Name: assessing cellular stress and inflammation in discrete oxytocin-secreting brain nuclei in the neonatal rat before and after first colostrum feeding
Uploaded: 2018-11-14T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Cellular Stress and Inflammation in Discrete Oxytocin-secreting Brain Nuclei in the Neonatal Rat Before and After First Colostrum Feeding at JoVE.co

Forfatterne takke Manon Ranger og Alexandra Schulz for deres bistand ved udarbejdelsen af denne protokol.

Denne undersøgelse blev godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg ved Columbia University og New York State psykiatriske Institute.
1. væv forberedelse
<ol><li>Bestil timet gravide rotter fra kreditor.</li>
	<li>Følg timet gravide rotter ved at observere deres voksende underliv i ugerne efter deres ankomst og efterfølgende på udkig unger på den forventede leveringsdato ved inspektion af buret hver 2 h indtil levering begynder.</li>
	<li>Fjerne unger med behandskede hånd a...

<ol>
	<li>Hietaniemi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiles+in+fetal+and+neonatal+rat+offspring+of+energy-restricted+dams.">Gene expression profiles in fetal and neonatal rat offspring of energy-restricted dams.</a> Journal of Nutrigenetics and Nutrigenomics. 2 (4-5), 173-183 (2009).</li><li>Okabe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogenous+glycine+receptor+expression+in+cortical+plate+neurons+and+Cajal-Retzius+cells+of+neonatal+rat+cerebral+cortex.">Homogenous glycine receptor expression in cortical plate neurons and Cajal-Retzius cells of neonatal rat cerebral cortex.</a> Neuroscience. 123 (3), 715-724 (2004).</li><li>Mailleux, P., Takazawa, K., Erneux, C., Vanderhaeghen, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+the+neurons+containing+inositol+1,4,5-trisphosphate+3-kinase+and+its+messenger+RNA+in+the+developing+rat+brain.">Distribution of the neurons containing inositol 1,4,5-trisphosphate 3-kinase and its messenger RNA in the developing rat brain.</a> Journal of Comparative Neurology. 327 (4), 618-629 (1993).</li><li>Carter, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxytocin+and+Human+Evolution.">Oxytocin and Human Evolution.</a> Current Topics in Behavioral Neuroscience. , (2017).</li><li>Sippel, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxytocin+and+Stress-related+Disorders:+Neurobiological+Mechanisms+and+Treatment+Opportunities.">Oxytocin and Stress-related Disorders: Neurobiological Mechanisms and Treatment Opportunities.</a> Chronic Stress (Thousand Oaks). 1, (2017).</li><li>Agnati, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspects+on+the+integrative+actions+of+the+brain+from+neural+networks+to+"brain-body+medicine".">Aspects on the integrative actions of the brain from neural networks to "brain-body medicine".</a> Journal of Receptors and Signal Transduction Research. 32 (4), 163-180 (2012).</li><li>Welch, M. G., Margolis, K. G., Li, Z., Gershon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxytocin+regulates+gastrointestinal+motility,+inflammation,+macromolecular+permeability,+and+mucosal+maintenance+in+mice.">Oxytocin regulates gastrointestinal motility, inflammation, macromolecular permeability, and mucosal maintenance in mice.</a> American Journal Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 307 (8), G848-G862 (2014).</li><li>Welch, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+developmental+regulation+of+oxytocin+(OT)+and+oxytocin+receptors+(OTR)+in+the+enteric+nervous+system+(ENS)+and+intestinal+epithelium.">Expression and developmental regulation of oxytocin (OT) and oxytocin receptors (OTR) in the enteric nervous system (ENS) and intestinal epithelium.</a> Journal of Comparative Neurology. 512 (2), 256-270 (2009).</li><li>Prakash, B. S., Paul, V., Kliem, H., Kulozik, U., Meyer, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+oxytocin+in+milk+of+cows+administered+oxytocin.">Determination of oxytocin in milk of cows administered oxytocin.</a> Analytica Chimica Acta. 636 (1), 111-115 (2009).</li><li>Solangi, A. R., Memon, S. Q., Mallah, A., Khuhawar, M. Y., Bhanger, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+separation+of+oxytocin,+norfloxacin+and+diclofenac+sodium+in+milk+samples+using+capillary+electrophoresis.">Quantitative separation of oxytocin, norfloxacin and diclofenac sodium in milk samples using capillary electrophoresis.</a> Biomedical Chromatography. 23 (9), 1007-1013 (2009).</li><li>Klein, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxytocin+modulates+markers+of+the+unfolded+protein+response+in+Caco2BB+gut+cells.">Oxytocin modulates markers of the unfolded protein response in Caco2BB gut cells.</a> Cell Stress and Chaperones. 