Name: laminectomy and spinal cord window implantation in the mouse
Uploaded: 2019-10-23T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse at JoVE.com

S.E. Lutz поддерживается Национальным центром продвижения трансляционных наук, Национальными институтами здравоохранения под руководством Гранта KL2TR002002 и начального медицинского фонда Чикагского медицинского колледжа. Саймона Алфорда поддерживает RO1 MH084874. Содержание является исключительно ответственностью авторов и не обязательно отражает официальные взгляды NIH. Авторы благодарят Дритан Agalliu в кафедре неврологии в Колумбийском университете медицинский центр для Tg eGFP: Claudin-5 мышей, научных дискуссий, а также понимание развития хирургического протокола и изображений приложений. Авторы благодарят Сунила. Ганди на кафедре нейробиологии и поведения Калифорнийского университета в Ирвине за разработку первого прототипа стереотаксического аппарата и контроллера температуры животных, обсуждение хирургического протокола и обучение двухфотонной микроскопии. Авторы также благодарят Стива Пикенса (W. Nuhsbaum, Inc.) за помощь в настройке хирургического стереомикроскопа и Рона Липински (Производство китов) за обработку стереотактических деталей.

Все эксперименты следуют протоколам Комитета по институциональному уходу и использованию животных ВУЗа. Это терминальная процедура.
1. Подготовка реагента
<ol><li>Подготовка искусственного спинного мозга (aCSF), чтобы содержать 125 мМ NaCl, 5 мм KCl, 10 мм глюкозы, 10 мМ HEPES, 2 мМ MgCl2<...

<ol>
	<li>Weinger, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+cellular+dynamics+in+the+mouse+spinal+cord.">Two-photon imaging of cellular dynamics in the mouse spinal cord.</a> Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).</li><li>Davalos, D., Akassoglou, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+the+mouse+spinal+cord+using+two-photon+microscopy.">In vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), (2012).</li><li>Farrar, M. J., Schaffer, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+procedure+for+implanting+a+spinal+chamber+for+longitudinal+in+vivo+imaging+of+the+mouse+spinal+cord.">A procedure for implanting a spinal chamber for longitudinal in vivo imaging of the mouse spinal cord.</a> Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).</li><li>Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implanting+glass+spinal+cord+windows+in+adult+mice+with+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">Implanting glass spinal cord windows in adult mice with experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Journal of Visualized Experiments. (82), e50826 (2013).</li><li>Figley, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+spinal+cord+window+chamber+model+for+in+vivo+longitudinal+multimodal+optical+and+acoustic+imaging+in+a+murine+model.">A spinal cord window chamber model for in vivo longitudinal multimodal optical and acoustic imaging in a murine model.</a> PLOS ONE. 8 (3), e58081 (2013).</li><li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+tissue+two-photon+microscopy.">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).</li><li>Liebner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+morphology+of+the+blood-brain+barrier+in+health+and+disease.">Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease.</a> Acta Neuropathologica. 135 (3), 311-336 (2018).</li><li>Shen, L., Weber, C. R., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tight+junction+protein+complex+undergoes+rapid+and+continuous+molecular+remodeling+at+steady+state.">The tight junction protein complex undergoes rapid and continuous molecular remodeling at steady state.</a> Journal of Cell Biology. 181 (4), 683-695 (2008).</li><li>Knowland, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stepwise+recruitment+of+transcellular+and+paracellular+pathways+underlies+blood-brain+barrier+breakdown+in+stroke.">Stepwise recruitment of transcellular and paracellular pathways underlies blood-brain barrier breakdown in stroke.</a> Neuron. 82, 1-15 (2014).</li><li>Lutz, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caveolin1+Is+Required+for+Th1+Cell+Infiltration,+but+Not+Tight+Junction+Remodeling,+at+the+Blood-Brain+Barrier+in+Autoimmune+Neuroinflammation.">Caveolin1 Is Required for Th1 Cell Infiltration, but Not Tight Junction Remodeling, at the Blood-Brain Barrier in Autoimmune Neuroinflammation.</a> Cell Reports. 21 (8), 2104-2117 (2017).</li><li>Harrison, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebral+landmarks+for+the+identification+of+spinal+cord+segments+in+the+mouse.">Vertebral landmarks for the identification of spinal cord segments in the mouse.</a> Neuroimage. 68, 22-29 (2013).</li><li>Cupido, A., Catalin, B., Steffens, H., Kirchhoff, F., Bakota, L., Brandt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laser Scanning Microscopy and Quantitative Image Analysis of Neuronal Tissue. , 37-50 (2014).</li><li>Sekiguchi, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+large-scale+cellular+activity+in+spinal+cord+of+freely+behaving+mice.">Imaging large-scale cellular activity in spinal cord of freely behaving mice.</a> Nature Communications. 7, 11450 (2016).</li><li>Nadrigny, F., Le Meur, K., Schomburg, E. D., Safavi-Abbasi, S., Dibaj, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser-scanning+microscopy+for+single+and+repetitive+imaging+of+dorsal+and+lateral+spinal+white+matter+in+vivo.">Two-photon laser-scanning microscopy for single and repetitive imaging of dorsal and lateral spinal white matter in vivo.</a> Physiological Research. 66 (3), 531-537 (2017).</li><li>Adelsperger, A. R., Bigiarelli-Nogas, K. J., Toore, I., Goergen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+Low-flow+Digital+Anesthesia+System+for+Mice+and+Rats.">Use of a Low-flow Digital Anesthesia System for Mice and Rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).</li><li>Damen, F. W., Adelsperger, A. R., Wilson, K. E., Goergen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Traditional+and+Integrated+Digital+Anesthetic+Vaporizers.">Comparison of Traditional and Integrated Digital Anesthetic Vaporizers.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (6), 756-762 (2015).</li><li>Miyamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+COX-2+inhibitor+celecoxib+prevents+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+through+COX-2-independent+pathway.">Selective COX-2 inhibitor celecoxib prevents experimental autoimmune encephalomyelitis through COX-2-independent pathway.</a> Brain. 129 (Pt 8), 1984-1992 (2006).</li><li>Muthian, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COX-2+inhibitors+modulate+IL-12+signaling+through+JAK-STAT+pathway+leading+to+Th1+response+in+experimental+allergic+encephalomyelitis.">COX-2 inhibitors modulate IL-12 signaling through JAK-STAT pathway leading to Th1 response in experimental allergic encephalomyelitis.</a> Journal of Clinical Immunology. 26 (1), 73-85 (2006).</li></ol>

