この方法は、肝刺激性感染症や肝疾患分野での主要な質問に答えることができます。肝臓に居住する細胞集団の寄与など、ウイルス病原性、縦方向感染運動、ウイルス複製のメカニズム、免疫浸潤、生理モデルシステムおよび薬物検査研究において。この技術の主な利点は、肝微小環境を再現する能力です。
これは長期間維持することができ、自然に生理学的関連レベルでB型肝炎感染の影響を受けやすい。これは以前、B型肝炎分野における基本的な制約でした。薬物検査の研究は長期間にわたって生理学的プラットフォームで行うことができるため、この技術の意味はHBV感染の治療または診断に及ぶ。
これにより、既存および新規の治療法戦略の有効性を分析するとともに、逐次的な薬物治療の評価が可能になります。この方法は、B型肝炎への理解を提供することができます, また、疾患の他の研究に適用することができます, 他の肝性感染症を含みます, 肝臓病, または薬物代謝研究.一般的に, この方法に新しい個人は苦労します, それは長期間の肝臓組織の正常な維持を可能にするために特定の詳細に注意を必要とするため、.
また、特殊な工具や機器にも親しまれています。この方法の視覚的なデモンストレーションは重要です。プレートのアセンブリを含むだけでなく、細胞の解凍と播種。
肝臓由来細胞の長期培養に関与するステップは、新規培養系を使用する場合に困難であるため.まず、肝臓チッププラットフォームに関連付けられたコンプレッサーと真空ポンプの両方をオンにします。プレートを組み立てて平衡化するために、ガラス管キャビネットに進みます。
プレートベースに滅菌膜を置き、微小流体プレートを無菌で組み立て始めます。無菌膜がベースプレートの2本のピンに滑らかにかかっていることを確認する。次に、よく含有するトッププレートを追加します。
滅菌プレート蓋を追加します。33ポンドに設定された自動精密トルクを使用します。スパイラル締め付けシーケンスを使用して、プレートの基部のネジを締めます。
手動トルクを使用して、すべてのネジが35ポンドに締め付けされていることを確認してください。次に、肝細胞播種培地をプライミング前に摂氏37度に予熱する。完全に組み立てたプレートを洗濯ドックに入れます。
そして、プレートが完全にスナップすることを確認してください。各ウェルのリザーバー側に400マイクロリットルの肝細胞播種培地を加え、プレートを盛り付けます。この後、毎秒1マイクロリットルで3.5分間上向き方向に流れを開始します。
プレートの側面にある赤色のインジケーターは、マイクロ流体循環が正常に機能しているかどうかを示します。培地がプレートの細胞増殖側に送り込まれたら、さらに1.2ミリリットルの肝細胞播種培地を加える。37°Cと5%CO2で加湿インキュベーター内のドッキングステーションにプレートを慎重に移します。
16時間、毎秒1マイクロリットルの流量で上向き方向に流れを開始します。この後、プレートを洗濯ドックに移します。気泡を除去するために上下にピペットを軽く。
滅菌鉗子を使用して、各ウェルに無菌丸いろ紙を加える。次に、セルアタッチメントスキャフォールドと保持リングを各ウェルに追加します。滅菌プランジャーを使用して各井戸を押し下げ、保持リングと足場を所定の位置にロックします。
次に、すべての培地を吸引する。そして、足場の上に温め込まれた肝細胞播種媒体の400マイクロリットルを静かに加えます。1秒当たり1マイクロリットルで3分の1分間、下方向に流れを開始します。
プレートの貯留部側からポンプで送り出されたすべての媒体を吸引する。各ウェルに1.4ミリリットルの肝細胞播種培地を加えます。その後、ドックにプレートを戻し、井戸あたりの総体積を最大1.6ミリリットルにします。
まず、肝細胞解凍培地と肝細胞播種培地を摂氏37度に予め温める。次に、サプライヤーの指示に従って、主要なヒト肝細胞のバイアルを解凍します。ガラス管キャビネット内で、細胞を肝細胞の播種培地の1ミリリットルに再懸濁させる。
その後、再懸濁した細胞を氷の上に置きます。トリパンブルーを使用して、細胞の生存率が90%を超えることを確認するために細胞を数え、完全に組み立てられたプレートを洗浄ドックに移します。そして、井戸からすべての媒体を吸引します。
