Name: laminectomy and spinal cord window implantation in the mouse
Uploaded: 2019-10-23T12:30:00
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S.E. Lutz cuenta con el apoyo del Centro Nacional para el Avance de las Ciencias Traslacionales, los Institutos Nacionales de Salud, bajo los fondos de inicio de Grant KL2TR002002 y University of Illinois Chicago College of Medicine. Simon Alford es compatible con RO1 MH084874. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los NIH. Los autores agradecen a Dritan Agalliu en el Departamento de Neurología del Centro Médico de la Universidad de Columbia por los ratones Tg eGFP:Claudin-5, discusiones científicas e ideas sobre el desarrollo del protocolo quirúrgico y las aplicaciones de imagen. Los autores agradecen a Sunil P. Gandhi en el Departamento de Neurobiología y Comportamiento de la Universidad de California, Irvine por diseñar el primer prototipo del aparato estereotáctico y controlador de temperatura animal, la discusión del protocolo quirúrgico, y formación en microscopía de dos fotones. Los autores también agradecen a Steve Pickens (W. Nuhsbaum, Inc.) por su ayuda en la personalización del estereomicroscopio quirúrgico, y a Ron Lipinski (Whale Manufacturing) por el mecanizado de piezas estereotácticas.

Todos los experimentos siguen los protocolos del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Illinois, Chicago. Este es un procedimiento terminal.
1. Preparación de reactivos
<ol><li>Preparar el líquido cefalorraquídeo cerebral artificial (aCSF) para que contenga 125 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 10 mM de glucosa, 10 mM de HEPES, 2 mM MgCl2s6H2O, 2 mM de CaCl2x 2HendDH2O. Filtro estéril y congelar en alícuotas...