19 (4), 465-477 (2014).</li><li>Klein, B. Y., Tamir, H., Hirschberg, D. L., Glickstein, S. B., Welch, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxytocin+modulates+mTORC1+pathway+in+the+gut.">Oxytocin modulates mTORC1 pathway in the gut.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 432 (3), 466-471 (2013).</li><li>Klein, B. Y., Tamir, H., Ludwig, R. J., Glickstein, S. B., Welch, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colostrum+oxytocin+modulates+cellular+stress+response,+inflammation,+and+autophagy+markers+in+newborn+rat+gut+villi.">Colostrum oxytocin modulates cellular stress response, inflammation, and autophagy markers in newborn rat gut villi.</a> Biochemical an Biophysical Research Communications. 487 (1), 47-53 (2017).</li><li>Donnet-Hughes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+role+of+the+intestinal+microbiota+of+the+mother+in+neonatal+immune+education.">Potential role of the intestinal microbiota of the mother in neonatal immune education.</a> Proceedings of the Nutritional Society. 69 (3), 407-415 (2010).</li><li>Perez, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+imprinting+of+the+neonatal+immune+system:+lessons+from+maternal+cells?.">Bacterial imprinting of the neonatal immune system: lessons from maternal cells?.</a> Pediatrics. 119 (3), e724-e732 (2007).</li><li>Takeda, S., Kuwabara, Y., Mizuno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentrations+and+origin+of+oxytocin+in+breast+milk.">Concentrations and origin of oxytocin in breast milk.</a> Endocrinolcia Japonica. 33 (6), 821-826 (1986).</li><li>Quintana, D. S., Outhred, T., Westlye, L. T., Malhi, G. S., Andreassen, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+oxytocin+administration+on+brain+activity:+a+systematic+review+and+meta-analysis+protocol.">The impact of oxytocin administration on brain activity: a systematic review and meta-analysis protocol.</a> Systematic Reviews. 5 (1), 205 (2016).</li><li>Dobbing, J., Sands, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+aspects+of+the+brain+growth+spurt.">Comparative aspects of the brain growth spurt.</a> Early Human Development. 3 (1), 79-83 (1979).</li><li>Orr, M. E., Garbarino, V. R., Salinas, A., Buffenstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extended+Postnatal+Brain+Development+in+the+Longest-Lived+Rodent:+Prolonged+Maintenance+of+Neotenous+Traits+in+the+Naked+Mole-Rat+Brain.">Extended Postnatal Brain Development in the Longest-Lived Rodent: Prolonged Maintenance of Neotenous Traits in the Naked Mole-Rat Brain.</a> Frontiers in Neuroscience. 10, 504 (2016).</li><li>Hansson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+quantitative+proteome+analysis+of+in+vivo+intestinal+development.">Time-resolved quantitative proteome analysis of in vivo intestinal development.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 10 (3), (2011).</li><li>Mochizuki, K., Yorita, S., Goda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+changes+in+the+jejunum+of+rats+during+the+transient+suckling-weaning+period.">Gene expression changes in the jejunum of rats during the transient suckling-weaning period.</a> Journal of Nutritional Science and Vitaminology (Tokyo). 55 (2), 139-148 (2009).</li><li>Rinaman, L., Banihashemi, L., Koehnle, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+life+experience+shapes+the+functional+organization+of+stress-responsive+visceral+circuits.">Early life experience shapes the functional organization of stress-responsive visceral circuits.</a> Physiology and Behavior. 104 (4), 632-640 (2011).</li><li>Johannes, G., Sarnow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cap-independent+polysomal+association+of+natural+mRNAs+encoding+c-myc,+BiP,+and+eIF4G+conferred+by+internal+ribosome+entry+sites.">Cap-independent polysomal association of natural mRNAs encoding c-myc, BiP, and eIF4G conferred by internal ribosome entry sites.</a> RNA. 4 (12), 1500-1513 (1998).</li><li>Rinaman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hindbrain+noradrenergic+A2+neurons:+diverse+roles+in+autonomic,+endocrine,+cognitive,+and+behavioral+functions.">Hindbrain noradrenergic A2 neurons: diverse roles in autonomic, endocrine, cognitive, and behavioral functions.</a> American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 300 (2), R222-R235 (2011).</li><li>Walker, C. D., Toufexis, D. J., Burlet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothalamic+and+limbic+expression+of+CRF+and+vasopressin+during+lactation:+implications+for+the+control+of+ACTH+secretion+and+stress+hyporesponsiveness.">Hypothalamic and limbic expression of CRF and vasopressin during lactation: implications for the control of ACTH secretion and stress hyporesponsiveness.