-Photonen-Mikroskopie sind ein nützliches Werkzeug zur Beurteilung dynamischer Veränderungen in ZNS-Proteinen. Die funktionelle Integrität des BBB wird durch die Expression, subzelluläre Lokalisierung und Fluktuationsraten von engen Knotenproteinenbeeinflusst 7. Frühere Studien haben gezeigt, dass enge Knotenproteine schnell und dynamisch im stationären Zustand8umgebaut werden. Die derze...

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Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

Dieses Protokoll beschreibt die Implantation eines Glasfensters auf das Rückenmark einer Maus, um die Visualisierung durch intravitale Mikroskopie zu erleichtern.

Laminektomie und Rückenmarksfenster-Implantation in der Maus

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der Proteindynamik in vivo innerhalb des intakten Zentralnervensystems, um Fragen in der Neurowissenschaft und Immunologie zu beantworten. Die Hauptvorteile dieses Verfahrens sind eine ausgezeichnete Bewegungsstabilität für die Bildaufnahme, kurze chirurgische Zeit, reduzierte Bedienerexposition gegenüber gasförmiger Anästhesie und kostengünstige anpassbare Backplates. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da es schwierig ist, den Knochen zu entfernen, ohne das eng darunter liegende Gewebe des Nervensystems während der Laminektomieschritte des Verfahrens zu beschädigen.Bevor Sie mit dem Verfahren beginnen, verwenden Sie die vom 3D-Computer unterstützte Entwurfssoftware, um ein Modell für die angegebenen Dimensionen zu erstellen. Wir haben also ein Objekt, das das dreidimensionale Objekt ist, mit dem wir beginnen können. Was ich dann tun kann, ist, dass wir Einstellungen für die Druckversion setzen können.Wenn ich also dies bearbeiten öffne, gehe in Erweitert, öffne ein Fenster, in dem ich alle diese Einstellungen anzeigen kann. Stellen Sie die Düsentemperatur auf 205 Grad Celsius, die Betttemperatur auf 45 Grad Celsius und die Druckgeschwindigkeit auf 45 Millimeter pro Sekunde auf einem 3D-Drucker ein. Verwenden Sie eine 0,4 Millimeter heiße Düse und eine Schichthöhe von 0,2 Millimetern, um die hinteren Platten zu drucken.Bewerten Sie dann die bedruckten Rückplatten visuell auf ihre strukturelle Integrität. Grobe Strukturelle Fehler deuten auf Druckfehler hin. Wenn die Hinterplatten fertig sind, legen Sie den Kopf einer acht bis zwölf Wochen alten anästhesierten Maus auf ein Heatpad zwischen den Ohrstangen eines chirurgischen Restrainers und tragen Sie Salbe auf die Augen des Tieres auf.Nach der Bestätigung eines Mangels an Reaktion auf Zehenkneifung, verwenden Sie eine Nummer 11 Klinge, um eine 1,5 Zentimeter rostrale zu kaudalen Mittellinie Schnitt über die untere Thorax-Oberlumkörper-Bereich zu machen und trennen Sie die Haut von der Peritoneum. Verwenden Sie Zangen, um das verbleibende transparente Bindegewebe unter der Haut zurückzuziehen, um die oberflächliche Muskulatur freizulegen. Verdrängen Sie die Muskeln mit einem Schaum chirurgischen Speer zusammen mit der verbleibenden tieferen Muskulatur des Zielwirbels.Um einen Sitz für die Rückenplatte zu schaffen, löschen Sie den Muskel vom hinteren Aspekt der Brust 11 und dem vorderen Aspekt von Thorax 13. Mit Zangen, um den verbleibenden Muskel von den Sehnen zu entfernen, wenn nötig. Wenn der gesamte Muskel entfernt wurde, schneiden Sie die Sehnen vorsichtig mit Zangen, bis genügend Platz für die Visualisierung und Manipulation des Rückenmarks erreicht ist.Bestätigen Sie, dass die Dura mater des Intervertebral-Raums, der halbtransparente laminare Knochen, das zentrale oberflächliche Blutgefäß unter dem Knochen und die anterior estrahlende Arterie deutlich sichtbar sind. Befeuchten Sie den Bereich mit warmer künstlicher zerebraler Rückenmarksflüssigkeit und verwenden Sie einen Mikrobohrer, um den laminaren Knochen mit geraden Strichen parallel zur langen Achse des Rückenmarks zu verdünnen. Sanft den oberflächlichen Spinnprozess mit Zangen erfassen, den Wirbel heben.Der Knochen sollte leicht wegheben. Verwenden Sie Nummer vier Zangen, um alle Knochenscherben zu entfernen, jede Blutung mit einem chirurgischen Speer und sanften stetigen Druck bei Bedarf zu kontrollieren. Dann spülen Sie das Gewebe mit