Описанный здесь метод позволяет стабильно сделать визуализацию спинного мозга у мышей через стеклянное окно. Этот метод был применен для оценки BBB ремоделирования в трансгенных eGFP: Claudin5 /- мышей, которые выражают флуоресцентный BBB плотный белок соединения, но он может быть применен один...

Трансгенные модели животных, выражающие флуоресцентные белки, в сочетании с интравитальной микроскопией, обеспечивают мощную платформу для решения биологии и патофизиологии. Чтобы применить эти методы к спинному мозгу, специальные протоколы необходимы для подготовки спинного мозга для визуализации. Одной из таких стратегий является проведение имплантации ламинэктомии и окна спинного мозга. Ключевыми особенностями идеального протокола ламинэктомии для микроскопии являются сохранение структуры и функции родной ткани, стабильность поля изображения, быстрое время обработки и воспроизводимость результатов. Особая задача заключается в стабилизации поля изображения против движения, вызванного дыханием и сердцебиением. Несколько ex vivo и in vivo стратегии, как сообщается, для достижения этихцелей 1,2,3,4,5. Большинство методов in vivo включают зажим сторонпозвоночника2,4 и часто сопровождается имплантированием жесткого металлического аппарата3,4 для стабильности во время операции и приложения для визуализации ниже по течению. Зажим позвоночника может потенциально поставить под угрозу кровоток и вызвать гематоэнцефалический барьер (BBB) белка ремоделирования.
Цель этого метода состоит в том, чтобы сделать неповрежденный спинной мозг доступным для оптической визуализации в живой мыши, минимизируя инвазивность протокола и улучшая результаты. Мы описываем одну процедуру имплантации ламинэктомии и крышки стекла в паре с минимально инвазивной овальной пластиковой 3D-печатной задней панелью, которая все еще достигает надежной механической стабильности. Задняя панель непосредственно прилипает к передней и задней позвоночника с зубным цементом. Задняя панель оснащена боковыми удлинительными руками с винтовыми отверстиями, которые жестко прикрепляются к стадии микроскопа через металлическую руку. Это эффективно якоря нетронутыми переднего и заднего позвонка на стадии микроскопа, обеспечивая механическое сопротивление движения артефакт, который в противном случае были бы введены дыхание и сердцебиение. Метод был оптимизирован для ламинэктомии одного позвонка на грудном уровне 12, опуская зажимы, используемые в альтернативных стратегиях стабильности во время in vivo изображений. Процедура быстрая, принимая приблизительно 30 минут в мышь.
Этот протокол может быть использован для изучения механизмов заболевания BBB. BBB является динамической микрососудистой системы, состоящей из эндотелиальных клеток, сосудистой гладкой мышцы, перицитов и астроцитов ноги процессов, которые обеспечивают весьма селективную среду для центральной нервной системы (ЦНС). Представительные данные изображают применение этого протокола в трансгенных мышах, разработанных для выражения повышенного зеленого флуоресцентного белка (eGFP):Claudin-5, плотный белок соединения BBB. Предоставленные файлы печати задней панели также могут быть настроены для альтернативных приложений.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D printer</td>
			<td>Raise3D</td>
			<td>Pro2</td>
			<td>For printing backplates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLA 3D printing filament</td>
			<td>Inland</td>
			<td>PLA+-175-B</td>
			<td>Black plastic 3D printing material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D CAD software</td>
			<td>Dassault Systemes</td>
			<td>Solidworks software</td>
			<td>used to design 3D shapes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printer software</td>
			<td>Raise3D</td>
			<td>Ideamaker software</td>
			<td>software used to interface with the 3D printer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printed oval backplate</td>
			<td>custom</td>
			<td></td>
			<td>Stabilizing imaging field</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M205 C</td>
			<td>Equipped with Leica FusionOptics, Planapo 0.63x M-series objective, and gliding stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MC170</td>
			<td>HD color camera for visualizing surgical field</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gliding stage</td>
			<td>Leica</td>
			<td>10446301</td>
			<td>The gliding stage is constructed of two metal plates. The base plate is fixed. The upper plate slides on greased interface to allow rotational and linear movement.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical station and stabilization fork</td>
			<td>Whale Manufactoring</td>
			<td>custom</td>
			<td>Laminectomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SomnoSuite low-flow isoflurane delivery unit</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>SS-01</td>
