Name: laminectomy and spinal cord window implantation in the mouse
Uploaded: 2019-10-23T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse at JoVE.com

S. Lutz stöds av National Center for framryckande translationella vetenskaper, National Institutes of Health, under Grant KL2TR002002 och University of Illinois Chicago College of Medicine start fonder. Simon Alford stöds av RO1 MH084874. Innehållet är uteslutande författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis den officiella synen på NIH. Författarna tackar Dritan Agalliu på Institutionen för neurologi vid Columbia University Medical Center för TG eGFP: Claudin-5 möss, vetenskapliga diskussioner och insikter i utvecklingen av kirurgiska protokoll och Imaging applikationer. Författarna tackar Sunil P. Gandhi i Institutionen för neurobiologi och beteende vid University of California, Irvine för att utforma den första prototypen av stereotaktisk apparat och djur temperatur Controller, diskussion om det kirurgiska protokollet, och utbildning i två-Photon mikroskopi. Författarna tackar också Steve Pickens (W. Nuhsbaum, Inc.) för hjälp med att anpassa den kirurgiska stereomicroscope, och Ron Lipinski (val tillverkning) för bearbetning stereotaktiska delar.

Alla experiment följer University of Illinois, Chicago institutionella djuromsorg och använda kommitté protokoll. Detta är en terminalprocedur.
1. beredning av reagens
<ol><li>Förbered artificiell cerebral spinal Fluid (aCSF) för att innehålla 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM glukos, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl2· 6H2o, 2 mm CaCl2· 2H2o i DDH2o. sterilt filter och frysa i individuella-use alikvoter. Värm aCSF i ett vattenbad till 39 ° c...

<ol>
	<li>Weinger, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+cellular+dynamics+in+the+mouse+spinal+cord.">Two-photon imaging of cellular dynamics in the mouse spinal cord.</a> Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).</li><li>Davalos, D., Akassoglou, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+the+mouse+spinal+cord+using+two-photon+microscopy.">In vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), (2012).</li><li>Farrar, M. J., Schaffer, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+procedure+for+implanting+a+spinal+chamber+for+longitudinal+in+vivo+imaging+of+the+mouse+spinal+cord.">A procedure for implanting a spinal chamber for longitudinal in vivo imaging of the mouse spinal cord.</a> Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).</li><li>Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implanting+glass+spinal+cord+windows+in+adult+mice+with+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">Implanting glass spinal cord windows in adult mice with experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Journal of Visualized Experiments. (82), e50826 (2013).</li><li>Figley, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+spinal+cord+window+chamber+model+for+in+vivo+longitudinal+multimodal+optical+and+acoustic+imaging+in+a+murine+model.">A spinal cord window chamber model for in vivo longitudinal multimodal optical and acoustic imaging in a murine model.</a> PLOS ONE. 8 (3), e58081 (2013).</li><li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+tissue+two-photon+microscopy.">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).</li><li>Liebner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+morphology+of+the+blood-brain+barrier+in+health+and+disease.">Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease.</a> Acta Neuropathologica. 135 (3), 311-336 (2018).</li><li>Shen, L., Weber, C. R., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tight+junction+protein+complex+undergoes+rapid+and+continuous+molecular+remodeling+at+steady+state.">The tight junction protein complex undergoes rapid and continuous molecular remodeling at steady state.</a> Journal of Cell Biology. 181 (4), 683-695 (2008).</li><li>Knowland, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stepwise+recruitment+of+transcellular+and+paracellular+pathways+underlies+blood-brain+barrier+breakdown+in+stroke.">Stepwise recruitment of transcellular and paracellular pathways underlies blood-brain barrier breakdown in stroke.</a> Neuron. 82, 1-15 (2014).</li><li>Lutz, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caveolin1+Is+Required+for+Th1+Cell+Infiltration,+but+Not+Tight+Junction+Remodeling,+at+the+Blood-Brain+Barrier+in+Autoimmune+Neuroinflammation.">Caveolin1 Is Required for Th1 Cell Infiltration, but Not Tight Junction Remodeling, at the Blood-Brain Barrier in Autoimmune Neuroinflammation.</a> Cell Reports. 21 (8), 2104-2117 (2017).</li><li>Harrison, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebral+landmarks+for+the+identification+of+spinal+cord+segments+in+the+mouse.">Vertebral landmarks for the identification of spinal cord segments in the mouse.</a> Neuroimage. 68, 22-29 (2013).</li><li>Cupido, A., Catalin, B., Steffens, H., Kirchhoff, F., Bakota, L., Brandt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laser Scanning Microscopy and Quantitative Image Analysis of Neuronal Tissue. , 37-50 (2014).</li><li>Sekiguchi, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+large-scale+cellular+activity+in+spinal+cord+of+freely+behaving+mice.">Imaging large-scale cellular activity in spinal cord of freely behaving mice.</a> Nature Communications. 7, 11450 (2016).</li><li>Nadrigny, F., Le Meur, K., Schomburg, E. D., Safavi-Abbasi, S., Dibaj, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser-scanning+microscopy+for+single+and+repetitive+imaging+of+dorsal+and+lateral+spinal+white+matter+in+vivo.">Two-photon laser-scanning microscopy for single and repetitive imaging of dorsal and lateral spinal white matter in vivo.</a> Physiological Research. 66 (3), 531-537 (2017).</li><li>Adelsperger, A. R., Bigiarelli-Nogas, K. J., Toore, I., Goergen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+Low-flow+Digital+Anesthesia+System+for+Mice+and+Rats.">Use of a Low-flow Digital Anesthesia System for Mice and Rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).</li><li>Damen, F. W., Adelsperger, A. R., Wilson, K. E., Goergen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Traditional+and+Integrated+Digital+Anesthetic+Vaporizers.">Comparison of Traditional and Integrated Digital Anesthetic Vaporizers.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (6), 756-762 (2015).</li><li>Miyamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+COX-2+inhibitor+celecoxib+prevents+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+through+COX-2-independent+pathway.">Selective COX-2 inhibitor celecoxib prevents experimental autoimmune encephalomyelitis through COX-2-independent pathway.</a> Brain. 129 (Pt 8), 1984-1992 (2006).</li><li>Muthian, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COX-2+inhibitors+modulate+IL-12+signaling+through+JAK-STAT+pathway+leading+to+Th1+response+in+experimental+allergic+encephalomyelitis.">COX-2 inhibitors modulate IL-12 signaling through JAK-STAT pathway leading to Th1 response in experimental allergic encephalomyelitis.</a> Journal of Clinical Immunology. 26 (1), 73-85 (2006).</li></ol>