</a> Progress in Brain Research. 133, 99-110 (2001).</li><li>Montiel-Castro, A. J., Gonzalez-Cervantes, R. M., Bravo-Ruiseco, G., Pacheco-Lopez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microbiota-gut-brain+axis:+neurobehavioral+correlates,+health+and+sociality.">The microbiota-gut-brain axis: neurobehavioral correlates, health and sociality.</a> Frontiers in Integrative Neuroscience. 7, 70 (2013).</li><li>Blevins, J. E., Ho, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+oxytocin+signaling+in+the+regulation+of+body+weight.">Role of oxytocin signaling in the regulation of body weight.</a> Reviews in Endocrine and Metabolic Disorders. 14 (4), 311-329 (2013).</li><li>Welch, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+administration+of+secretin+and+oxytocin+inhibits+chronic+colitis+and+associated+activation+of+forebrain+neurons.">Combined administration of secretin and oxytocin inhibits chronic colitis and associated activation of forebrain neurons.</a> Neurogastroenterology Motility. 22 (6), 654 (2010).</li><li>Berthoud, H. R., Neuhuber, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+chemical+anatomy+of+the+afferent+vagal+system.">Functional and chemical anatomy of the afferent vagal system.</a> Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical. 85 (1-3), 1-17 (2000).</li><li>Taniuchi, S., Miyake, M., Tsugawa, K., Oyadomari, M., Oyadomari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+stress+response+of+vertebrates+is+regulated+by+four+eIF2alpha+kinases.">Integrated stress response of vertebrates is regulated by four eIF2alpha kinases.</a> Scientific Reports. 6, 32886 (2016).</li><li>Altschuler, S. M., Bao, X. M., Bieger, D., Hopkins, D. A., Miselis, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscerotopic+representation+of+the+upper+alimentary+tract+in+the+rat:+sensory+ganglia+and+nuclei+of+the+solitary+and+spinal+trigeminal+tracts.">Viscerotopic representation of the upper alimentary tract in the rat: sensory ganglia and nuclei of the solitary and spinal trigeminal tracts.</a> Journal of Comparative Neurology. 283 (2), 248-268 (1989).</li><li>Shapiro, R. E., Miselis, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+central+neural+connections+of+the+area+postrema+of+the+rat.">The central neural connections of the area postrema of the rat.</a> Journal of Comparative Neurology. 234 (3), 344-364 (1985).</li><li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , (1997).</li><li>Nayak, R., Pintel, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+viruses+can+induce+phosphorylation+of+eIF2alpha+via+PKR+activation,+which+can+be+overcome+by+helper+adenovirus+type+5+virus-associated+RNA.">Adeno-associated viruses can induce phosphorylation of eIF2alpha via PKR activation, which can be overcome by helper adenovirus type 5 virus-associated RNA.</a> Journal of Virology. 81 (21), 11908-11916 (2007).</li><li>Zaborske, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+tRNA+charging+and+activation+of+the+eIF2+kinase+Gcn2p.">Genome-wide analysis of tRNA charging and activation of the eIF2 kinase Gcn2p.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (37), 25254-25267 (2009).</li><li>Hollis, J. H., Lightman, S. L., Lowry, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+systemic+and+visceral+sensory+information+by+medullary+catecholaminergic+systems+during+peripheral+inflammation.">Integration of systemic and visceral sensory information by medullary catecholaminergic systems during peripheral inflammation.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1018, 71-75 (2004).</li><li>Klein, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxytocin+opposes+effects+of+bacterial+endotoxin+on+ER-stress+signaling+in+Caco2BB+gut+cells.">Oxytocin opposes effects of bacterial endotoxin on ER-stress signaling in Caco2BB gut cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1860 (2), 402-411 (2016).</li><li>Kaltschmidt, B., Kaltschmidt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB+in+the+nervous+system.">NF-kappaB in the nervous system.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (3), a001271 (2009).</li></ol>

En teknik til microdissection af diskrete OTR-rige hjernen kerner i neonatal rotte hjernen er præsenteret i dette papir. Det er almindeligt anerkendt, at neuroner er højt specialiserede, selv inden for godt karakteriseret kerner i hjernen. Denne meget reproducerbare tilgang til at isolere bestemte OTR-rige kerner giver mulighed for robust hypotesetest. Ved hjælp af automatiserede Western blotting, blev konsistens og reproducerbarhed af resultaterne yderligere forbedret. Mens en begrænsning af denne teknik er fortsat ...

