Name: laminectomy and spinal cord window implantation in the mouse
Uploaded: 2019-10-23T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse at JoVE.com

S.E. לוץ נתמך על ידי המרכז הלאומי לקידום המדעים הטרנסלאומיים, המכון הלאומי לבריאות, תחת גרנט KL2TR002002 ואוניברסיטת אילינוי שיקגו המכללה להתחלת הרפואה. סיימון Alford נתמך על ידי RO1 MH084874. התוכן הוא רק באחריות המחברים ואינו מייצג בהכרח את ההשקפות הרשמיות של ה-NIH. המחברים מודים לdritan Agalliu במחלקה לנוירולוגיה במרכז הרפואי של אוניברסיטת קולומביה, עבור העכברים Tg-5, הידברות המדעית והתובנות לגבי פיתוח הפרוטוקול הכירורגי ויישומי ההדמיה. המחברים מודים סוניל P. גנדי במחלקה לנוירוביולוגיה והתנהגות באוניברסיטת קליפורניה, אירווין לעיצוב האבטיפוס הראשון של מנגנון הסטריאוטקטיקה ובקר בעלי החיים, דיון בפרוטוקול הכירורגי ו אימונים. במיקרוסקופיה של שתי פוטון המחברים גם מודים לסטיב פיקנס (Nuhsbaum, Inc) לקבלת סיוע בהתאמה אישית של stereomicroscope כירורגי, רון ליפסקי (ייצור לוויתן) לעיבוד חלקי סטריאוטקטיקה.

כל הניסויים הולכים בעקבות האוניברסיטה של אילינוי, שיקגו מוסדית לטיפול בבעלי חיים ופרוטוקולי הוועדה. . זהו תהליך סופני
1. הכנה מגיב
<ol><li>הכנת נוזל השדרה מלאכותי מוחין (aCSF) כדי להכיל 125 mM הנאקל, 5 מ"מ KCl, 10 מ"מ גלוקוז, 10 מ"מ HEPES, 2 מ"מ MgCl2 ·6h 2 o, 2 מ"מ cacl2· 2H2o ב Ddh2...