Den metod som beskrivs här möjliggör stabil avbildning av ryggmärgen i möss genom ett glas fönster. Denna metod har tillämpats för att bedöma BBB remodeling i transgena eGFP: Claudin5 +/-möss som uttrycker en fluorescerande BBB tight Junction protein, men det kan tillämpas lika bra för studier av alla fluorescerande proteiner eller celler i ryggmärgen.
Flera metoder för laminektomi och ryggmärgs stabilisering har utvecklats. Alla protokoll adress stabiliserande ryggmärgen under...

Transgena djurmodeller som uttrycker fluorescerande proteiner, i kombination med intravital mikroskopi, ger en kraftfull plattform för att hantera biologi och patofysiologi. För att tillämpa dessa tekniker till ryggmärgen, är specialiserade protokoll som krävs för att förbereda ryggmärgen för avbildning. En sådan strategi är att genomföra en laminektomi och ryggmärg fönster implantation. De viktigaste inslagen i en idealisk laminektomi protokoll för mikroskopi omfatta bevarande av inhemska vävnad struktur och funktion, stabilitet i imaging fältet, snabb handläggningstid, och reproducerbarhet av resultat. En särskild utmaning är att stabilisera bildområdet mot den rörelse som induceras av andning och hjärtslag. Flera ex vivo - och in vivo -strategier har rapporterats för att uppnå dessa mål1,2,3,4,5. De flesta in vivo metoder innebär fastspänning sidorna av ryggraden2,4 och följs ofta genom att implantera en styv metall apparat3,4 för stabilitet under kirurgi och nedströmsbildprogram. Fastspänning ryggraden kan potentiellt äventyra blodflödet och inducera blod-hjärnbarriären (BBB) protein remodeling.
Syftet med denna metod är att göra den intakt ryggmärgen tillgänglig för optisk avbildning i den levande musen samtidigt minimera invasivitet av protokollet och förbättra resultaten. Vi beskriver en enda laminektomi och täck-glas implantation förfarande i kombination med en minimalt invasiv oval plast 3D-tryckt bakplåt som fortfarande uppnår robust mekanisk stabilitet. Bakplattan är direkt anslutit sig till främre och bakre vertebrala Taggar med tandcement. Bakplattan är utrustad med laterala förlängningsarmar med skruv hål som stelt fäster mikroskopet scenen via en metall arm. Detta förankrar effektivt intakt främre och bakre Kota till mikroskopet skede, vilket ger mekanisk motståndskraft mot rörelse artefakten som annars skulle införas genom andning och hjärtslag. Metoden har optimerats för laminektomi av en enda kotan på bröst nivå 12, utelämna klämmorna utnyttjas i alternativa strategier för stabilitet under in vivo Imaging. Förfarandet är snabb, tar cirka 30 min per mus.
Detta protokoll kan användas för att studera sjukdomsmekanismer av BBB. BBB är en dynamisk mikrovaskulär system består av endotelceller, vaskulär glatt mus kula, pericyter, och astrocyt fot processer som ger en mycket selektiv miljö för centralanervsystemet (CNS). Representativa data skildrar tillämpningen av detta protokoll i transgena möss konstruerade för att uttrycka förstärkt grönt fluorescerande protein (eGFP): Claudin-5, ett BBB tight Junction protein. De medföljande bakplattan-filerna kan också anpassas för alternativa tillämpningar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D printer</td>
			<td>Raise3D</td>
			<td>Pro2</td>
			<td>For printing backplates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLA 3D printing filament</td>
			<td>Inland</td>
			<td>PLA+-175-B</td>
			<td>Black plastic 3D printing material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D CAD software</td>
			<td>Dassault Systemes</td>
			<td>Solidworks software</td>
			<td>used to design 3D shapes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printer software</td>
			<td>Raise3D</td>
			<td>Ideamaker software</td>
			<td>software used to interface with the 3D printer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printed oval backplate</td>
			<td>custom</td>
			<td></td>
			<td>Stabilizing imaging field</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M205 C</td>
			<td>Equipped with Leica FusionOptics, Planapo 0.63x M-series objective, and gliding stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MC170</td>
			<td>HD color camera for visualizing surgical field</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gliding stage</td>
			<td>Leica</td>
			<td>10446301</td>
			<td>The gliding stage is constructed of two metal plates. The base plate is fixed. The upper plate slides on greased interface to allow rotational and linear movement.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical station and stabilization fork</td>
			<td>Whale Manufactoring</td>
			<td>custom</td>
			<td>Laminectomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SomnoSuite low-flow isoflurane delivery unit</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>SS-01</td>
