Name: laminectomy and spinal cord window implantation in the mouse
Uploaded: 2019-10-23T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse at JoVE.com

S.E. Lutz er støttet av National Center for fremmarsj translational Sciences, National Institutes of Health, under Grant KL2TR002002 og University of Illinois Chicago College of Medicine oppstart midler. Simon Alford er støttet av RO1 MH084874. Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og representerer ikke nødvendigvis den offisielle utsikten over NIH. Forfatterne takker Dritan Agalliu ved Institutt for Nevrologi ved Columbia University Medical Center for TG eGFP: Claudin-5 mus, vitenskapelige diskusjoner, og innsikt i utviklingen av kirurgisk protokoll og tenkelig applikasjoner. Forfatterne takker Sunil P. Gandhi i Department of nevrobiologi and Behavior ved University of California, Irvine for å designe den første prototypen av stereotactic apparater og dyr temperatur kontroller, diskusjon av kirurgisk protokoll, og opplæring i to-Foton mikroskopi. Forfatterne takker også Steve Pickens (W. Nuhsbaum, Inc.) for å få hjelp til å tilpasse kirurgiske stereomikroskopet, og Ron Sandbech (Whale Manufacturing) for maskinering stereotactic deler.

Alle eksperimenter følger University of Illinois, Chicago institusjonelle Animal Care og use Committee protokoller. Dette er en Terminal prosedyre.
1. forberedelse av reagens
<ol><li>Forbered kunstig cerebral spinalvæske (aCSF) for å inneholde 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM glukose, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl2· 6h2o, 2 mm CaCl2· 2h2o i ddH2o. sterilt filter og fryse i individuelle bruk alikvoter. Varm aCSF i et vannbad til 39 ° c før br...

<ol>
	<li>Weinger, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+cellular+dynamics+in+the+mouse+spinal+cord.">Two-photon imaging of cellular dynamics in the mouse spinal cord.</a> Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).</li><li>Davalos, D., Akassoglou, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+the+mouse+spinal+cord+using+two-photon+microscopy.">In vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), (2012).</li><li>Farrar, M. J., Schaffer, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+procedure+for+implanting+a+spinal+chamber+for+longitudinal+in+vivo+imaging+of+the+mouse+spinal+cord.">A procedure for implanting a spinal chamber for longitudinal in vivo imaging of the mouse spinal cord.</a> Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).</li><li>Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implanting+glass+spinal+cord+windows+in+adult+mice+with+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">Implanting glass spinal cord windows in adult mice with experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Journal of Visualized Experiments. (82), e50826 (2013).</li><li>Figley, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+spinal+cord+window+chamber+model+for+in+vivo+longitudinal+multimodal+optical+and+acoustic+imaging+in+a+murine+model.">A spinal cord window chamber model for in vivo longitudinal multimodal optical and acoustic imaging in a murine model.</a> PLOS ONE. 8 (3), e58081 (2013).</li><li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+tissue+two-photon+microscopy.">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).</li><li>Liebner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+morphology+of+the+blood-brain+barrier+in+health+and+disease.">Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease.</a> Acta Neuropathologica. 135 (3), 311-336 (2018).</li><li>Shen, L., Weber, C. R., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tight+junction+protein+complex+undergoes+rapid+and+continuous+molecular+remodeling+at+steady+state.">The tight junction protein complex undergoes rapid and continuous molecular remodeling at steady state.</a> Journal of Cell Biology. 181 (4), 683-695 (2008).</li><li>Knowland, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stepwise+recruitment+of+transcellular+and+paracellular+pathways+underlies+blood-brain+barrier+breakdown+in+stroke.">Stepwise recruitment of transcellular and paracellular pathways underlies blood-brain barrier breakdown in stroke.</a> Neuron. 82, 1-15 (2014).</li><li>Lutz, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caveolin1+Is+Required+for+Th1+Cell+Infiltration,+but+Not+Tight+Junction+Remodeling,+at+the+Blood-Brain+Barrier+in+Autoimmune+Neuroinflammation.">Caveolin1 Is Required for Th1 Cell Infiltration, but Not Tight Junction Remodeling, at the Blood-Brain Barrier in Autoimmune Neuroinflammation.</a> Cell Reports. 21 (8), 2104-2117 (2017).</li><li>Harrison, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebral+landmarks+for+the+identification+of+spinal+cord+segments+in+the+mouse.">Vertebral landmarks for the identification of spinal cord segments in the mouse.</a> Neuroimage. 68, 22-29 (2013).</li><li>Cupido, A., Catalin, B., Steffens, H., Kirchhoff, F., Bakota, L., Brandt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laser Scanning Microscopy and Quantitative Image Analysis of Neuronal Tissue. , 37-50 (2014).</li><li>Sekiguchi, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+large-scale+cellular+activity+in+spinal+cord+of+freely+behaving+mice.">Imaging large-scale cellular activity in spinal cord of freely behaving mice.</a> Nature Communications. 7, 11450 (2016).</li><li>Nadrigny, F., Le Meur, K., Schomburg, E. D., Safavi-Abbasi, S., Dibaj, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser-scanning+microscopy+for+single+and+repetitive+imaging+of+dorsal+and+lateral+spinal+white+matter+in+vivo.">Two-photon laser-scanning microscopy for single and repetitive imaging of dorsal and lateral spinal white matter in vivo.</a> Physiological Research. 66 (3), 531-537 (2017).</li><li>Adelsperger, A. R., Bigiarelli-Nogas, K. J., Toore, I., Goergen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+Low-flow+Digital+Anesthesia+System+for+Mice+and+Rats.">Use of a Low-flow Digital Anesthesia System for Mice and Rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).</li><li>Damen, F. W., Adelsperger, A. R., Wilson, K. E., Goergen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Traditional+and+Integrated+Digital+Anesthetic+Vaporizers.">Comparison of Traditional and Integrated Digital Anesthetic Vaporizers.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (6), 756-762 (2015).</li><li>Miyamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+COX-2+inhibitor+celecoxib+prevents+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+through+COX-2-independent+pathway.">Selective COX-2 inhibitor celecoxib prevents experimental autoimmune encephalomyelitis through COX-2-independent pathway.</a> Brain. 129 (Pt 8), 1984-1992 (2006).</li><li>Muthian, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COX-2+inhibitors+modulate+IL-12+signaling+through+JAK-STAT+pathway+leading+to+Th1+response+in+experimental+allergic+encephalomyelitis.">COX-2 inhibitors modulate IL-12 signaling through JAK-STAT pathway leading to Th1 response in experimental allergic encephalomyelitis.</a> Journal of Clinical Immunology. 26 (1), 73-85 (2006).</li></ol>