<ol>
	<li>Weinger, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+cellular+dynamics+in+the+mouse+spinal+cord.">Two-photon imaging of cellular dynamics in the mouse spinal cord.</a> Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).</li><li>Davalos, D., Akassoglou, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+the+mouse+spinal+cord+using+two-photon+microscopy.">In vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), (2012).</li><li>Farrar, M. J., Schaffer, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+procedure+for+implanting+a+spinal+chamber+for+longitudinal+in+vivo+imaging+of+the+mouse+spinal+cord.">A procedure for implanting a spinal chamber for longitudinal in vivo imaging of the mouse spinal cord.</a> Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).</li><li>Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implanting+glass+spinal+cord+windows+in+adult+mice+with+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">Implanting glass spinal cord windows in adult mice with experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Journal of Visualized Experiments. (82), e50826 (2013).</li><li>Figley, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+spinal+cord+window+chamber+model+for+in+vivo+longitudinal+multimodal+optical+and+acoustic+imaging+in+a+murine+model.">A spinal cord window chamber model for in vivo longitudinal multimodal optical and acoustic imaging in a murine model.</a> PLOS ONE. 8 (3), e58081 (2013).</li><li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+tissue+two-photon+microscopy.">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).</li><li>Liebner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+morphology+of+the+blood-brain+barrier+in+health+and+disease.">Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease.</a> Acta Neuropathologica. 135 (3), 311-336 (2018).</li><li>Shen, L., Weber, C. R., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tight+junction+protein+complex+undergoes+rapid+and+continuous+molecular+remodeling+at+steady+state.">The tight junction protein complex undergoes rapid and continuous molecular remodeling at steady state.</a> Journal of Cell Biology. 181 (4), 683-695 (2008).</li><li>Knowland, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stepwise+recruitment+of+transcellular+and+paracellular+pathways+underlies+blood-brain+barrier+breakdown+in+stroke.">Stepwise recruitment of transcellular and paracellular pathways underlies blood-brain barrier breakdown in stroke.</a> Neuron. 82, 1-15 (2014).</li><li>Lutz, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caveolin1+Is+Required+for+Th1+Cell+Infiltration,+but+Not+Tight+Junction+Remodeling,+at+the+Blood-Brain+Barrier+in+Autoimmune+Neuroinflammation.">Caveolin1 Is Required for Th1 Cell Infiltration, but Not Tight Junction Remodeling, at the Blood-Brain Barrier in Autoimmune Neuroinflammation.</a> Cell Reports. 21 (8), 2104-2117 (2017).</li><li>Harrison, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebral+landmarks+for+the+identification+of+spinal+cord+segments+in+the+mouse.">Vertebral landmarks for the identification of spinal cord segments in the mouse.</a> Neuroimage. 68, 22-29 (2013).</li><li>Cupido, A., Catalin, B., Steffens, H., Kirchhoff, F., Bakota, L., Brandt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laser Scanning Microscopy and Quantitative Image Analysis of Neuronal Tissue. , 37-50 (2014).</li><li>Sekiguchi, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+large-scale+cellular+activity+in+spinal+cord+of+freely+behaving+mice.">Imaging large-scale cellular activity in spinal cord of freely behaving mice.</a> Nature Communications. 7, 11450 (2016).</li><li>Nadrigny, F., Le Meur, K., Schomburg, E. D., Safavi-Abbasi, S., Dibaj, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser-scanning+microscopy+for+single+and+repetitive+imaging+of+dorsal+and+lateral+spinal+white+matter+in+vivo.">Two-photon laser-scanning microscopy for single and repetitive imaging of dorsal and lateral spinal white matter in vivo.</a> Physiological Research. 66 (3), 531-537 (2017).</li><li>Adelsperger, A. R., Bigiarelli-Nogas, K. J., Toore, I., Goergen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+Low-flow+Digital+Anesthesia+System+for+Mice+and+Rats.">Use of a Low-flow Digital Anesthesia System for Mice and Rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).</li><li>Damen, F. W., Adelsperger, A. R., Wilson, K. E., Goergen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Traditional+and+Integrated+Digital+Anesthetic+Vaporizers.">Comparison of Traditional and Integrated Digital Anesthetic Vaporizers.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (6), 756-762 (2015).</li><li>Miyamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+COX-2+inhibitor+celecoxib+prevents+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+through+COX-2-independent+pathway.">Selective COX-2 inhibitor celecoxib prevents experimental autoimmune encephalomyelitis through COX-2-independent pathway.</a> Brain. 129 (Pt 8), 1984-1992 (2006).</li><li>Muthian, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COX-2+inhibitors+modulate+IL-12+signaling+through+JAK-STAT+pathway+leading+to+Th1+response+in+experimental+allergic+encephalomyelitis.">COX-2 inhibitors modulate IL-12 signaling through JAK-STAT pathway leading to Th1 response in experimental allergic encephalomyelitis.</a> Journal of Clinical Immunology. 26 (1), 73-85 (2006).</li></ol>

השיטה המתוארת כאן מאפשרת הדמיה יציבה של חוט השדרה בעכברים דרך חלון זכוכית. שיטה זו הוחל על הערכת שיפוץ BBB ב-הטרנסגניים eGFP: Claudin5 +/-עכברים המבטאים חלבון מהיר BBB הצומת צר, אבל זה יכול להיות מיושם גם היטב למחקרים של חלבונים פלורסנט או תאים בחוט השדרה.
פותחו מספר שיטות לניתוח למינצ?...