I modsætning til vores forståelse af tidlige hjernens udvikling forekommer i løbet af dage-til-uger postpartum er relativt lidt kendt om utal af dynamiske forandringer i de første timer af livet i rotter. En central udfordring har været den lille størrelse af neonatal rotte hjernen og et krav om high-tech redskaber til at isolere diskrete hjerneregioner eller enkelte celler. Undersøgelser vurdere ofte gen transskription og ikke oversættelse1,2, som ikke giver en fast forståelse af funktionelle niveauer af aktiverede signaling molekyler. Andre undersøge udtryk ved hjælp af Immunhistokemi reference hjernen regioner, som ikke tillader for kvantificering af udtryk niveau3. Ingen undersøgelse til dato har undersøgt aktivering af signalering veje tilknyttet rats' første colostrum feed i diskrete hjerneregioner, som kræver hurtig isolation og offer og måling af protein udtryk og protein fosforylering ved hjælp af Western blotting. Mens hjernen microdissection udføres på ældre og større hjerner, har vi ikke identificeret reference udfører en ikke-encellede hjernen punch i en P0 hjerne. Dette paper præsenterer en protokol til at isolere begrænset regioner af neonatal hjernen ved hjælp af en forholdsvis lavteknologisk punch teknik og en Western blotting-procedure til at måle protein udtryk i relativt små prøver. Denne protokol kan være egnet til forskningsspørgsmål, der kræver vurdering af protein udtryk og posttranslationelle modifikationer (fx., fosforylering) i relativt begrænsede områder af små hjerner af enhver art, forudsat at den brugeren kan visuelt identificere området af hjernen af interesse med et atlas og identificerbare milepæle.
Denne teknik blev udviklet for at forstå forandringer i hjernen som følge af den neonatale rats' første colostrum feed, som er rig på oxytocin (OT). OT har længe været kendt for sin evne til at stimulere mælk nedløb og uterin sammentrækning. Dog er OT nu kendt for at spille en bred vifte af roller i reguleringen af mange kropsfunktioner og adfærd4. For eksempel, OT modsætter sig stress og inflammation i forbindelse med adaptive affiliative adfærd5, forsinkelser, gastrisk tømning, og bremser intestinal transit. OT receptorer (OTR) er blevet identificeret i enteriske neuroner og intestinale epitel6,7,8. Gastrointestinale virkningerne af OT er særligt vigtige for barnet i den tidlige postnatale periode. For eksempel, amning er forbundet med levering af betydelige mængder af OT til neonatal gut9,10, og data viser, at OTR stærkt overexpressed i duodenal villi under mælken pattegris periode8.
In vitro- eksperimenter ved hjælp af en gut cellelinie har demonstreret på cellulært niveau at oxytocin modulerer vigtige molekyler i stress signalering vej11,12 og en regulerende rolle i oversættelse af proteiner 12. disse undersøgelser tyder på, at komponenterne i mælken, herunder eksogene oxytocin fra moderen, er vigtige i udfoldet protein respons i nyfødte at reducere cellulært stress13.
In vivo og ex vivo studier har vist, at colostrum OT modulerer cellulært stress respons, betændelse og autophagy markører i nyfødte rotte gut villi. Nyfødte enterocytes lider væsentlig cellulært stress på deres luminale side når tarmen er samtidig udsat for mikrobiota fra moderen i colostrum14,15 og mange proteiner, herunder hormoner som OT9 , 10 , 16.