Metoden beskrevet her gir mulighet for stabil avbildning av ryggmargen i mus gjennom et glass vindu. Denne metoden har blitt brukt for å vurdere BBB remodeling i transgene eGFP: Claudin5 +/-mus som uttrykker et fluorescerende BBB stramt knutepunkt protein, men det kan brukes like godt for studier av noen fluorescerende proteiner eller celler i ryggmargen.
Flere metoder for laminectomy og rygg mARGs stabilisering er utviklet. Alle protokoller adresse stabilisere ryggmargen under Imaging og vin...

Transgene dyremodeller som uttrykker fluorescerende proteiner, kombinert med intravital mikroskopi, gir en kraftig plattform for adressering av biologi og patofysiologi. For å bruke disse teknikkene i ryggmargen, er spesialiserte protokoller som kreves for å forberede ryggmargen for Imaging. En slik strategi er å gjennomføre en laminectomy og en rygg mARGs implantat. De viktigste funksjonene i en ideell laminectomy protokoll for mikroskopi inkluderer bevaring av Native vev struktur og funksjon, stabilitet av tenkelig feltet, rask behandlingstid, og reproduserbarhet av resultater. En spesiell utfordring er å stabilisere bildefeltet mot bevegelsen indusert av åndedrett og hjerterytme. Flere ex vivo - og in vivo -strategier er rapportert for å oppnå disse målene1,2,3,4,5. De fleste in vivo metoder innebære klemme sidene av ryggsøylen2,4 og blir ofte etterfulgt av implanting et stivt metall apparat3,4 for stabilitet under kirurgi og nedstrøms bildebehandlingsprogrammer. Klemme på ryggsøylen kan potensielt kompromittere blodstrømmen og indusere blod-hjerne barriere (BBB) protein remodeling.
Hensikten med denne metoden er å gjøre intakt ryggmargen tilgjengelig for optisk tenkelig i levende mus samtidig minimere invasiveness av protokollen og forbedre utfall. Vi beskriver én enkelt laminectomy og en implantat prosedyre for dekkglass som er koblet sammen med en minimalt invasiv oval plast 3D-trykt bakplate som fortsatt oppnår robust mekanisk stabilitet. Bakplaten er direkte overholdt de fremre og bakre vertebrale pigger med Dental sement. Bakplaten er utstyrt med lateral forlengelsesarmer med skrue hull som strengt festes til mikroskopet scenen via en metall arm. Dette forankrer effektivt intakt fremre og bakre vertebra til mikroskopet scenen, noe som gir mekanisk motstand mot bevegelse gjenstand som ellers ville bli innført av åndedrett og hjerterytme. Metoden er optimalisert for laminectomy av en enkelt vertebra på bryst nivå 12, og utelater klemmene benyttet i alternative strategier for stabilitet under in vivo Imaging. Prosedyren er rask, tar ca 30 min per mus.
Denne protokollen kan brukes til å studere sykdoms mekanismer av BBB. Den BBB er en dynamisk mikrovaskulær system bestående av endothelial celler, vaskulær glatt muskel, pericytes, og astrocytt foten prosesser som gir et svært selektivt miljø for sentralnervesystemet (CNS). Representative data avbilder anvendelsen av denne protokollen i transgene mus konstruert for å uttrykke forbedret grønt fluorescerende protein (eGFP): Claudin-5, en BBB stramt veikryss protein. De med følgende utskrifts filene for bakplate kan også tilpasses for alternative bruksområder.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D printer</td>
			<td>Raise3D</td>
			<td>Pro2</td>
			<td>For printing backplates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLA 3D printing filament</td>
			<td>Inland</td>
			<td>PLA+-175-B</td>
			<td>Black plastic 3D printing material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D CAD software</td>
			<td>Dassault Systemes</td>
			<td>Solidworks software</td>
			<td>used to design 3D shapes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printer software</td>
			<td>Raise3D</td>
			<td>Ideamaker software</td>
			<td>software used to interface with the 3D printer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printed oval backplate</td>
			<td>custom</td>
			<td></td>
			<td>Stabilizing imaging field</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M205 C</td>
			<td>Equipped with Leica FusionOptics, Planapo 0.63x M-series objective, and gliding stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MC170</td>
			<td>HD color camera for visualizing surgical field</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gliding stage</td>
			<td>Leica</td>
			<td>10446301</td>
			<td>The gliding stage is constructed of two metal plates. The base plate is fixed. The upper plate slides on greased interface to allow rotational and linear movement.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical station and stabilization fork</td>
			<td>Whale Manufactoring</td>
			<td>custom</td>
			<td>Laminectomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SomnoSuite low-flow isoflurane delivery unit</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>SS-01</td>