דגמי החיות הטרנסגניים מבטאים חלבונים פלורסצנט, כאשר הם משולבים עם מיקרוסקופ אינטרטל, מספקים פלטפורמה רבת עוצמה לטיפול בביולוגיה ופתופסולוגיה. כדי להחיל טכניקות אלה על חוט השדרה, פרוטוקולים מיוחדים נדרשים להכין את חוט השדרה עבור הדמיה. אסטרטגיה אחת כזו היא לבצע כריתת למינציה והשתלת חלון חוט השדרה. התכונות המרכזיות של פרוטוקול כריתת למינציה אידיאלית למיקרוסקופיה כוללות שימור מבנה ותפקוד של רקמות מקוריות, יציבות של שדה ההדמיה, זמן עיבוד מהיר ושלילת תוצאות. אתגר מסוים הוא לייצב את שדה ההדמיה נגד התנועה הנגרמת על ידי נשימה ודופק. מספר vivo ex ואסטרטגיות vivo דווחו כדי להשיג את המטרות הללו1,2,3,4,5. רוב בשיטות vivo כרוכות לאורך הדרך בעמוד השדרה2,4 ולעתים קרובות לאחר מכן על ידי השתלת מנגנון מתכת נוקשה3,4 עבור יציבות במהלך הניתוח ו יישומי דימות במורד הזרם. לחיץ את עמוד השדרה יכול להתפשר על זרימת הדם ולגרום דם-מוח מחסום (BBB) שיפוץ חלבון.
מטרת שיטה זו היא להפוך את חוט השדרה שלמים זמין לדימות אופטי בעכבר החי תוך מזעור הפלישה של הפרוטוקול ושיפור התוצאות. אנו מתארים כריתת למינציה אחת וכיסוי השתלת זכוכית הליך לזווג עם מינימלית פולשנית האליפסה 3d מודפס מתכתי שעדיין משיגה יציבות מכנית חזקה. לוחית הגיבוי היא דבקה ישירה השדרה הקדמית והאחורי החוליות עם מלט שיניים. הלוחית האחורית מצוידת בזרועות הארכה לרוחב עם חורי בורג שמתחברים באופן נוקשה לשלב המיקרוסקופ דרך זרוע מתכת. זה מעגן ביעילות את החוליה הקדמית והאחורי ללא שינוי לשלב המיקרוסקופ, מתן עמידות מכנית לחפץ התנועה שאחרת הוכנסו על ידי נשימה ודופק. השיטה ממוטבת עבור כריתת למינציה של חוליה אחת ברמת בית החזה 12, השמטת את התפסים מנוצל אסטרטגיות חלופיות ליציבות במהלך הדמיה vivo . ההליך הוא מהיר, לוקח כ 30 דקות לכל עכבר.
פרוטוקול זה יכול לשמש לחקר מנגנוני המחלות של BBB. Bbb הוא מערכת דינמית מיקרוסקולרית מורכבת של תאים אנדותל, שריר חלק כלי הדם, קרום הלב, ו אסטרוציט ברגל תהליכים המספקים סביבה סלקטיבית מאוד עבור מערכת העצבים המרכזית (cn). נתונים מייצגים מתארים את היישום של פרוטוקול זה בעכברים טרנסגניים הנדסה לבטא חלבון פלורסנט ירוק משופר (eGFP): קלאודין 5, חלבון BBB צר הצומת. ניתן גם להתאים אישית את קבצי ההדפסה מלוח הרקע עבור יישומים חלופיים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D printer</td>
			<td>Raise3D</td>
			<td>Pro2</td>
			<td>For printing backplates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLA 3D printing filament</td>
			<td>Inland</td>
			<td>PLA+-175-B</td>
			<td>Black plastic 3D printing material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D CAD software</td>
			<td>Dassault Systemes</td>
			<td>Solidworks software</td>
			<td>used to design 3D shapes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printer software</td>
			<td>Raise3D</td>
			<td>Ideamaker software</td>
			<td>software used to interface with the 3D printer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printed oval backplate</td>
			<td>custom</td>
			<td></td>
			<td>Stabilizing imaging field</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M205 C</td>
			<td>Equipped with Leica FusionOptics, Planapo 0.63x M-series objective, and gliding stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MC170</td>
			<td>HD color camera for visualizing surgical field</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gliding stage</td>
			<td>Leica</td>
			<td>10446301</td>
			<td>The gliding stage is constructed of two metal plates. The base plate is fixed. The upper plate slides on greased interface to allow rotational and linear movement.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical station and stabilization fork</td>
			<td>Whale Manufactoring</td>
			<td>custom</td>
			<td>Laminectomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SomnoSuite low-flow isoflurane delivery unit</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>SS-01</td>
			<td>Surgical anesthesia administration with integrated digitial vaporizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel 1.5 inch mounting post</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>P50/M</td>
			<td>For mounting surgical station onto optical table for two-photon imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counterbored Clamping Fork for 1.5&#34; mounting Post</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>PF175</td>
			<td>For stabilizing surgical station mount onto optical table for two-photon imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ideal bone microdrill</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>72-6065</td>
			<td>Thinning bone for laminectomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-462-10</td>
			<td>Warming saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cautery gun</td>
			<td>FST</td>
			<td>18010-00</td>
			<td>Cauterizing minor bleeds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>BF11222</td>
			<td>1.9&#8221; x 4.5&#8221; silicone heater with 20&#8221; Teflon leads, 10W, 5V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K type thermocoupled rectal probe</td>
			<td>Physitemp</td>
			<td>RET3</td>
			<td>Measuring mouse body temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petroleum jelly</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>8009-03-8</td>
			<td>Lubricating rectal probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feedback-regulated thermal controller</td>
			<td>custom</td>
			<td>NA</td>
			<td>Commercially available alternatives include the Physitemp TCAT series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVA Surgical eye spears</td>
			<td>Beaver-visitec international</td>
			<td>40400-8</td>
			<td>Absorbing blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric trimmer</td>
			<td>Wahl</td>
			<td>41590-0438</td>
			<td>Trimming mouse fur</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blade, #11</td>
			<td>FST</td>
			<td>14002-14</td>
			<td>Surgical tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, #5</td>
			<td>FST</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>Surgical tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, #4</td>
			<td>FST</td>
			<td>14002-14</td>
			<td>Surgical tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titatnium toothed forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>555047FT</td>
			<td>Surgical tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium Iris scissors</td>
			<td>WPI</td>
			<td>555562S</td>
			<td>Surgical tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond tissue adhesive</td>
			<td>3M</td>
			<td>084-1469SB</td>
			<td>Preparing tissue surface for dental acrylic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic mixing tray</td>
			<td>Jack Richeson</td>
			<td>420716</td>
			<td>Mixing dental acrylic agent with accelerant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orthojet dental acrylic</td>
			<td>Lang Dental</td>
			<td>1520BLK, 1503BLK</td>
			<td>Permanently bonding backplate to tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small round cover glass, #1 thickness, 3 mm</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>64-0720</td>
			<td>optical window</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td>For aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td>For aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td>For aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td>For aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#183;6H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td>For aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10035-04-8</td>
			<td>For aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen</td>
			<td>Rimadyl</td>
			<td>QM01AE91</td>
			<td>Analgesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriostatic water</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>2587428</td>
			<td>Diluent for carprofen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>11695-6776-2</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactated ringer solution</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>0338-0117-04</td>
			<td>Hydration for mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose High EEO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9793</td>
			<td>gel point 34-37 degrees C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opthalmic lubricating ointment</td>
			<td>Akwa Tears</td>
			<td>68788-0697</td>
			<td>Prevent corneal drying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOM Two-Photon Microscope</td>
			<td>Sutter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laminectomy and spinal cord window implantation in the mouse