OT indvirkning på hjernen har været undersøgt17. OT signaling mekanismer demonstreret i tarmen i de tidlige postnatale periode er imidlertid ikke blevet undersøgt i hjernen. I dette papir, er en metode til at isolere diskrete hjernen kerner i neonatal rotte hjernestammen og hypothalamus ved hjælp af elektroforese bruges til at profilere enkeltstående hjerneregioner. Det overordnede mål med denne metode er at fange tilstanden af celle signalering i hjernen områder så tæt som muligt til fødsel, før og efter den første mælk diegivning i hjernevæv med den laveste glial/neuronal indeks. Begrundelsen for udviklingen af denne teknik er at det giver mulighed for hurtige isolering af begrænset, mikroskopiske hjerneregioner i neonatal unger med en mere homogen samling af neuroner for ex vivo undersøgelser ved hjælp af en automatiseret Western blotting metode, giver særdeles ensartede resultater på forholdsvis små dissekeret prøver. En mangel ved forudgående arbejde omfatter mere grov dissektion (hjernen skiver eller hele hjernen) og ældre dyr18,19. Hjerner af unge unger er utroligt dynamisk, featuring bølger af glial differentiering efter fødslen. For at studere ændringer i hjernen påvirket af pups' første fodring, er studerer begrænset neuronal kerner med reproducerbare dissektion nødvendige.
Mælk foder er normalt analyseret for sit immunologiske og ernæringsmæssige indflydelse på helbred eller gene udtryk (eksempelvis i enterocytes20,21), der henviser til, at dens virkning på hjernen områder under hjernens udvikling er sjældent undersøgt. Effekten af mælk transit i tarmen på hjernefunktion blev analyseret i forhold til gut cholecystokinin receptorer vagus relæ til hjernestammen kerner, men ikke til intracellulær signalering veje22. Der er en omfattende litteratur om sårbarhed af udvikle nyfødte hjernen til fejlernæring af mødre under graviditet23, men stress og inflammation signalerne er ikke behandlet. Vigtigere er, udnytter den nuværende metode et fænomen i dag-nul rotte nyfødte, der isolerer blod-født colostrum stimuli fra vagus relæ af visceral stimuli. Dette er den såkaldte stress hypo-lydhørhed periode præget af umodne kernen tractus solitarius (NTS)-hypothalamus kredsløb umiddelbart efter fødslen24,25 , som begrænser NTS, paraventricular kerne (PVN), og supraoptic kerne (søn) signaler til blod-født stimuli.
Denne metode er nyttig for analyse af flere signaling veje og begrænset relativt til neuronale celler, forudsat at hjernevæv er høstet på postnatal dag-0 i rotter, ud over om mødre er blevet anfægtet eller ikke af nogen form for behandling under graviditet. Kuld kan analyseres for virkningerne af colostrum feed versus pre fodring signalering. Når man sammenligner signaler mellem hjernen områder med fattige versus rig protein udbytte, denne metode gør det muligt i-kapillær bestemmelse af total protein af polypeptid bands i kapillærer løber parallelt med immun-kvantitering af protein antigener. Denne metode gør det muligt for kvantitativ sammenligning, ved hjælp af arbitrære enheder, af resultaterne af den samme antistof uden standard kvantitative kurver og med henvisning til total protein pr. kapillær. Sammenligne resultaterne af forskellige antistoffer er muligt, kun ved hjælp af kvantitative standard kurver.
Denne metode er tilladt for vurdering af tovejs signalering mellem tarmen og hjernen, og som kan påvirke funktion i begge organer26. Association mellem indtag af oxytocin og fødevarer, som er blevet grundigt undersøgt i de seneste år27, understøtter en sammenhæng mellem øget oxytocin signalering og næringsstoftilgængelighed. Disse undersøgelser støtter også begrebet converse energi underskud er kombineret med reduktioner i hypothalamus oxytocin signalering.
Tidligere undersøgelser af effekten af OT på hjerneaktivitet viste, at induceret gut betændelse fremkaldt økonomichefer transskription i hypothalamus PVN, amygdala og piriform cortex, som er refraktære over for vagotomy28. Systemisk infusion af OT med sekretin faldt imidlertid hjernen økonomichefer svar på den provokeret betændelsesreaktion i gut28. Dette foreslog, at effekten af eksogene OT blev udført af ruter end vagus relæer, eventuelt via blodbårne signaling molekyler transporteres gennem område postrema6,29.