			<td>Surgical anesthesia administration with integrated digitial vaporizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel 1.5 inch mounting post</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>P50/M</td>
			<td>For mounting surgical station onto optical table for two-photon imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counterbored Clamping Fork for 1.5&#34; mounting Post</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>PF175</td>
			<td>For stabilizing surgical station mount onto optical table for two-photon imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ideal bone microdrill</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>72-6065</td>
			<td>Thinning bone for laminectomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-462-10</td>
			<td>Warming saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cautery gun</td>
			<td>FST</td>
			<td>18010-00</td>
			<td>Cauterizing minor bleeds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>BF11222</td>
			<td>1.9&#8221; x 4.5&#8221; silicone heater with 20&#8221; Teflon leads, 10W, 5V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K type thermocoupled rectal probe</td>
			<td>Physitemp</td>
			<td>RET3</td>
			<td>Measuring mouse body temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petroleum jelly</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>8009-03-8</td>
			<td>Lubricating rectal probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feedback-regulated thermal controller</td>
			<td>custom</td>
			<td>NA</td>
			<td>Commercially available alternatives include the Physitemp TCAT series</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVA Surgical eye spears</td>
			<td>Beaver-visitec international</td>
			<td>40400-8</td>
			<td>Absorbing blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric trimmer</td>
			<td>Wahl</td>
			<td>41590-0438</td>
			<td>Trimming mouse fur</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blade, #11</td>
			<td>FST</td>
			<td>14002-14</td>
			<td>Surgical tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, #5</td>
			<td>FST</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>Surgical tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, #4</td>
			<td>FST</td>
			<td>14002-14</td>
			<td>Surgical tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titatnium toothed forceps</td>
			<td>WPI</td>
			<td>555047FT</td>
			<td>Surgical tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium Iris scissors</td>
			<td>WPI</td>
			<td>555562S</td>
			<td>Surgical tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond tissue adhesive</td>
			<td>3M</td>
			<td>084-1469SB</td>
			<td>Preparing tissue surface for dental acrylic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic mixing tray</td>
			<td>Jack Richeson</td>
			<td>420716</td>
			<td>Mixing dental acrylic agent with accelerant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orthojet dental acrylic</td>
			<td>Lang Dental</td>
			<td>1520BLK, 1503BLK</td>
			<td>Permanently bonding backplate to tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small round cover glass, #1 thickness, 3 mm</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>64-0720</td>
			<td>optical window</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td>For aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td>For aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td>For aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td>For aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#183;6H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td>For aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10035-04-8</td>
			<td>For aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen</td>
			<td>Rimadyl</td>
			<td>QM01AE91</td>
			<td>Analgesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriostatic water</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>2587428</td>
			<td>Diluent for carprofen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>11695-6776-2</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactated ringer solution</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>0338-0117-04</td>
			<td>Hydration for mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose High EEO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9793</td>
			<td>gel point 34-37 degrees C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opthalmic lubricating ointment</td>
			<td>Akwa Tears</td>
			<td>68788-0697</td>
			<td>Prevent corneal drying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOM Two-Photon Microscope</td>
			<td>Sutter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laminectomy and spinal cord window implantation in the mouse