פרוטוקול זה מתאר שיטה לניתוח חוט השדרה והשרשה חלון זכוכית עבור vivo הדמיה של חוט השדרה של העכבר. מאדה דיגיטלית משולבת מנוצל כדי להשיג מישור יציב של הרדמה בקצב נמוך בזרימה של isofלוריאן. עמוד שדרה אחד בחוליות מוסר, וזכוכית כיסוי מסחרית זמינה מצופה על מיטה דקה. הרקע פלסטיק 3D מודפס לאחר מכן מודבקת את השדרה השדרה הסמוכה באמצעות דבק רקמה ושיניים מלט. פלטפורמת ייצוב משמש כדי להפחית את התנועה מתוך נשימה ודופק. שיטה מהירה ונטולת מלחציים זו מתאימה היטב למיקרוסקופיה חריפה מרובת פוטון. נתונים מייצגים כלולים עבור יישום של טכניקה זו לשני פוטון המיקרוסקופיה של חוט השדרה ומיקרולטורה בעכברים טרנסגניים המבטא eGFP: קלאודין-5 – חלבון הצומת צר.

חלונות זכוכית מושתלים ומיקרוסקופ שני-פוטון מספק כלי שימושי להערכת שינויים דינמיים בחלבונים של המערכת. השלמות הפונקציונלית של BBB מושפעת מהביטוי, לוקליזציה תת-תאית ושיעורי תחלופה של חלבונים בעלי צומת צר7. מחקרים קודמים הוכיחו כי חלבונים הצומת צר עוברים שיפוץ ...