<ol>
	<li>Weinger, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+cellular+dynamics+in+the+mouse+spinal+cord.">Two-photon imaging of cellular dynamics in the mouse spinal cord.</a> Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).</li><li>Davalos, D., Akassoglou, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+the+mouse+spinal+cord+using+two-photon+microscopy.">In vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), (2012).</li><li>Farrar, M. J., Schaffer, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+procedure+for+implanting+a+spinal+chamber+for+longitudinal+in+vivo+imaging+of+the+mouse+spinal+cord.">A procedure for implanting a spinal chamber for longitudinal in vivo imaging of the mouse spinal cord.</a> Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).</li><li>Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implanting+glass+spinal+cord+windows+in+adult+mice+with+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">Implanting glass spinal cord windows in adult mice with experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Journal of Visualized Experiments. (82), e50826 (2013).</li><li>Figley, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+spinal+cord+window+chamber+model+for+in+vivo+longitudinal+multimodal+optical+and+acoustic+imaging+in+a+murine+model.">A spinal cord window chamber model for in vivo longitudinal multimodal optical and acoustic imaging in a murine model.</a> PLOS ONE. 8 (3), e58081 (2013).</li><li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+tissue+two-photon+microscopy.">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).</li><li>Liebner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+morphology+of+the+blood-brain+barrier+in+health+and+disease.">Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease.</a> Acta Neuropathologica. 135 (3), 311-336 (2018).</li><li>Shen, L., Weber, C. R., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tight+junction+protein+complex+undergoes+rapid+and+continuous+molecular+remodeling+at+steady+state.">The tight junction protein complex undergoes rapid and continuous molecular remodeling at steady state.</a> Journal of Cell Biology. 181 (4), 683-695 (2008).</li><li>Knowland, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stepwise+recruitment+of+transcellular+and+paracellular+pathways+underlies+blood-brain+barrier+breakdown+in+stroke.">Stepwise recruitment of transcellular and paracellular pathways underlies blood-brain barrier breakdown in stroke.</a> Neuron. 82, 1-15 (2014).</li><li>Lutz, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caveolin1+Is+Required+for+Th1+Cell+Infiltration,+but+Not+Tight+Junction+Remodeling,+at+the+Blood-Brain+Barrier+in+Autoimmune+Neuroinflammation.">Caveolin1 Is Required for Th1 Cell Infiltration, but Not Tight Junction Remodeling, at the Blood-Brain Barrier in Autoimmune Neuroinflammation.</a> Cell Reports. 21 (8), 2104-2117 (2017).</li><li>Harrison, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebral+landmarks+for+the+identification+of+spinal+cord+segments+in+the+mouse.">Vertebral landmarks for the identification of spinal cord segments in the mouse.</a> Neuroimage. 68, 22-29 (2013).</li><li>Cupido, A., Catalin, B., Steffens, H., Kirchhoff, F., Bakota, L., Brandt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laser Scanning Microscopy and Quantitative Image Analysis of Neuronal Tissue. , 37-50 (2014).</li><li>Sekiguchi, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+large-scale+cellular+activity+in+spinal+cord+of+freely+behaving+mice.">Imaging large-scale cellular activity in spinal cord of freely behaving mice.</a> Nature Communications. 7, 11450 (2016).</li><li>Nadrigny, F., Le Meur, K., Schomburg, E. D., Safavi-Abbasi, S., Dibaj, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser-scanning+microscopy+for+single+and+repetitive+imaging+of+dorsal+and+lateral+spinal+white+matter+in+vivo.">Two-photon laser-scanning microscopy for single and repetitive imaging of dorsal and lateral spinal white matter in vivo.</a> Physiological Research. 66 (3), 531-537 (2017).</li><li>Adelsperger, A. R., Bigiarelli-Nogas, K. J., Toore, I., Goergen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+Low-flow+Digital+Anesthesia+System+for+Mice+and+Rats.">Use of a Low-flow Digital Anesthesia System for Mice and Rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).</li><li>Damen, F. W., Adelsperger, A. R., Wilson, K. E., Goergen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Traditional+and+Integrated+Digital+Anesthetic+Vaporizers.">Comparison of Traditional and Integrated Digital Anesthetic Vaporizers.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (6), 756-762 (2015).</li><li>Miyamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+COX-2+inhibitor+celecoxib+prevents+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+through+COX-2-independent+pathway.">Selective COX-2 inhibitor celecoxib prevents experimental autoimmune encephalomyelitis through COX-2-independent pathway.</a> Brain. 129 (Pt 8), 1984-1992 (2006).</li><li>Muthian, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COX-2+inhibitors+modulate+IL-12+signaling+through+JAK-STAT+pathway+leading+to+Th1+response+in+experimental+allergic+encephalomyelitis.">COX-2 inhibitors modulate IL-12 signaling through JAK-STAT pathway leading to Th1 response in experimental allergic encephalomyelitis.</a> Journal of Clinical Immunology. 26 (1), 73-85 (2006).</li></ol>

El método descrito aquí permite imágenes estables de la médula espinal en ratones a través de una ventana de vidrio. Este método se ha aplicado para evaluar la remodelación de BBB en ratones transgénicos eGFP:Claudin5+/- que expresan una proteína fluorescente de unión estrecha BBB, pero podría aplicarse igualmente bien para estudios de cualquier proteína fluorescente o células en la médula espinal.
Se han desarrollado múltiples métodos para la laminectomía y estabilización de...