			<td>Surgical anesthesia administration with integrated digitial vaporizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel 1.5 inch mounting post</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>P50/M</td>
			<td>For mounting surgical station onto optical table for two-photon imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counterbored Clamping Fork for 1.5&#34; mounting Post</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>PF175</td>
			<td>For stabilizing surgical station mount onto optical table for two-photon imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ideal bone microdrill</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>72-6065</td>
			<td>Thinning bone for laminectomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-462-10</td>
			<td>Warming saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cautery gun</td>
			<td>FST</td>
			<td>18010-00</td>
			<td>Cauterizing minor bleeds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>BF11222</td>
			<td>1.9&#8221; x 4.5&#8221; silicone heater with 20&#8221; Teflon leads, 10W, 5V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K type thermocoupled rectal probe</td>
			<td>Physitemp</td>
			<td>RET3</td>
			<td>Measuring mouse body temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petroleum jelly</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>8009-03-8</td>
			<td>Lubricating rectal probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feedback-regulated thermal controller</td>
			<td>custom</td>
			<td>NA</td>
			<td>Commercially available alternatives include the Physitemp TCAT series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVA Surgical eye spears</td>
			<td>Beaver-visitec international</td>
			<td>40400-8</td>
			<td>Absorbing blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric trimmer</td>
			<td>Wahl</td>
			<td>41590-0438</td>
			<td>Trimming mouse fur</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blade, #11</td>
			<td>FST</td>
			<td>14002-14</td>
			<td>Surgical tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, #5</td>
			<td>FST</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>Surgical tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, #4</td>
			<td>FST</td>
			<td>14002-14</td>
			<td>Surgical tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titatnium toothed forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>555047FT</td>
			<td>Surgical tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium Iris scissors</td>
			<td>WPI</td>
			<td>555562S</td>
			<td>Surgical tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond tissue adhesive</td>
			<td>3M</td>
			<td>084-1469SB</td>
			<td>Preparing tissue surface for dental acrylic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic mixing tray</td>
			<td>Jack Richeson</td>
			<td>420716</td>
			<td>Mixing dental acrylic agent with accelerant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orthojet dental acrylic</td>
			<td>Lang Dental</td>
			<td>1520BLK, 1503BLK</td>
			<td>Permanently bonding backplate to tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small round cover glass, #1 thickness, 3 mm</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>64-0720</td>
			<td>optical window</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td>For aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td>For aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td>For aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td>For aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#183;6H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td>For aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10035-04-8</td>
			<td>For aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen</td>
			<td>Rimadyl</td>
			<td>QM01AE91</td>
			<td>Analgesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriostatic water</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>2587428</td>
			<td>Diluent for carprofen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>11695-6776-2</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactated ringer solution</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>0338-0117-04</td>
			<td>Hydration for mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose High EEO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9793</td>
			<td>gel point 34-37 degrees C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opthalmic lubricating ointment</td>
			<td>Akwa Tears</td>
			<td>68788-0697</td>
			<td>Prevent corneal drying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOM Two-Photon Microscope</td>
			<td>Sutter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laminectomy and spinal cord window implantation in the mouse