Watch this Scientific Journal Video about Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse at JoVE.com

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

פרוטוקול זה מתאר השרשה של חלון זכוכית אל חוט השדרה של העכבר כדי להקל על ההדמיה על ידי המיקרוסקופיה.

כריתת למינציה ואת חוט השדרה חלון השרשה בעכבר

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

שיטה זו מאפשרת בדיקה של דינמיקת החלבון ב- vivo בתוך מערכת העצבים המרכזית ללא פגע כדי לענות על שאלות במדעי המוח ואימונולוגיה. היתרונות העיקריים של הליך זה הם יציבות תנועה מצוינת לרכישת תמונה, זמן ניתוחי קצר, חשיפה מופחתת מפעיל הרדמה גזית, ו backplates להתאמה אישית זול. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית קשה להסיר את העצם מבלי לפגוע ברקמת מערכת העצבים הבסיסית במהלך שלבי כריתת המעי הגס של ההליך.לפני תחילת ההליך, השתמש בתוכנת עיצוב בעזרת מחשב תלת-ממדי כדי ליצור מודל לממדים שצוינו. אז יש לנו חפץ, שהוא האובייקט התלת מימדי, עם זה אנחנו יכולים להתחיל. מה שאני יכול לעשות אז הוא אנחנו יכולים לשים הגדרות על זה עבור גירסת ההדפסה.אז אם אני פותח את ערוך את זה, להיכנס מתקדם, לפתוח חלון המאפשר לי להסתכל על כל ההגדרות האלה. הגדר את טמפרטורת הזרבובית ל-205 מעלות צלזיוס, את טמפרטורת המיטה ל-45 מעלות צלזיוס ואת מהירות ההדפסה ל-45 מילימטרים לשנייה במדפסת תלת-ממד. השתמש בזרבובית ent חמה 0.4 מילימטר וגובה שכבה של 0.2 מילימטר כדי להדפיס את הלוחות האחוריים.לאחר מכן להעריך את הלוחות האחוריים המודפסים חזותית לשלמות המבנית שלהם. כשלים מבניים חמורים מצביעים על פגמים בהדפסה. כאשר הצלחות האחוריות מוכנות, מניחים את ראשו של עכבר הרדמה בן שמונה עד 12 שבועות על כרית חום בין פסי האוזן של מרסן כירורגי ולהחיל משחה על העיניים של החיה.לאחר אישור חוסר תגובה קמצוץ בוהן, להשתמש בלהב מספר 11 כדי להפוך את rostral 1.5 ס"מ כדי caudal חתך קו האמצע מעל אזור המותני העליון בית החזה התחתון ולהפריד את העור מן הצדת. השתמש במקלפים כדי לקלף בחזרה כל רקמת חיבור שקופה שנותרה מתחת לעור כדי לחשוף את השרירים השטחיים. לעקור את השרירים עם חנית כירורגית קצף יחד עם השרירים העמוקים הנותרים של חוליית היעד.כדי ליצור מושב עבור הצלחת האחורית, לנקות את השריר מן ההיבט האחורי של בית החזה 11 ואת ההיבט הקדמי של בית החזה 13. שימוש במדפים כדי להסיר את השריר הנותר מן הגידים לפי הצורך. כאשר כל השריר הוסר, בזהירות לחתוך את הגידים עם מדחיפים עד מספיק מקום לדמיין ולתפעל את חוט השדרה מושגת.אשר כי מאטר דורה של החלל הבין חולייתי, עצם למינאר חצי תדר, כלי הדם השטחי המרכזי מתחת לעצם, ואת העורק המקרין לפנים גלויים בבירור. הרטב את האזור בנוזל מוח מלאכותי חם ולהשתמש מיקרו-מקדחה כדי לדלל את עצם למינאר באמצעות משיכות ישרות במקביל לציר הארוך של חוט השדרה. תופסים בעדינות את התהליך השטחי עם מטחנות, מרימים את החוליה.העצם צריכה להרים בקלות. השתמש במדפים מספר ארבע כדי לנקות את כל שברי העצם, שליטה בכל דימום עם חנית כירורגית ולחץ יציב עדין לפי הצורך. לאחר מכן שטפו את הרקמה בנוזל מוח מלאכותי חם.להשתלת זכוכית כיסוי, בעדינות להחיל זכוכית כיסוי borosilicate שלושה מילימטר על כבל חשוף. השתמש מרית קטנה כדי להחיל 39 מעלות צלזיוס התחמם 2% agarose על קצה הזכוכית ולאפשר פעולה נימי לצייר את agarose מתחת למשטח זכוכית כיסוי. החל דבק רקמות על תהליכי פרקי גרמי חשוף של החוליה הסמוכה שלם ברמה החזה 11 ו 13 קוצים חולייתיים.