Detta protokoll beskriver en metod för ryggmärg laminektomi och glas fönster implantation för in vivo avbildning av mus ryggmärgen. En integrerad digital spridare utnyttjas för att uppnå ett stabilt plan av anestesi vid en låg flödeshastighet av isofluran. En enda kotryggrad avlägsnas, och en kommersiellt tillgänglig Cover-glas är överlagras på en tunn aguppstod säng. En 3D-tryckt plast bakplåt fästs sedan på intilliggande vertebrala Taggar med hjälp av vävnadslim och tandcement. En stabiliserings plattform används för att minska rörelse artefakten från andning och hjärtslag. Denna snabba och kläm fria metod lämpar sig väl för akut mikroskopi med multi-Photon fluorescens. Representativa data ingår för en tillämpning av denna teknik för att två-Photon mikroskopi av ryggmärgen vaskulatur i transgena möss uttrycker eGFP: Claudin-5-ett tätt knutpunkt protein.

Implanterade glas fönster och intravital två-Photon mikroskopi ger ett användbart verktyg för att bedöma dynamiska förändringar i CNS-proteiner. Den funktionella integriteten av BBB påverkas av uttrycket, subcellulär lokalisering, och omsättningshastighet av snäva knutpunkt proteiner7. Tidigare studier har visat att snäva Knut punkts proteiner genomgår snabb och dynamisk ombyggnad vid steady state8. Den för närvarande beskrivn...

Watch this Scientific Journal Video about Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse at JoVE.com

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

Detta protokoll beskriver implantation av ett glas fönster på ryggmärgen av en mus för att underlätta visualisering av intravital mikroskopi.