Этот протокол описывает метод для ламинэктомии спинного мозга и имплантации стекла окна для in vivo изображения спинного мозга мыши. Интегрированный цифровой испаритель используется для достижения стабильной плоскости анестезии при низкой скорости потока изолюран. Удаляется один позвоночник позвонка, а на тонкой агарозной кровати накладывается коммерчески доступное крышка. 3D-печатной пластиковой задней панели затем крепится к соседним позвоночника моль с помощью ткани клея и зубного цемента. Платформа стабилизации используется для уменьшения артефакта движения от дыхания и сердцебиения. Этот быстрый и без зажимов хорошо подходит для острой мультифотоновой флуоресценции микроскопии. Репрезентативные данные включены для применения этого метода к двухфотонической микроскопии сосуды спинного мозга у трансгенных мышей, выражающих eGFP:Claudin-5 - плотный протеин соединения.

Имплантированные стеклянные окна и интравитальная двухфотонная микроскопия являются полезным инструментом для оценки динамических изменений белков ЦНС. На функциональную целостность BBB влияет экспрессия, субклеточная локализация и скорость текучести плотных соед...

Watch this Scientific Journal Video about Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse at JoVE.com

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

Этот протокол описывает имплантацию стеклянного окна на спинной мозг мыши для облегчения визуализации с помощью внутривитой микроскопии.