החל דבק רקמה נוסף בטבעת סביב אתר כריתת למין מעל הגיד הסמוך ואת התהליך הרוחבי. לאחר מכן, השתמש מרית חדשה כדי להחיל מלט שיניים מעורבב עם מאיץ על שכבת דבק הרקמה ולהחיל צלחת אחורית על השדה כירורגי מרוכז מעל חלון זכוכית כיסוי. החלת שכבות דקות מרובות של מלט דנטלי גורמת להיתוך חזק יותר של צלחת אחורית, אך הקפד למקם את הצלחת האחורית במהירות לפני שהמלט הדנטלי מתחיל להתייבש.לאחר מתן מלט שיניים לרפא במשך 10 דקות, למלא את הבסיס הפנימי ואת החלק התחתון של המקום האחורי עם דבק נוסף. החלת מלט שיניים בשכבות דקות יכול לעזור להפחית את הסיכון של מלט מתפשט על זכוכית כיסוי agarose, אשר יכול לסכן את הפרוטוקול כולו. כאשר המלט הדנטלי התייבש, יש למרוח מחזיק צלחת אחורית מנומקת על המיקום המתאים מעל החלון ולבורג את הצלחת האחורית למחזיק הצלחת האחורית.לאחר מכן להחיל מלוחים על הצלחת האחורית כדי לבדוק דליפה. לאחר מכן ניתן להעביר את החיה ואת הפלטפורמה הכירורגית לשולחן האופטי של מיקרוסקופ שני פוטון להדמיה דרך חלון הזכוכית המכסה. בניסוי מייצג זה, EGFP חיובי claudin-5 היה דמיין בתוך צמתים הדוקים שכותרתו פלואורסצנטי ברחבי מקלעת כלי דם.התיווח הברור של מבני הצומת ההדוקים בהקרנת Z מצביע על כך שתזוזת תמונה XY מינימלית מיוצרת לאחר כריתת למין מוצלחת, מיקום חלון והשתלת לוח אחורי. בעת ניסיון הליך זה חשוב לזכור כי מיקרוכירורגיה זו קשה ועשוי לקחת זמן לשלוט. עם זאת, לאחר השליטה, ניתוח זה יכול להתבצע כ 30 דקות.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כמו שני מיקרוסקופיית פוטון והדמיה של ויוו, כדי לענות על שאלות נוספות על שיפוץ כלי דם עצביים ותהליכי מחלה אחרים הקשורים לחוט השדרה.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Dissection והתרבות של נוירונים Commissural מחוט השדרה עובריים

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

חוט השדרה Electrophysiology II: ייצור תאי אלקטרודה יניקה

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

בתחום ההדמיה vivo של חוט השדרה בעזרת עכבר דו פוטון מיקרוסקופית

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

הזרקת Stereotaxic של וקטור ויראלי למניפולציה גנטית מותנית בחוט השדרה המאוס

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

חיתוך רוחב חוט השדרה בדג הזברה הזחל

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

נוהל השתלה קאמרי בעמוד השדרה לאורך<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של כבל עכבר השדרה

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

הדמיה שני פוטונים של Dynamics הסלולרי בחוט השדרה העכבר

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

הדמית סיבי serotonergic בחוט שדרת עכבר שימוש CLARITY / טכניקה מעוקבת

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

הדמיה פעילות עצבית בתוך קליפת המגע הראשי באמצעות Thy1-העכברים הטרנסגניים GCaMP6s

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

משלוח פנים-עורקי של תאי גזע עצביים למוח עכברוש ועכבר: יישום איסכמיה מוחין

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...