"Lever-on-a-Chip" kulturer af primære hepatocytter og Kupffer celler for Hepatitis B virusinfektion

Denne metode kan hjælpe med at besvare vigtige spørgsmål i hepatotropiske infektioner og leversygdom felter. Såsom bidrag af lever hjemmehørende cellepopulationer, til viral patogenese, langsgående infektion kinetik, mekanismer viral replikation, immun invasion, i en fysiologisk model system og drug test undersøgelser. Den største fordel ved denne teknik er evnen til at opsummere en levermikromiljø.

Som kan opretholdes i længere tid og er naturligt modtagelige for hepatitis B-infektion på fysiologiske relevante niveauer. Dette har tidligere været en grundlæggende begrænsning på hepatitis B-området. Konsekvenserne af denne teknik strækker sig mod behandling eller diagnose af HBV-infektion, fordi test af lægemidler kan udføres i en fysiologisk platform for længere varigheder.

Dette gør det muligt at evaluere sekventielle lægemiddelbehandlinger sammen med at analysere effekten af eksisterende og nye behandlingsstrategier. Denne metode kan give forståelse i hepatitis B, og kan også anvendes til andre undersøgelser af sygdom, herunder andre hepatotropiske infektioner, leversygdomme, eller lægemiddelmetabolisme undersøgelser. Generelt, personer nye til denne metode vil kæmpe, fordi det kræver opmærksomhed på særlige detaljer for at tillade en vellykket vedligeholdelse af levervæv i lange perioder.

Og også fortrolig med de specialiserede værktøjer og udstyr. Visuel demonstration af denne metode er afgørende. Herunder samling af pladerne, samt optøning og såning af cellerne.

Da skridt involveret i den langsigtede kultur af lever-afledte celler er udfordrende, når du bruger en ny kultur system. Tænd først både kompressoren og vakuumpumpen i forbindelse med leverchipplatformen. Fortsæt til et glasrørskab for at samle og ligevægte pladerne.

Anbevis en steril membran på pladebunden for at begynde aseptisk at samle mikrofluidiske plader. Sørg for, at den sterile membran hviler jævnt på bundpladens to ben. Tilsæt derefter den godt indeholdende topplade.

Tilsæt et sterilt pladelåg. Og brug et automatiseret præcisionsmoment, sat til 33 pund. Brug en spiral stramning sekvens til at stramme skruerne i bunden af pladen.

Ved hjælp af et manuelt drejningsmoment skal du sørge for, at alle skruer er strammet til 35 pund. Dernæst pre-varme hepatocyte såning medium til 37 grader Celsius før priming. Anstæn skal den helt monterede plade sættes i vaskedokken.

Og sørg for, at pladen klikker helt ind. Tilsæt 400 mikroliter hepatocyt såning medium til reservoiret side af hver brønd til prime pladen. Derefter påbegyndes strømmen i opadgående retning i 3,5 minutter ved en mikroliter pr. sekund.

De røde indikatorer på siden af pladen vil indikere, om mikrofluidic cirkulationen fungerer korrekt. Når mediet er pumpet til cellevækst side af pladen, tilsæt en ekstra 1,2 milliliter hepatocyte såning medium. Overfør forsigtigt pladen ind i dockingstationen i en befugtet inkubator ved 37 grader Celsius og 5% CO2.

Start strømmen i opadgående retning med en strømningshastighed på en mikroliter pr. sekund i 16 timer. Derefter overføres pladen til en vaskedok. Pipetter forsigtigt op og ned for at fjerne eventuelle bobler.

Ved hjælp af en steril kraftafst, tilføje en steril rund filter papir til hver brønd. Derefter tilføje en celle vedhæftet fil stillads og en fastholde ring til hver brønd. Brug et sterilt stempel til at skubbe hver brønd ned og låse fastholdelsesringene og stilladserne på plads.

Dernæst aspirere hele mediet. Og tilsæt forsigtigt 400 mikroliter af forvarmte hepatocyte såning medium over stilladset. Start strømmen i en nedadgående retning med en mikroliter pr. sekund i 3 1/2 minut.

Aspirere alle medium pumpes ud af reservoiret side af pladen. Der tilsættes 1,4 milliliter hepatocytsåningsmedium til hver brønd. Derefter returneres pladen til dokken for at bringe det samlede volumen pr. brønd op til 1,6 milliliter.

Først pre-varme hepatocyte optøning medium og hepatocyte såning medium til 37 grader Celsius. Dernæst tø et hætteglas af primære menneskelige hepatocytter i henhold til leverandørens anvisninger. I et glas rør kabinet, resuspend cellerne i en milliliter hepatocyte såning medium.