Los modelos animales transgénicos que expresan proteínas fluorescentes, cuando se combinan con la microscopía intravital, proporcionan una potente plataforma para abordar la biología y la fisiopatología. Para aplicar estas técnicas a la médula espinal, se requieren protocolos especializados para preparar la médula espinal para la toma de imágenes. Una de esas estrategias es llevar a cabo una laminectomía e implantación de la ventana de la médula espinal. Las características clave de un protocolo de laminectomía ideal para la microscopía incluyen la preservación de la estructura y función del tejido nativo, la estabilidad del campo de la imagen, el tiempo de procesamiento rápido y la reproducibilidad de los resultados. Un desafío particular es estabilizar el campo de imagen contra el movimiento inducido por la respiración y los latidos del corazón. Múltiples estrategias ex vivo e in vivo han sido reportadas para alcanzar estos objetivos1,2,3,4,5. La mayoría de los métodos in vivo implican sujetar los lados de la columna vertebral2,4 y a menudo es seguido por la implantación de un aparato metálico rígido3,4 para la estabilidad durante la cirugía y aplicaciones de imágenes posteriores. Sujetar la columna vertebral puede comprometer potencialmente el flujo sanguíneo e inducir la remodelación de proteínas de barrera hematoencefálica (BBB).
El propósito de este método es hacer que la médula espinal intacta esté disponible para imágenes ópticas en el ratón vivo, minimizando al mismo tiempo la invasividad del protocolo y mejorando los resultados. Describimos una sola laminectomía y un procedimiento de implantación de vidrio de cubierta combinado con una placa posterior impresa en 3D de plástico ovalada mínimamente invasiva que todavía logra una estabilidad mecánica robusta. La placa posterior se adhiere directamente a las espinas vertebrales anteriores y posteriores con cemento dental. La placa posterior está equipada con brazos de extensión lateral con orificios de tornillo que se fijan rígidamente a la etapa del microscopio a través de un brazo metálico. Esto ancla eficazmente la vértebra anterior y posterior intacta a la etapa del microscopio, proporcionando resistencia mecánica al artefacto de movimiento que de otro modo sería introducido por la respiración y los latidos del corazón. El método ha sido optimizado para la laminectomía de una sola vértebra a nivel torácico 12, omitiendo las abrazaderas utilizadas en estrategias alternativas de estabilidad durante la imagen in vivo. El procedimiento es rápido, tardando aproximadamente 30 minutos por ratón.
Este protocolo se puede utilizar para estudiar los mecanismos de la enfermedad de la BBB. El BBB es un sistema microvascular dinámico compuesto por células endoteliales, músculo liso vascular, pericitos y procesos de pie astrocito que proporcionan un ambiente altamente selectivo para el sistema nervioso central (SNC). Los datos representativos describen la aplicación de este protocolo en ratones transgénicos diseñados para expresar proteína fluorescente verde mejorada (eGFP):Claudin-5, una proteína de unión estrecha BBB. Los archivos de impresión de placa posterior proporcionados también se pueden personalizar para aplicaciones alternativas.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D printer</td>
			<td>Raise3D</td>
			<td>Pro2</td>
			<td>For printing backplates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLA 3D printing filament</td>
			<td>Inland</td>
			<td>PLA+-175-B</td>
			<td>Black plastic 3D printing material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D CAD software</td>
			<td>Dassault Systemes</td>
			<td>Solidworks software</td>
			<td>used to design 3D shapes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printer software</td>
			<td>Raise3D</td>
			<td>Ideamaker software</td>
			<td>software used to interface with the 3D printer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printed oval backplate</td>
			<td>custom</td>
			<td></td>
			<td>Stabilizing imaging field</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M205 C</td>
			<td>Equipped with Leica FusionOptics, Planapo 0.63x M-series objective, and gliding stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MC170</td>
			<td>HD color camera for visualizing surgical field</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gliding stage</td>
			<td>Leica</td>
			<td>10446301</td>
			<td>The gliding stage is constructed of two metal plates. The base plate is fixed. The upper plate slides on greased interface to allow rotational and linear movement.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical station and stabilization fork</td>
			<td>Whale Manufactoring</td>
			<td>custom</td>
			<td>Laminectomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SomnoSuite low-flow isoflurane delivery unit</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>SS-01</td>