氷から細胞を取り出し、500マイクロリットルの肝細胞播種培地で各ウェルに600,000個の肝細胞を加える。1マイクロリットル/秒の流量で下向き方向への流れを開始します。各ウェルに900マイクロリットルの肝細胞播種培地を加え、各ウェルの総容量を1.6ミリリットルにします。
37°Cで5%CO2で加湿インキュベーター内のドッキングステーションにプレートを移します。8時間、毎秒1マイクロリットルの流量で下向き方向に流れを開始します。この後、8時間毎秒1マイクロリットルの流量で上向き方向に流れを逆にします。
その後、プレートを洗浄ドックに移し、ウェルからすべての培地を吸引する。各ウェルに肝細胞維持培地400マイクロリットルを加えます。そして、3 1/2分間、毎秒1マイクロリットルの流量で下向き方向に流れを開始します。
次に、貯留槽からすべての培地を吸引し、1.4ミリリットルの肝細胞維持培地を加える。37°Cと5%CO2で加湿インキュベーター内のドッキングステーションにプレートを移します。毎秒1マイクロリットルの流量で48時間上向きに流れを開始します。
48時間後、洗浄ドックに移してプレートを洗います。井戸からすべての媒体を吸引する。そして、メンテナンス媒体の400マイクロリットルを追加します。
そして3.5分間、毎秒1マイクロリットルで下方向に流れを開始します。その後、井戸の貯留側に現れるすべての培地を吸引する。肝細胞維持培地を1.4ミリリットル加えます。
次に、プレートを加湿インキュベーターのドッキングステーションに戻します。毎秒1マイクロリットルの流量で48時間上向きに流れを開始します。この洗浄・交換プロセスを48時間ごとに使用して、培地を交換してください。
一次ヒト肝細胞は、通常、従来の培養システムを使用する場合、限られた時間だけ安定している。ただし、ここで説明するプロトコルを使用すると、機能を長期間にわたって維持できます。ヒトアルブミンは機能的肝細胞によって分泌され、肝機能を評価するための最良のマーカーであると考えられている。
アルブミンは、少なくとも40日目のポストシードまで、3D文化によって安定して高く表現されている。共培養の場合、クッパー細胞の機能性と生存率は、特定のサイトカインの分泌を測定することによって評価される。ここで見られるように、IL-6およびTNFアルファの測定されたレベルは、細胞が機能的に維持され、生存可能であることを示す。
生理的細胞代謝を維持することに加えて、これらの培養物はHBV感染の影響を非常に受けやすくなった。HBV DNAおよび他のウイルスマーカーは、2日目の感染後から容易に検出可能である。従来の培養では、DMSOおよびPEGを補う少なくとも500個のHBVゲノム相当量を接種する必要がありますが、これらの3D培養物は、わずか05個の未補充ゲノム相当物に感染しています。
ウイルス感染の分泌マーカーに加えて、肝細胞含有足場はこれらの培養物から取り出される。免疫蛍光顕微鏡は、これらの足場がウイルス抗原を含んでいる事を明らかにする。この手順を試みる間、細胞死を避けるために播種する前に肝細胞を扱うときに穏やかにすることが重要です。
さらに、プレートが正しく組み立てられ、すべてのフローチャネルが肝細胞を播種する前に正しいメディア循環を可能にすることを確認することが不可欠です。この手順に従って、免疫蛍光のような他の方法は、追加の質問に答えるために行うことができる。組織内の感染細胞の位置と頻度を含む。
肝細胞の生理的状態はまた、緊密な接合タンパク質ZO-1を含むアルブミンまたは肝構造の染色によって評価することができる。この開発の後、この技術は、ウイルス学の分野の研究者が生理学的3DモデルシステムにおけるB型肝炎感染および免疫応答を探求する道を開く。B型肝炎ウイルスの使用は危険であり、以前のワクチン接種、適切なPPEの使用、適切なバイオセーフティガイドラインの下での作業などの予防措置は、常にこの手順を実行する際に行われるべきであることを忘れないでください。