Læg derefter de opsbrugte celler på is. Brug trypanblå, tælle cellerne for at sikre, at levedygtigheden af cellerne er over 90%Overfør den fuldt samlede plade til vaskedokken. Og aspirere alle medier fra brøndene.

Hent cellerne fra isen, og tilsæt 600.000 hepatocytter til hver brønd i en 500-mikroliter volumen af hepatocyt såning medium. Start strømmen i nedadgående retning med en strømningshastighed på en mikroliter pr. sekund. Tilsæt 900 mikroliter hepatocyt såning medium til hver brønd for at bringe det samlede volumen i hver til 1,6 milliliter.

Overfør pladen til dockingstationen i en befugtet inkubator ved 37 grader Celsius og med 5% CO2. Start strømmen i nedadgående retning med en strømningshastighed på en mikroliter pr. sekund i otte timer. Derefter skal strømmen vendes til den opadgående retning med en strømningshastighed på en mikroliter pr. sekund i otte timer.

Overfør derefter pladen til vaskedokken, og aspirere alle medier fra brøndene. Tilføj 400 mikroliter af hepatocyte vedligeholdelse medium til hver brønd. Og start flow i nedadgående retning med en strømningshastighed på en mikroliter per sekund i 3 1/2 minut.

Dernæst aspirere alle medium fra reservoiret, og tilsæt 1,4 milliliter hepatocyte vedligeholdelse medium. Overfør pladen ind i dockingstationen i en befugtet inkubator ved 37 grader Celsius og 5% CO2. Start strømmen i opadgående retning med en strømningshastighed på en mikroliter pr. sekund i 48 timer.

Efter 48 timer vaskes pladen ved at overføre den til vaskedokken. Aspirere alle medier fra brøndene. Og tilsæt 400 mikroliter af vedligeholdelsesmediet.

Og indlede flow i den nedadgående retning på en mikroliter per sekund i 3,5 minutter. Derefter aspirere alle medium vises i reservoiret side af brøndene. Der tilsættes 1,4 milliliter hepatocyt vedligeholdelsesmedium.

Overfør derefter pladen tilbage til dockingstationen i den befugtede inkubator. Start strømmen i opadgående retning med en strømningshastighed på en mikroliter pr. sekund i 48 timer. Udskift mediet ved hjælp af denne vask-og-erstatte proces hver 48 timer.

Primære menneskelige hepatocytter er normalt kun stabile i en begrænset mængde tid, når du bruger konventionelle kultursystemer. Men ved hjælp af den protokol, der er beskrevet her, kan de vedligeholdes funktionelt i længere tidsperioder. Human albumin udskilles af funktionelle hepatocytter, og anses for at være den bedste markør for evaluering af leverfunktionalitet.

Albumin ses at være stabilt og højt udtrykt af 3D-kulturer indtil mindst dag 40 post-seeding. For co-kulturer evalueres Kupffer-cellernes funktionalitet og levedygtighed ved at måle udskillelsen af specifikke cytokiner. Som det ses her, de målte niveauer af IL-6 og TNF alpha viser, at cellerne var funktionelt vedligeholdt og levedygtige.

Ud over at bevare deres fysiologiske cellulære stofskifte, disse kulturer blev usædvanligt modtagelige for HBV-infektion. HBV DNA og andre virale markører kan let påvises fra dag to efter infektion. Mens konventionelle kulturer kræver vaccination med mindst 500 HBV genomækvivalenter suppleret med DMSO og PEG, er disse 3D-kulturer inficeret med så lidt som 05 uforsynede genomækvivalenter.

Ud over udskilles markører for virusinfektion, hepatocyte-holdige stilladser er hentet fra disse kulturer. Immunfluorescensmikroskopi afslører, at disse stilladser indeholder virale antigener. Mens du forsøger denne procedure, er det vigtigt at huske at være blid, når håndtering af hepatocytter før såning for at undgå celledød.

Derudover er det vigtigt at sikre, at pladerne er korrekt samlet, og alle flowkanaler tillader korrekt mediecirkulation før såning hepatocytterne. Efter denne procedure, andre metoder som immunofluorescens kan udføres for at besvare yderligere spørgsmål. Herunder placeringen og hyppigheden af inficerede celler i vævet.

Den fysiologiske tilstand af hepatocytter kan også vurderes ved farvning for albumin eller leverstrukturer, herunder stramt kryds protein ZO-1. Efter denne udvikling, denne teknik baner vejen for forskere inden for virologi at udforske hepatitis B-infektion og immunrespons i en fysiologisk 3D-model system. Glem ikke, at arbejde med hepatitis B-virus kan være farligt, og forholdsregler såsom tidligere vaccination, brug af passende PPE, og arbejder under passende retningslinjer for biosikkerhed bør altid tages, mens du udfører denne procedure.