I denne undersøgelse, blev cellulært stress signaling veje, der har tidligere observeret i tarmen vurderet i hjernen. Hypotesen var at mælkebestanddele kan beskytte eller udskyde effekten af betændelse på gut permeabilitet til mikrobiel og andre metabolitter, og til gengæld effekter på hjernens funktion. De klare antagonistiske forskelle i IkB versus BiP signalering fundet i villi, før og efter priming af colostrum13, foreslog, at hjerner af nyfødte, stadig i færd med at udvikle, kan fornemme signalerne colostrum-induceret gut.
Signaling protein markører, der anvendes i tidligere gut eksperimenter, der er forbundet med endoplasmatiske reticulum stress blev målt. De omfatter ER anstandsdame BiP, oversættelse indledningen faktor eIF2a (som fungerer som en stress reaktion integrator30), eIF2a kinase p-PKR, og to betændelse-signalering proteiner (NF-kB og dens inhibitor, IkB).
Seks hjerneregioner baseret på deres evne hos voksne udskiller eller besvare OT blev valgt. NTS, beliggende på den øvre medulla, er den første relæ af visceral input og modtager direkte signalering fra vagus sensoriske neuroner i tarmen31 og eventuelt blod-født cytokiner, toksiner og hormoner via den tilstødende område postrema32. PVN, supraoptic kerne (søn), striatum kerner (STR), hjernebarken (CX) og mediale preoptic kerne (MPO) modtager signaler fra tarmen via NTS.
Resultaterne viste, at den cellulære stressrespons i umiddelbar postnatale periode forud for colostrum priming og umiddelbart efter første fodring er forskellige i NTS i forhold til PVN og søn. Signalering i CX, afveg STR og MPO fra PVN og søn, så godt. Af OT vist tidligere at modulere cell stress og betændelse i tarmen særskilt beskyttende funktioner er sandsynligvis sanses af nogle områder af hjernen. Kollektivt, viser dataene, at på cellulært niveau, i de første timer efter fødslen, hjernen reagerer på metabolisk stress forbundet med næringsstoffer insufficiens. Dataene viser også, at omfang og retning af modulerende virkningerne af colostrum feed er region-afhængige og, i nogle regioner, de spejl OT effekter vist tidligere i tarmen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bradford solution</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein lysis kit</td>
			<td>Protein simple</td>
			<td>CBS403</td>
			<td>Bicine/CHAPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WES kits</td>
			<td>Protein simple</td>
			<td>WES-Mouse 12-230 master kit (PS-MK15), WES-Rabbit 12-230 master kit (PS-MK14), WES 12-230 kDa total Protein master kit (PS-TP07)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse IgG HRP conjugate</td>
			<td>Protein simple</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-phospho-eIF2a</td>
			<td>Cell Signaling technology</td>
			<td>SER51, 9721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse mAb anti-PKR</td>
			<td>Cell Signaling technology</td>
			<td>2103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-phospho-PKR</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Thr451, 07-886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit mAb anti-PKR</td>
			<td>Cell Signaling technology</td>
			<td>12297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit mAb anti-GAPDH</td>
			<td>Cell Signaling technology</td>
			<td>2118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse mAb anti-phospho-IKB</td>
			<td>Cell Signaling technology</td>
			<td>9246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse mAb anti-IKB</td>
			<td>Cell Signaling technology</td>
			<td>4814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-BiP</td>
			<td>Cell Signaling technology</td>
			<td>3183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti GCN2</td>
			<td>Cell Signaling technology</td>
			<td>3302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit mAb anti-phospho-GCN2</td>
			<td>BIORBYT</td>