Ламинэктомия и имплантация окна спинного мозга в мыши

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

Этот метод позволяет изутовить динамику протеина in vivo внутри intact центральная нервная система для того чтобы адресовать вопросы в neuroscience и иммунологии. Основными преимуществами этой процедуры являются отличная стабильность движения для получения изображения, краткое хирургическое время, снижение воздействия оператора на газозвуковой анестезии, а также недорогие настраиваемые backplates. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, как трудно удалить кости, не повреждая тесно основной ткани нервной системы во время ламинэктомии шаги процедуры.Перед началом процедуры используйте программное обеспечение для проектирования с помощью 3D-компьютера для создания модели с указанными размерами. Итак, у нас есть объект, который является трехмерным объектом, это то, с чего мы можем начать. То, что я могу сделать, это мы можем поставить настройки на том, что для печатной версии.Так что если я открою Редактировать это, перейдите в Расширенный, откройте окно, которое позволяет мне смотреть на все эти настройки. Установите температуру сопла до 205 градусов по Цельсию, температуру кровати до 45 градусов по Цельсию и скорость печати до 45 миллиметров в секунду на 3D-принтере. Используйте 0,4 миллиметра горячего сопла и высотой слоя 0,2 миллиметра для печати задних пластин.Затем оцените напечатанные задние пластины визуально для их структурной целостности. Грубые структурные сбои указывают на дефекты печати. Когда задние пластины будут готовы, поместите голову 8-12-недельной обезболивающей мыши на тепловую прокладку между ушными прутьями хирургического удерщика и нанесите мазь на глаза животного.После подтверждения отсутствия реакции на щепотку нося, используйте лезвие номер 11, чтобы сделать 1,5 сантиметра рострального каудального разреза средней линии над нижней грудной верхней поясничной области и отделить кожу от брюшной полости. Используйте типсы, чтобы очистить все оставшиеся прозрачные соединительной ткани под кожей, чтобы разоблачить поверхностные мускулатуры. Вытеснить мышцы с пеной хирургического копья вместе с оставшейся глубокой мышечной целевого позвонка.Чтобы создать сиденье для задней пластины, очистить мышцы от заднего аспекта грудной 11 и передний аспект грудной 13. Использование миппов для удаления оставшейся мышцы из сухожилий по мере необходимости. Когда все мышцы были удалены, тщательно сократить сухожилия с типсами, пока достаточно места для визуализации и манипулирования спинного мозга достигается.Подтвердите, что хорошо видна дурная матер межпозвонкового пространства, полупрозрачная ламинарная кость, центральный поверхностный кровеносный сосуд под костью и передняя излучающая артерия. Влажный регион с теплой искусственной спинномозговой жидкости и использовать микро-дрель для разжижения ламинарный кости с помощью прямых ударов параллельно длинной оси спинного мозга. Аккуратно хватая поверхностный спинной процесс типсами, поднимите позвонок.Кость должна легко отойти. Используйте миппы номер четыре, чтобы очистить любые осколки костей, контролируя любое кровотечение хирургическим копьем и нежным устойчивым давлением по мере необходимости. Затем промойте ткань теплой искусственной спинномозговой жидкостью.Для имплантации крышки стекла аккуратно нанесите трехмиллиметровое борозиликатное стекло крышки на открытый шнур. Используйте небольшой шпатель, чтобы применить 39 градусов по Цельсию нагревается 2%agarose к краю стекла и позволяют капиллярного действия, чтобы привлечь агарозу под поверхностью крышки стекла. Нанесите клей тканей на открытые костлявые суставные процессы нетронутого соседнего позвонка на грудном уровне 11 и 13 позвонков.Нанесите дополнительный клей ткани в кольцо вокруг участка ламинэктомии над соседним сухожилием и поперечным процессом. Далее, используйте новый шпатель для применения зубного цемента, смешанного с ускорителем на клей слой ткани и поместите заднюю пластину на хирургическое поле по центру окна крышки стекла. Применение нескольких тонких слоев зубного цемента приводит к более сильной адгезии задней пластины, но не забудьте разместить заднюю пластину быстро, прежде чем зубной цемент начинает высыхать.После разрешения зубного цемента для лечения в течение 10 минут, заполнить внутреннее основание и нижней части задней части места с дополнительным клеем. Применение зубного цемента в тонких слоях может помочь уменьшить риск распространения цемента на крышку стекла и агарозы, которые могут поставить под угрозу весь протокол. Когда зубной цемент высохнет, нанесите раздвоенный держатель задней пластины в соответствующее положение над окном и привинчивать заднюю пластину в держатель задней пластины.Затем нанесите физраствор на заднюю пластину, чтобы проверить на утечку. Затем животное и хирургическая платформа могут быть перенесены на оптический стол из двух фотонные микроскопы для визуализации через окно крышки стекла. В этом репрезентативном эксперименте, EGFP положительный claudin-5 был визуализирован в флуоресцентно помечены жесткие соединения по всему сосудистому сплетению.Четкое разграничение плотных структур соединения в проекции q указывает на то, что минимальное смещение изображения XY производится после успешной ламинэктомии, размещения окон и имплантации задней пластины. При попытке этой процедуры важно помнить, что эта микрохирургия является трудным и может занять некоторое время, чтобы освоить. Однако после освоения, эта операция может быть выполнена примерно в 30 минут.После этой процедуры, другие методы, как две фотонные микроскопии и in vivo изображений, могут быть выполнены, чтобы ответить на дополнительные вопросы о нервно-сосудистых ремоделирования и других процессов заболевания, связанных со спинным мозгом.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Разбор и культуры спаечный Нейроны из эмбриональных спинного мозга

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Спинной мозг электрофизиологии II: внеклеточной изготовление электродов Всасывающая

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

В естественных условиях Визуализация Мышь спинного мозга с использованием двух-фотонной микроскопии

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Стереотаксическая инъекции вирусных векторов для генной манипуляции Условные в спинной мозг мыши

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Перерезки спинного шнур в личиночной данио рерио

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Процедура имплантации спинного палату для продольных<em&gt; В Vivo</em&gt; Визуализация мозга мыши спинного

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Два-Фотон изображений клеточной динамики в спинном мозге мыши

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Визуализация Серотонинергической волокон в спинном мозге мышей Использование Четкость / КУБИЧЕСКИЙ Техника

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging нейронной активности в первичной соматосенсорной коры, с помощью Thy1-GCaMP6s трансгенных мышей

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Внутриархивная доставка нейронных стволовых клеток крыс и мышей мозга: Применение к церебральной ишемии

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...