			<td>Surgical anesthesia administration with integrated digitial vaporizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel 1.5 inch mounting post</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>P50/M</td>
			<td>For mounting surgical station onto optical table for two-photon imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counterbored Clamping Fork for 1.5&#34; mounting Post</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>PF175</td>
			<td>For stabilizing surgical station mount onto optical table for two-photon imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ideal bone microdrill</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>72-6065</td>
			<td>Thinning bone for laminectomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-462-10</td>
			<td>Warming saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cautery gun</td>
			<td>FST</td>
			<td>18010-00</td>
			<td>Cauterizing minor bleeds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>BF11222</td>
			<td>1.9&#8221; x 4.5&#8221; silicone heater with 20&#8221; Teflon leads, 10W, 5V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K type thermocoupled rectal probe</td>
			<td>Physitemp</td>
			<td>RET3</td>
			<td>Measuring mouse body temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petroleum jelly</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>8009-03-8</td>
			<td>Lubricating rectal probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feedback-regulated thermal controller</td>
			<td>custom</td>
			<td>NA</td>
			<td>Commercially available alternatives include the Physitemp TCAT series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVA Surgical eye spears</td>
			<td>Beaver-visitec international</td>
			<td>40400-8</td>
			<td>Absorbing blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric trimmer</td>
			<td>Wahl</td>
			<td>41590-0438</td>
			<td>Trimming mouse fur</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blade, #11</td>
			<td>FST</td>
			<td>14002-14</td>
			<td>Surgical tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, #5</td>
			<td>FST</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>Surgical tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, #4</td>
			<td>FST</td>
			<td>14002-14</td>
			<td>Surgical tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titatnium toothed forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>555047FT</td>
			<td>Surgical tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium Iris scissors</td>
			<td>WPI</td>
			<td>555562S</td>
			<td>Surgical tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond tissue adhesive</td>
			<td>3M</td>
			<td>084-1469SB</td>
			<td>Preparing tissue surface for dental acrylic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic mixing tray</td>
			<td>Jack Richeson</td>
			<td>420716</td>
			<td>Mixing dental acrylic agent with accelerant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orthojet dental acrylic</td>
			<td>Lang Dental</td>
			<td>1520BLK, 1503BLK</td>
			<td>Permanently bonding backplate to tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small round cover glass, #1 thickness, 3 mm</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>64-0720</td>
			<td>optical window</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td>For aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td>For aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td>For aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td>For aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#183;6H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td>For aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10035-04-8</td>
			<td>For aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen</td>
			<td>Rimadyl</td>
			<td>QM01AE91</td>
			<td>Analgesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriostatic water</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>2587428</td>
			<td>Diluent for carprofen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>11695-6776-2</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactated ringer solution</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>0338-0117-04</td>
			<td>Hydration for mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose High EEO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9793</td>
			<td>gel point 34-37 degrees C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opthalmic lubricating ointment</td>
			<td>Akwa Tears</td>
			<td>68788-0697</td>
			<td>Prevent corneal drying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOM Two-Photon Microscope</td>
			<td>Sutter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laminectomy and spinal cord window implantation in the mouse