			<td>Surgical anesthesia administration with integrated digitial vaporizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel 1.5 inch mounting post</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>P50/M</td>
			<td>For mounting surgical station onto optical table for two-photon imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counterbored Clamping Fork for 1.5&#34; mounting Post</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>PF175</td>
			<td>For stabilizing surgical station mount onto optical table for two-photon imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ideal bone microdrill</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>72-6065</td>
			<td>Thinning bone for laminectomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-462-10</td>
			<td>Warming saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cautery gun</td>
			<td>FST</td>
			<td>18010-00</td>
			<td>Cauterizing minor bleeds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>BF11222</td>
			<td>1.9&#8221; x 4.5&#8221; silicone heater with 20&#8221; Teflon leads, 10W, 5V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K type thermocoupled rectal probe</td>
			<td>Physitemp</td>
			<td>RET3</td>
			<td>Measuring mouse body temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petroleum jelly</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>8009-03-8</td>
			<td>Lubricating rectal probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feedback-regulated thermal controller</td>
			<td>custom</td>
			<td>NA</td>
			<td>Commercially available alternatives include the Physitemp TCAT series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVA Surgical eye spears</td>
			<td>Beaver-visitec international</td>
			<td>40400-8</td>
			<td>Absorbing blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric trimmer</td>
			<td>Wahl</td>
			<td>41590-0438</td>
			<td>Trimming mouse fur</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blade, #11</td>
			<td>FST</td>
			<td>14002-14</td>
			<td>Surgical tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, #5</td>
			<td>FST</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>Surgical tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, #4</td>
			<td>FST</td>
			<td>14002-14</td>
			<td>Surgical tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titatnium toothed forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>555047FT</td>
			<td>Surgical tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium Iris scissors</td>
			<td>WPI</td>
			<td>555562S</td>
			<td>Surgical tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond tissue adhesive</td>
			<td>3M</td>
			<td>084-1469SB</td>
			<td>Preparing tissue surface for dental acrylic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic mixing tray</td>
			<td>Jack Richeson</td>
			<td>420716</td>
			<td>Mixing dental acrylic agent with accelerant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orthojet dental acrylic</td>
			<td>Lang Dental</td>
			<td>1520BLK, 1503BLK</td>
			<td>Permanently bonding backplate to tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small round cover glass, #1 thickness, 3 mm</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>64-0720</td>
			<td>optical window</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td>For aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td>For aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td>For aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td>For aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#183;6H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td>For aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10035-04-8</td>
			<td>For aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen</td>
			<td>Rimadyl</td>
			<td>QM01AE91</td>
			<td>Analgesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriostatic water</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>2587428</td>
			<td>Diluent for carprofen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>11695-6776-2</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactated ringer solution</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>0338-0117-04</td>
			<td>Hydration for mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose High EEO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9793</td>
			<td>gel point 34-37 degrees C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opthalmic lubricating ointment</td>
			<td>Akwa Tears</td>
			<td>68788-0697</td>
			<td>Prevent corneal drying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOM Two-Photon Microscope</td>
			<td>Sutter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laminectomy and spinal cord window implantation in the mouse