warmer künstlicher zerebraler Rückenmarksflüssigkeit ab.Für die Abdeckung Glasimplantation, tragen Sie vorsichtig eine drei Millimeter Borosilikat Abdeckung Glas auf die freiliegende Schnur. Verwenden Sie einen kleinen Spachtel, um 39 Grad Celsius erwärmt 2%Agarose an den Rand des Glases auftragen und Kapillarwirkung erlauben, um die Agarose unter die Abdeckung Glasoberfläche zu ziehen. Gewebekleber auf die exponierten knöchernen Gelenkprozesse des intakten benachbarten Wirbels auf der Brustebene 11 und 13 Wirbeldornen auftragen.Tragen Sie zusätzlichen Gewebekleber in einem Ring um die Laminektomie-Stelle über die angrenzende Sehne und den Querprozess auf. Als nächstes verwenden Sie einen neuen Spachtel, um Zahnzement mit Beschleuniger gemischt auf die Gewebeklebeschicht aufzutragen und legen Sie eine Rückplatte auf das chirurgische Feld zentriert über dem Abdeckungsglasfenster. Das Auftragen mehrerer dünner Schichten von Zahnzement führt zu einer stärkeren Rückplattenhaftung, aber achten Sie darauf, die Hinterplatte schnell zu platzieren, bevor der Zahnzement zu trocknen beginnt.Nachdem Sie den Zahnzement für 10 Minuten aushärten lassen, füllen Sie die Innenbasis und die Unterseite des hinteren Platzes mit zusätzlichem Klebstoff. Das Auftragen des Zahnzements in dünnen Schichten kann dazu beitragen, das Risiko einer Zementausbreitung auf das Deckglas und die Agarose zu reduzieren, was das gesamte Protokoll gefährden kann. Wenn der Zahnzement getrocknet ist, einen gegabelten Rückblechhalter an die entsprechende Position über dem Fenster auftragen und die Rückplatte in den hinteren Plattenhalter schrauben.Dann tragen Sie Kochsaline auf die Hinterplatte auf, um auf Leckage zu testen. Das Tier und die Operationsplattform können dann auf den optischen Tisch eines zwei Photonenmikroskops zur Bildgebung durch das Deckglasfenster übertragen werden. In diesem repräsentativen Experiment wurde EGFP-positives Claudin-5 innerhalb der fluoreszierend dichten Knoten in einem Gefäßplexus visualisiert.Die klare Abgrenzung der engen Anschlussstrukturen in der Z-Projektion zeigt an, dass nach einer erfolgreichen Laminektomie, Fensterplatzierung und Rückplattenimplantation eine minimale XY-Bildverschiebung entsteht. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass diese Mikrochirurgie schwierig ist und einige Zeit in Anspruch nehmen kann. Nach der Beherrschung kann diese Operation jedoch in ca. 30 Minuten durchgeführt werden.Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden, wie zwei Photonenmikroskopie und In-vivo-Bildgebung, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen über neurovaskuläre Remodellierung und andere Krankheitsprozesse mit dem Rückenmark zu beantworten.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Dissection und Kultur kommissuralen Nervenzellen aus embryonalen Rückenmark

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Forschung

Neurowissenschaften

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Spinal Cord Elektrophysiologie II: Extrazelluläre Saugelektrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In-vivo-Imaging von der Maus Spinal Cord mit Zwei-Photonen-Mikroskopie

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Stereotaktische Injektion eines viralen Vektors für Conditional Gene Manipulation im Maus-Rückenmark

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Rückenmarksdurchtrennung in der Zebrafisch-Larven

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Ein Verfahren für die Implantation eines Spinal Kammer für Längs<em&gt; In-vivo-</em&gt; Imaging der Maus Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Zwei-Photonen-Imaging von Zelluläre Dynamik in der Maus Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Imaging Serotonerge Fasern im Rückenmark der Maus Mit der CLARITY / CUBIC Technik

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Neuronalen Aktivität im primären somatosensorischen Cortex mit Thy1Imaging-GCaMP6s transgene Mäuse

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Intra-arterielle Lieferung von neuronalen Stammzellen an das Ratten- und Maushirn: Anwendung auf zerebrale Ischämie

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...