Este protocolo describe un método para la laminectomía de la médula espinal y la implantación de ventanas de vidrio para la toma de imágenes in vivo de la médula espinal del ratón. Un vaporizador digital integrado se utiliza para lograr un plano estable de anestesia a una velocidad de bajo flujo de isoflurano. Se retira una sola columna vertebral, y se superpone un vidrio de cubierta disponible comercialmente en un lecho de agarosa delgada. A continuación, se fija una placa posterior de plástico impresa en 3D a las espinas vertebrales adyacentes utilizando adhesivo tisular y cemento dental. Se utiliza una plataforma de estabilización para reducir el artefacto de movimiento de la respiración y los latidos del corazón. Este método rápido y libre de abrazaderas es adecuado para la microscopía aguda de fluorescencia multifotón. Se incluyen datos representativos para la aplicación de esta técnica a la microscopía de dos fotones de la vasculatura de la médula espinal en ratones transgénicos que expresan eGFP:Claudin-5 — una proteína de unión apretada.

Las ventanas de vidrio implantadas y la microscopía intravital de dos fotones proporcionan una herramienta útil para evaluar los cambios dinámicos en las proteínas del SNC. La integridad funcional del BBB está influenciada por la expresión, la localización subcelular y las tasas de rotación de proteínas de uniónestrecha7. Estudios anteriores han demostrado que las proteínas de unión estrecha sufren una remodelación rápida y dinámica en estado estacio...

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Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

Este protocolo describe la implantación de una ventana de vidrio en la médula espinal de un ratón para facilitar la visualización mediante microscopía intravital.

Laminectomía e implantación de la ventana de la médula espinal en el ratón

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

Este método permite el examen de la dinámica de proteínas in vivo dentro del sistema nervioso central intacto para abordar preguntas en neurociencia e inmunología. Las principales ventajas de este procedimiento son una excelente estabilidad de movimiento para la adquisición de imágenes, un breve tiempo quirúrgico, una exposición reducida del operador a la anestesia gaseosa y placas traseras personalizables de bajo costo. La demostración visual de este método es crítica, ya que es difícil extraer el hueso sin dañar el tejido del sistema nervioso estrechamente subyacente durante las etapas de laminectomía del procedimiento.Antes de comenzar el procedimiento, utilice el software de diseño asistido por ordenador 3D para crear un modelo según las dimensiones indicadas. Así que tenemos un objeto, que es el objeto tridimensional, que es con lo que podemos empezar. Lo que puedo hacer entonces es poner ajustes en eso para la versión de impresión.Así que si abro Editar esto, vaya a Avanzado, abra una ventana que me permita ver todos estos ajustes. Ajuste la temperatura de la boquilla a 205 grados Celsius, la temperatura de la cama a 45 grados Celsius y la velocidad de impresión a 45 milímetros por segundo en una impresora 3D. Utilice una boquilla caliente de 0,4 milímetros y una capa de 0,2 milímetros de altura para imprimir las placas posteriores.A continuación, evalúe visualmente las placas posteriores impresas para comprobar su integridad estructural. Las fallas estructurales brutas indican defectos de impresión. Cuando las placas traseras estén listas, coloque la cabeza de un ratón anestesiado de ocho a 12 semanas de edad sobre una almohadilla de calor entre las barras de los oídos de un retén quirúrgico y aplique un ung ón en los ojos del animal.Después de confirmar la falta de respuesta al pellizco del dedo del pie, utilice una cuchilla número 11 para hacer una incisión de línea media rostral a caudal de 1,5 centímetros sobre la región lumbar superior torácica inferior y separe la piel del peritoneo. Use fórceps para pelar cualquier tejido conectivo transparente restante debajo de la piel para exponer la musculatura superficial. Desplazar los músculos con una lanza quirúrgica de espuma junto con el músculo más profundo restante de la vértebra objetivo.Para crear un asiento para la placa posterior, borre el músculo del aspecto posterior del torácico 11 y el aspecto anterior del torácico 13. Usar fórceps para eliminar el músculo restante de los tendones según sea necesario. Cuando se haya eliminado todo el músculo, corte cuidadosamente los tendones con fórceps hasta que se logre suficiente espacio para visualizar y manipular la médula espinal.Confirme que la duramadre del espacio intervertebral, el hueso laminar semitransparente, el vaso sanguíneo superficial central debajo del hueso y la arteria radiante anterior son claramente visibles. Humedezca la región con líquido cefalorraquídeo artificial cálido y utilice un micro-perforador para adelgazar el hueso