这种方法可以帮助回答肝素感染和肝病领域的关键问题。如肝细胞种群的贡献，对病毒发病机，纵向感染动力学，病毒复制机制，免疫入侵，在生理模型系统和药物测试研究。这种技术的主要优点是能够重述肝微环境。
可长期保持，在生理相关水平上自然易感染乙肝。这以前是乙型肝炎领域的一个基本制约因素。这种技术的影响延伸到HBV感染的治疗或诊断，因为药物测试研究可以在生理平台上进行长时间的治疗。
这允许评估顺序药物治疗，同时分析现有和新颖的治疗策略的疗效。这种方法可以提供对乙型肝炎的理解，也可以应用于其他疾病研究，包括其他肝素感染，肝脏疾病，或药物代谢研究。一般来说，对这种方法的新鲜人会很挣扎，因为它需要注意特定的细节，以便长期成功维护肝脏组织。
并熟悉专门的工具和设备。此方法的可视化演示至关重要。包括板的组装，以及细胞的解冻和播种。
由于在使用新型培养系统时，涉及肝源细胞长期培养的步骤具有挑战性。首先，同时打开与肝片平台相关的压缩机和真空泵。继续到玻璃管柜组装和平衡板。
将无菌膜放在板基座上，开始无菌组装微流体板。确保无菌膜平稳地放在底板的两个销上。然后添加含好顶板。
添加无菌板盖。并使用自动精密扭矩，设置为33磅。使用螺旋紧固序列拧紧板底部的螺钉。
使用手动扭矩，确保所有螺钉都拧紧到 35 磅。接下来，预热肝细胞播种介质至37摄氏度，然后启动。将完全组装的板放在洗涤基座中。
并确保板完全卡扣。将400微升的肝细胞播种介质添加到每口井的储层侧，以加热板材。在此之后，以 1 微升/秒的速度向向上方向移动 3.5 分钟。
板块侧面的红色指示灯将指示微流体循环是否正常工作。一旦将培养基泵入细胞生长侧板，再加入1.2毫升的肝细胞播种介质。在 37 摄氏度和 5% CO2 下小心地将板转移到加湿培养箱内的坞站中。
以 1 微升/秒的流速向上启动流量 16 小时。在此之后，将盘子转移到洗涤码头。上下轻轻移液器，以消除任何气泡。
使用无菌钳子，向每个井中加入无菌圆形滤纸。然后向每个井添加一个单元附件支架和一个固定环。使用无菌柱塞向下推每一个井，并锁定固定环和脚手架到位。
接下来，吸气所有介质。在脚手架上轻轻加入400微升预热的肝细胞播种介质。以一微升/秒的速度向下移动，3 1~2分钟。
吸气从板的储液罐侧泵出的所有介质。在每个井中加入1.4毫升的肝细胞播种介质。然后将板返回码头，使每井的总体积达到 1.6 毫升。
首先，预热肝细胞解冻介质和肝细胞播种介质至37摄氏度。接下来，根据供应商的指示解冻一瓶原人类肝细胞。在玻璃管柜中，将细胞重新用一毫升的肝细胞播种介质中重新暂停。
然后将重新暂停的细胞放在冰上。使用 trypan 蓝色，计算细胞，以确保细胞的生存能力高于 90% 将完全组装的板转移到洗涤坞。并且从井中吸出所有介质。
从冰中取回细胞，并在500微升的肝细胞播种介质中，在每井中加入60万个肝细胞。以1微升/秒的流速向下启动流量。在每个井中加入900微升的肝细胞播种介质，使每井的总体积达到1.6毫升。
将板在37摄氏度和5%CO2下转移到加湿培养箱内的坞站。以 1 微升/秒的流速向下启动流量，为期 8 小时。在此之后，以 1 微升/秒的流速反转流量，持续 8 小时。
然后将板材转移到洗涤基座，然后从井中吸出所有介质。在每个井中加入400微升的肝细胞维持介质。以1微升/秒的流量向向下方向启动流量3 1~2分钟。
接下来，从储液罐中吸气所有介质，并加入1.4毫升的肝细胞维持介质。在 37 摄氏度和 5% CO2 下将板转移到加湿培养箱内的坞站。以 1 微升/秒的流量向上启动流量 48 小时。
48 小时后，将盘子转移到洗涤码头，以清洗板。从油井中吸出所有介质。并添加400微升的维护介质。
以 1 微升 / 秒的速度向动 3 . 5 分钟。然后吸气所有介质出现在水井的储层侧。加入1.4毫升的肝细胞维持介质。
然后将板重新转移到加湿孵化器中的坞站。以 1 微升/秒的流量向上启动流量 48 小时。每 48 小时使用此洗涤和更换工艺更换介质。
当使用常规培养系统时，原人类肝细胞通常只在有限的时间内保持稳定。但是，使用此处描述的协议，它们可以在功能上长时间维护。人类白化素由功能性肝细胞分泌，被认为是评估肝功能的最佳标记。
白素被认为是稳定，高度表达的3D文化，直到至少第40天播种后。对于共培养，通过测量特定细胞因子的分泌来评估库普弗细胞的功能和生存能力。如这里看到，IL-6和TNF alpha的测量水平表明细胞的功能维持和可行。
除了保留其生理细胞代谢，这些培养物变得特别容易受到乙肝病毒感染。HBV DNA 和其他病毒标记从感染后的第二天很容易检测到。虽然传统文化需要接种至少500个HBV基因组等价物，并辅之以DMSO和PEG，但这些3D培养物感染的基因组等价物只有05个。
除了病毒感染的分泌标记外，还从这些培养物中取回含有含肝细胞的脚手架。免疫荧光显微镜显示，这些支架含有病毒抗原。在尝试此程序时，重要的是要记住在播种前处理肝细胞时要温柔，以避免细胞死亡。
此外，必须确保板正确组装，并且所有流量通道在播种肝细胞之前都允许正确的介质流通。按照这个程序，其他方法，如免疫荧光可以执行，以回答其他问题。包括组织内受感染细胞的位置和频率。
肝细胞的生理状态也可以通过染色的白蛋白或肝结构，包括紧密结蛋白ZO-1进行评估。经过这一开发，该技术为病毒学领域的研究人员在生理三维模型系统中探索乙型肝炎感染和免疫反应铺平了道路。不要忘记，使用乙型肝炎病毒可能是危险的，在执行此程序时，应始终采取预防措施，如以前的疫苗接种、使用适当的 PPE 和在适当的生物安全指南下工作。