Denne protokollen beskriver en metode for ryggmargen laminectomy og glass vindu implantation for in vivo Imaging av musen ryggmargen. En integrert Digital fordamper er benyttet for å oppnå et stabilt fly av anestesi på en lav-flow rate av isoflurane. En enkelt vertebrale ryggraden er fjernet, og en kommersielt tilgjengelig cover-glass er kledde på en tynn agarose seng. En 3D-trykt plast bakplate er deretter festet til tilstøtende vertebrale pigger ved hjelp av vev lim og Dental sement. En stabiliserings plattform brukes til å redusere bevegelses gjenstanden fra åndedrett og hjerterytme. Denne raske og klemme-fri metoden er velegnet for akutt multi-Foton fluorescens mikroskopi. Representative data er inkludert for bruk av denne teknikken til to-Foton mikroskopi i ryggmargen blodkar i transgene mus som uttrykker eGFP: Claudin-5-et stramt knutepunkt protein.

Vinduer med implantat glass og intravital to-Foton-mikroskopi gir et nyttig verktøy for å vurdere dynamiske endringer i CNS-proteiner. Den funksjonelle integriteten til BBB er påvirket av uttrykket, subcellulære lokalisering, og omløpshastighet på trange veikryss proteiner7. Tidligere studier har vist at stramme veikryss proteiner gjennomgår rask og dynamisk remodeling ved steady state8. Den beskrevne laminectomy og glass vindu prepar...

Watch this Scientific Journal Video about Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse at JoVE.com

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

Denne protokollen beskriver implantation av et glass vindu på ryggmargen på en mus for å lette visualisering av intravital mikroskopi.