Implantation av laminektomi och Ryggmärgs fönster i musen

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

Denna metod möjliggör undersökning av proteindynamik in vivo inom det intakta centrala nervsystemet för att ta itu med frågor inom neurovetenskap och immunologi. De främsta fördelarna med detta förfarande är en utmärkt rörelse stabilitet för bild förvärv, kort kirurgisk tid, minskad operatör exponering för gasformiga anestesi, och billiga anpassningsbara backplates. Visuell demonstration av denna metod är kritisk eftersom det är svårt att ta bort benet utan att skada den nära underliggande nervsystemet vävnad under laminectomy stegen i förfarandet.Innan du börjar proceduren, använd 3D-datorstödd designprogramvara för att skapa en modell till de angivna dimensionerna. Så vi har ett föremål, som är det tredimensionella objektet, att det är vad vi kan börja med. Vad jag kan sedan göra är att vi kan sätta inställningar på det för utskriftsversionen.Så om jag öppnar Redigera detta, gå in i Avancerat, öppna ett fönster som gör det möjligt för mig att titta på alla dessa inställningar. Ställ in munstyckestemperaturen till 205 grader Celsius, sängtemperaturen till 45 grader Celsius och utskriftshastigheten till 45 millimeter per sekund på en 3D-skrivare. Använd en 0,4 millimeter varmt ent munstycke och en 0,2 millimeter lager höjd för att skriva ut ryggplattorna.Sedan bedöma de tryckta tillbaka plattorna visuellt för deras strukturella integritet. Strukturella bruttofel indikerar tryckfel. När ryggplattorna är klara, placera huvudet på en åtta till 12 veckor gammal sövd mus på en värmedyna mellan öronstängerna på en kirurgisk hindra och applicera salva på djurets ögon.Efter att ha bekräftat en brist på svar på tå nypa, använd ett antal 11 blad för att göra en 1,5 centimeter rostral till caudal mittlinjen snitt över den nedre bröst övre ländryggen regionen och separera huden från bukhinnan. Använd forceps för att skala tillbaka eventuell kvarvarande transparent bindväv under huden för att exponera den ytliga muskulaturen. Förskjut musklerna med ett skum kirurgiskt spjut tillsammans med återstående djupare muskulös av målet kotan.För att skapa en sits för ryggplattan, rensa muskeln från den bakre aspekten av bröst 11 och den främre aspekten av bröst 13. Använda forceps för att ta bort de återstående muskeln från senorna som behövs. När alla muskler har tagits bort, försiktigt skära senor med tärna tills tillräckligt utrymme för visualisering och manipulera ryggmärgen uppnås.Bekräfta att dura mater av intervertebral utrymmet, den halvtransparenta laminärbenet, den centrala ytliga blodkärl under benet, och den främre utstrålande artären är tydligt synliga. Blöt regionen med varm konstgjord cerebral spinal vätska och använda en mikro-borr för att tunna laminärbenet med hjälp av raka slag parallellt med den långa axeln av ryggmärgen. Försiktigt gripa tag i ytliga spinous processen med täppor, lyft kotan.Benet ska lyfta bort lätt. Använd nummer fyra tövingar för att rensa bort eventuella benskärvor, kontrollera eventuella blödningar med ett kirurgiskt spjut och försiktigt stadigt tryck vid behov. Skölj sedan vävnaden med varm artificiell cerebral spinalvätska.För täckglas implantation, försiktigt tillämpa en tre millimeter borosilikat täckglas till den exponerade sladden. Använd en liten spatel för att applicera 39 grader Celsius värms 2%agaros till kanten av glaset och tillåta kapillär åtgärd för att dra agarose under täckglaset yta. Applicera vävnadslim på de exponerade beniga artikulära processerna av den intakta intilliggande ryggkotan vid bröstnivån 11 och 13 ryggradskotor.Applicera ytterligare vävnadslim i en ring runt laminektomistället över den intilliggande senan och tvärgående processen. Därefter använder en ny spatel för att tillämpa tandcement blandat med accelerant på vävnaden självhäftande lagret och placera en ryggplatta på operationsfältet centrerad över locket glasfönstret. Tillämpa flera tunna lager av tandcement resulterar i en starkare ryggplatta vidhäftning, men se till att placera tillbaka plattan snabbt innan dentala cement börjar torka.Efter att den tandcement att bota i 10 minuter, fyll i den inre basen och undersidan av ryggen plats med ytterligare lim. Att applicera dentalacementet i tunna lager kan bidra till att minska risken för cementspridning till täckglaset och agaros, vilket kan äventyra hela protokollet. När tandcement har torkat, applicera en kluven ryggplåtshållare till lämpligt läge över fönstret och skruva fast ryggplattan i ryggplåtshållaren.Applicera sedan koksaltlösning på ryggplattan för att testa för läckage. Djuret och den kirurgiska plattformen kan sedan överföras till den optiska tabellen av en två fotonmikroskop för avbildning genom locket glasfönstret. I detta representativa experiment, var EGFP positiva claudin-5 visualiseras inom fluorescently märkt snäva knutpunkter i hela en Vaskulär plexus.Den tydliga avstning av de snäva knutpunkter strukturerna i Z-projektionen anger att minimal XY bild förskjutning produceras efter en lyckad laminectomy, fönster placering och tillbaka plattan implantation. Medan du försöker detta förfarande är det viktigt att komma ihåg att denna mikrokirurgi är svårt och kan ta tid att bemästra. Men en gång behärskar, denna operation kan utföras i cirka 30 minuter.Efter denna procedur kan andra metoder, som två fotonmikroskopi och in vivo bildframställning, utföras för att svara på ytterligare frågor om neurovaskulära remodeling och andra sjukdomsprocesser som involverar ryggmärgen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Dissektion och kultur commissural neuroner från embryonala ryggmärg

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Ryggmärgen Elektrofysiologi II: Extracellulär Sug elektrod Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo avbildning av Mouse Spinal Cord Använda Två-foton mikroskopi

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Stereotaktisk injektion av en viral vektor för villkorad Gene Manipulation i ryggmärgen hos möss

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Spinal Cord transection i Larvernas Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Ett förfarande för att implantera en Spinal avdelningen för Längs<em&gt; In Vivo</em&gt; Avbildning av Mouse Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Två-foton Imaging av Cellular Dynamics i ryggmärgen hos möss

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Imaging Serotonerga Fibrer i ryggmärgen hos möss med hjälp av CLARITY / CUBIC teknik

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

Imaging Neural aktivitet i den primära somatosensoriska Cortex med Thy1-GCaMP6s transgena möss

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Intra-arteriell leverans av neurala stamceller till råtta och mus hjärnan: Ansökan till cerebral ischemi

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...