laminar usando trazos rectos paralelos al eje largo de la médula espinal. Agarrando suavemente el proceso espinoso superficial con fórceps, levante la vértebra.El hueso debe levantarse fácilmente. Utilice fórceps número cuatro para eliminar cualquier fragmento óseo, controlando cualquier sangrado con una lanza quirúrgica y una presión constante suave según sea necesario. A continuación, enjuague el tejido con líquido cefalorraquídeo artificial caliente.Para la implantación de vidrio de cubierta, aplique suavemente un vidrio de cubierta de borosilicato de tres milímetros al cordón expuesto. Utilice una pequeña espátula para aplicar 39 grados Celsius calentado 2%agarose al borde del vidrio y permitir la acción capilar para dibujar la agarosa debajo de la superficie de vidrio de la cubierta. Aplique adhesivo tisular en los procesos articulares óseos expuestos de la vértebra adyacente intacta en las espinas vertebrales de nivel torácico 11 y 13.Aplique adhesivo de tejido adicional en un anillo alrededor del sitio de laminectomía sobre el tendón adyacente y el proceso transversal. A continuación, utilice una nueva espátula para aplicar cemento dental mezclado con acelerador en la capa adhesiva de tejido y coloque una placa posterior en el campo quirúrgico centrado sobre la ventana de vidrio de la cubierta. La aplicación de múltiples capas delgadas de cemento dental da como resultado una adhesión más fuerte de la placa posterior, pero asegúrese de colocar la placa posterior rápidamente antes de que el cemento dental comience a secarse.Después de permitir que el cemento dental se cure durante 10 minutos, rellene la base interior y la parte inferior del lugar posterior con adhesivo adicional. La aplicación del cemento dental en capas delgadas puede ayudar a reducir el riesgo de que el cemento se propague al vidrio de la cubierta y a la agarosa, lo que puede comprometer todo el protocolo. Cuando el cemento dental se haya secado, aplique un soporte de placa posterior bifurcado a la posición adecuada sobre la ventana y atornille la placa posterior en el soporte de la placa posterior.A continuación, aplique solución salina en la placa posterior para comprobar si hay fugas. El animal y la plataforma quirúrgica se pueden transferir a la mesa óptica de un microscopio de dos fotones para obtener imágenes a través de la ventana de cristal de la cubierta. En este experimento representativo, la claudina-5 positiva EGFP se visualizó dentro de las uniones estrechas con etiqueta fluorescente a lo largo de un plexo vascular.La delineación clara de las estructuras de unión estrecha en la proyección Z indica que se produce un desplazamiento mínimo de la imagen XY después de una laminectomía exitosa, la colocación de la ventana y la implantación de la placa posterior. Al intentar este procedimiento es importante recordar que esta microcirugía es difícil y puede tomar tiempo para dominar. Sin embargo, una vez dominada, esta cirugía se puede realizar en aproximadamente 30 minutos.Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la microscopía de dos fotones y las imágenes in vivo, para responder preguntas adicionales sobre la remodelación neurovascular y otros procesos de la enfermedad que involucran la médula espinal.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

La disección y la Cultura de las neuronas comisurales de médula espinal embrionaria

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Investigación

Neurociencias

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Médula Espinal Electrofisiología II: Fabricación de electrodos de aspiración extracelular

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

Imágenes in vivo de la médula espinal de ratón Utilizando microscopía de dos fotones

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Inyección estereotáxica de un vector viral para la manipulación genética condicional en la médula espinal de ratón

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

La transección de la médula espinal en el pez cebra larval

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Un procedimiento para el implante Cámara Espinal para Longitudinal<em&gt; En Vivo</em&gt; Imágenes de la médula espinal de ratón

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

De dos fotones de imágenes de Dinámica Celular en la médula espinal de ratón

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Las fibras serotoninérgicos proyección de imagen en la médula espinal de ratón El uso de la claridad / Técnica CÚBICO

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imágenes de la actividad neuronal en la corteza somatosensorial primaria usando Thy1-ratones transgénicos GCaMP6s

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Entrega intra-arterial de células madre neuronales a la rata y el cerebro del ratón: aplicación a la isquemia cerebral

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...