Laminectomy og vindus kabel i mus

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

Denne metoden gjør det mulig å se på proteindynamikk in vivo i det intakte sentralnervesystemet for å ta opp spørsmål i nevrovitenskap og immunologi. De viktigste fordelene med denne prosedyren er en utmerket bevegelsestabilitet for bildeoppkjøp, kort kirurgisk tid, redusert operatøreksponering for gassantøvelse og billige tilpassbare bakplater. Visuell demonstrasjon av denne metoden er kritisk da det er vanskelig å fjerne beinet uten å skade det tett underliggende nervesystemet vev under laminektomi trinnene i prosedyren.Før du begynner prosedyren, bruk 3D-dataassistert designprogramvare for å lage en modell til de angitte dimensjonene. Så vi har et objekt, som er det tredimensjonale objektet, at det er det vi kan begynne med. Det jeg da kan gjøre er at vi kan sette innstillinger på det for utskriftsversjonen.Så hvis jeg åpner Rediger dette, gå inn i Avansert, åpne et vindu som gjør det mulig for meg å se på alle disse innstillingene. Sett dysetemperaturen til 205 grader Celsius, sengetemperaturen til 45 grader Celsius, og utskriftshastigheten til 45 millimeter per sekund på en 3D-skriver. Bruk en 0,4 millimeter varm ent dyse og en 0,2 millimeter laghøyde for å skrive ut bakplatene.Deretter vurderer du de trykte bakplatene visuelt for deres strukturelle integritet. Brutto strukturelle feil indikerer utskriftsfeil. Når bakplatene er klare, plasser hodet til en åtte til 12 uker gammel bedøvet mus på en varmepute mellom ørestengene på et kirurgisk begrensningsmiddel og bruk salve på dyrets øyne.Etter å ha bekreftet mangel på respons på tåklemme, bruk et nummer 11 blad for å lage en 1,5 centimeter rostral til caudal midtlinje snitt over nedre thorax øvre lumbal regionen og skille huden fra bukhinnen. Bruk tang til å skrelle tilbake eventuelle gjenværende gjennomsiktige bindevev under huden for å avsløre den overfladiske muskulaturen. Fortrenge musklene med et skum kirurgisk spyd sammen med den gjenværende dypere muskelen av målet vertebra.For å skape et sete for bakplaten, fjern muskelen fra det bakre aspektet av thorax 11 og det fremre aspektet av thorax 13. Ved hjelp av tang for å fjerne de resterende muskelen fra senene etter behov. Når hele muskelen er fjernet, kutt forsiktig senene med tang til tilstrekkelig plass til å visualisere og manipulere ryggmargen oppnås.Bekreft at dura mater av intervertebral rommet, semitransparent laminær bein, den sentrale overfladiske blodkar under beinet, og fremre utstrålende arterie er tydelig synlig. Våt regionen med varm kunstig cerebral spinalvæske og bruk en mikrobor for å tynne laminærbenet ved hjelp av rette slag parallelt med ryggmargens lange akse. Forsiktig gripe overfladisk spinøs prosess med tang, løft vertebraen.Beinet skal løfte seg lett bort. Bruk nummer fire tang for å fjerne eventuelle beinskår, kontrollere eventuelle blødninger med et kirurgisk spyd og mildt jevnt trykk etter behov. Skyll deretter vevet med varm kunstig cerebral spinalvæske.For dekselglassimplantasjon, påfør forsiktig et tre millimeter borosilikatdekselglass på den eksponerte ledningen. Bruk en liten slikkepott til å påføre 39 grader Celsius varmet 2% agarose til kanten av glasset og la kapillær handling å tegne agarose under dekselet glassoverflaten. Påfør vevslim på de eksponerte benete leddprosessene til den intakte tilstøtende vertebraen på thoraxnivå 11 og 13 vertebrale spines.Påfør ekstra vev lim i en ring rundt laminektomi området over den tilstøtende senen og tverrgående prosessen. Deretter bruker du en ny slikkepott til å påføre tannsement blandet med akselerator på vevslimlaget og legger en bakplate på det kirurgiske feltet sentrert over dekselglassvinduet. Påføring av flere tynne lag med tannsement resulterer i en sterkere bakplate vedheft, men sørg for å plassere bakplaten raskt før tannsementen begynner å tørke.Etter å ha tillatt tannsementen å kurere i 10 minutter, fyll inn innvendig base og undersiden av baksiden med ekstra lim. Påføring av tannsement i tynne lag kan bidra til å redusere risikoen for at sement sprer seg til dekkglasset og agarose, noe som kan kompromittere hele protokollen. Når tannsementen har tørket, påfør en forked bakplateholder til riktig posisjon over vinduet og skru bakplaten inn i bakplateholderen.Deretter påfør saltvann på bakplaten for å teste for lekkasje. Dyret og den kirurgiske plattformen kan deretter overføres til det optiske bordet til et to fotonmikroskop for avbildning gjennom dekselglassvinduet. I dette representative eksperimentet ble EGFP positiv claudin-5 visualisert i de fluorescerende merkede tette veikryssene gjennom en vaskulær plexus.Den klare avgrensningen av de tette koblingsstrukturene i Z-projeksjonen indikerer at minimal XY-bildeforskyvning produseres etter en vellykket laminektomi, vindusplassering og implantasjon av bakplaten. Mens du prøver denne prosedyren er det viktig å huske at dette mikrokirurgi er vanskelig og kan ta tid å mestre. Men når mestret, denne operasjonen kan utføres i ca 30 minutter.Etter denne prosedyren kan andre metoder, som to fotonmikroskopi og in vivo-avbildning, utføres for å svare på flere spørsmål om nevrovaskulær ombygging og andre sykdomsprosesser som involverer ryggmargen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo Imaging av Mouse Spinal Cord Bruke to-foton Mikroskopi

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Stereotaksiske Injeksjon av en viral vektor for betinget genmanipulering i Mouse Spinal Cord

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Spinal Cord tran i Larve Sebrafisk

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

En Prosedyre for Implantere en Spinal Chamber for Longitudinal<em&gt; I Vivo</em&gt; Imaging av Mouse Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

To-foton Imaging av Cellular Dynamics i Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Imaging Serotonerge Fibers i Mouse Spinal Cord Bruke CLARITY / CUBIC Technique

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging nevrale aktivitet i primære Somatosensory Cortex ved hjelp av Thy1-GCaMP6s transgene mus

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Intraarteriell levering av nevrale stamceller til rotte- og mushjernen: Søknad om cerebral iskemi

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...