			<td>T899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pregnant Sprague-Dawley rats</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Punch device</td>
			<td>WellTech Rapid Core or Harris Uni-Core</td>
			<td>0.35, 0.50, 0.75, 1.0, 1.20, 1.50</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing cellular stress and inflammation in discrete oxytocin-secreting brain nuclei in the neonatal rat before and after first colostrum feeding

Målet med denne protokol er at isolere oxytocin-receptor rige hjernen kerner i neonatal hjernen, før og efter første råmælk fodring. Udtryk for proteiner kendt til at reagere på metabolisk stress blev målt i hjernen-kerner isolater ved hjælp af Western blotting. Dette blev gjort for at vurdere, om metabolisk stress-induceret næringsstof insufficiens i kroppen udløste neuronal stress. Vi har tidligere vist, at næringsstoffer insufficiens i nyfødte fremkalder metabolisk stress i tarmen. Derudover modulerer råmælk oxytocin cellulært stress respons, betændelse og autophagy markører i nyfødte rotte gut villi før og efter første foder. Signalering protein markører tilknyttet endoplasmatiske reticulum stress [ER anstandsdame bindende immunoglobulin protein (BiP), eukaryote oversættelse indledningen faktor 2A (eIF2a), og eIF2a kinase protein kinase Rasmussen (p-PKR)], samt to betændelse-signalering proteiner [nuclear factor-κB (NF-kB) og hæmmer κB (IkB)], blev målt i nyfødte hjernen kerner [kernen i den ensomme tarmkanalen (NTS), paraventricular kerne (PVN), supra-optik kernen (søn), cortex (CX), striatum kerner (STR), og mediale preoptic kernen (MPO)] før den første foder (unprimed af råmælk) og efter starten af sygepleje (primes af råmælk). Udtryk for BiP/GRP78 og p-eIF2a blev upregulated i unprimed og downregulated i PRIMES NTS væv. NF-kB blev bevaret (høj) i CX, STR og MPO cytoplasma, hvorimod NF-kB var lavere og uændret i NTS, PVN og søn i begge betingelser. Den kollektive BiP og p-eIF2 resultater er i overensstemmelse med en stressrespons. eIf2a var fosforyleret af dsRNA afhængig kinase (p-PKR) i søn, CX, STR og MPO. Men i NTS (og i mindre grad i PVN), eIf2a var fosforyleret af en anden kinase, generel kontrol nonderepressible-2 kinase (GCN2). De stress-modulerende mekanismer tidligere observeret i nyfødte gut enterocytes synes at blive spejlet i nogle OTR-rige hjerneregioner. NTS og PVN kan udnytte en anden fosforylering mekanisme (under næringsmangel) fra andre regioner og er refraktære over for virkningen af næringsstof insufficiens. Kollektivt, tyder disse data på, at hjernen svar til næringsstof insufficiens stress er opvejet af signalering fra colostrum-pulverlak enterocytes.

De repræsentative bands af immunoreactivity i forhold til total protein viser, at der er hjernen kerner med meget lav høstede protein. Dette kræver brug af automatiserede vestlige skamplet teknik, som er meget følsomme i forhold til den kanoniske vestlige skamplet. Denne tilgang kan køres med fortyfold mindre protein pr. kapillær i forhold til pr. vognbane i Western blotting.
Differential virkningerne af colostrum priming på...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Cellular Stress and Inflammation in Discrete Oxytocin-secreting Brain Nuclei in the Neonatal Rat Before and After First Colostrum Feeding at JoVE.co

Assessing Cellular Stress and Inflammation in Discrete Oxytocin-secreting Brain Nuclei in the Neonatal Rat Before and After First Colostrum Feeding

Vurdering af cellulært Stress og Inflammation i diskrete Oxytocin-secernerende hjernen kerner i Neonatal rotten før og efter første råmælk fodring

Vi præsenterer her, en protokol for at isolere hjernen kerner i neonatal rotte hjernen sammenholdt med første råmælk fodring. Denne teknik giver mulighed for undersøgelse af næringsstof insufficiens stress i hjernen som moduleres af enterocyte signalering.

The goal of this protocol is to isolate oxytocin-receptor rich brain nuclei in the neonatal brain before and after first colostrum feeding. The expression ...

Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål i postnatal udvikling område om den måde, mælk diende påvirker stress signalering i hjernen. Denne teknik kan bruges til at indfange specifikke hjerneområder i den første naturlige sulteperiode og sammenligne dem med de respektive områder kort efter det første naturlige råmælksfoder. Forstå, hvordan diende påvirker fysiologi adfærd og følelser gør det muligt at bruge en antagonist til forskellige receptorer under ex-vivo hjernevæv analyse.For at opnå kerner slag, fjerne rotte hvalpe ved deres hale med en behandsket hånd. Efter høst hjernen, hurtigt placere hele organet i en polymethyl methacrylat hjerne skimmel ved stuetemperatur og straks bruge et nyt barberblad til at gøre 500 mikrometer tykke skiver af vævet. Læg skiverne rostral til caudal i en petriskål, da de er opnået for at opretholde den korrekte orientering af sektionerne.Når hele hjernen er blevet snittet, hurtigt tilføje kunstige cerebral spinalvæske uden glukose til fadet og inkubere skiver i 60 minutter ved 28 til 30 grader Celsius med konstant omrøring på en orbital shaker. Brug en hjerne atlas og anatomiske vartegn på hvert væv til at identificere hjernen kerner, der skal udstanses og placere skiven med kerner af interesse i en ny petriskål under en dissekere mikroskop. Når visualiseret, bruge en coring værktøj til hurtigt punch ud fire til seks forskellige kerner og hurtigt nedsænke hver hul kerne i 0,06 ml iskold protein ekstraktion buffer i passende mærket mikro-centrifuge rør, der indeholder proteushæmmere og fosfatase hæmmere i 60 minutter.Ved inkubationens afslutning centrifugeres de ekstraherede kerner i en afkølet minicentrifuge, og der anvendes en mikropipette til omhyggeligt at overføre 0,055 ml supernatant fra hvert rør til det passende forkølede 1,5 ml mikrocentrifugerør på is. Før negativ 20 grader Celsius opbevaring, overføres 0,012 ml supernatant fra hvert proteinstrømsrør til det passende 0,5 ml forkølede rør på is til det første prøvepræparat. For at forberede prøverne til måling af protein i kapillaren til tilsættes 0,003 ml stamblandingsreage fra et proteinlyissæt til hver af prøverne i de 0,5 ml mærkede rør.Dernæst tilsættes 0,004 ml master mix reagens til en biotinyleret molekylvægt stigen løsning i 0,016 ml deioniseret vand, og protese stigen og protein ekstrakt prøver i en 95 grader Celsius varmeblok, opbevaring alle rørene ved fire grader Celsius efter fem minutter. For signalproteinanalyse tilsættes 0,01 ml frisklavet luminolperoxidopløsning til brønde E-1 til E-25 af en ny automatiseret western plade, 0,01 ml sekundær antimuseantistof til brønde D-2 til D-25, og der tilsættes 0,01 ml streptavidin peberrodsperoxidase fra sættet til godt D-1. Der tilsættes 0,01 ml frisklavet primært antistof i brøndene C-2 til C-25 og 0,01 ml antistoftyndy to opløsning til brønde C-1 og B-1 til B-25.Lad rækkeF-brøndene stå tomme, og fyld de fem rum i de tre rækker under F-rækken med 0,45 ml vaskebuffer. Derefter drejer kort de kølede prøver i 30 sekunder og tilsæt 0,03 ml af hver prøve til hver brønd i række A, begyndende med A-2. Derefter tilsættes 0,005 ml af den biotinylerede molekylvægt stige til godt A-1 og dække pladen for centrifugering.Mens pladen er centrifugeret, åbne en ny køre fil i den automatiserede vestlige tilhørende software og indlede en molekylær størrelse assay. På analysesiden skal du indtaste prøvenavnene i hver kapillær samt navnene på de primære og sekundære antistoffer. Ved centrifugeringsafslutningen skal pladen i det automatiske vestlige instrument sættes i den automatiske vestlige instrument, og dækslet skal pilles af kapillærkassen.Efter centrifugering, glem ikke at inspicere for luftbobler, fordi luftbobler i kapillær kan blokere den elektroforetiske strøm og mislykkes hele runden. Sæt patronen i den angivne position i instrumentet, og luk lågen. Klik på start.Når du bliver bedt om at angive analysetypen, skal du indtaste eksperimentets navn i den relevante tekstboks og klikke på okay. Når du bliver bedt om det aktiverede kørselsdato og id-nummeret på kørselsfilen, skal du notere det tidspunkt, hvor kørslen slutter. Ved afslutningen af løbet skal kapillærpatronen kasseres i kloakken og pladen i bortskaffelsen af biofarlige materialer.Efter elektroforese adskillelse, kontrollere køre filer for immun reaktivitet toppe af antigener på 40 til 43 kilodaltons, der står for fosforyleret eukaryote oversættelse indledning faktor 2A. Hvor der mangler molekylvægtspidser af denne størrelse, skal du højreklikke under kurven og vælge tilføj molekylvægt for at toppe for at sikre, at størrelserne og de vilkårlige mængder under kurven registreres. Inden for unprimeds vævsprøver, bindende amino globulin protein niveauer i kernerne i den ensomme spor er betydeligt højere i forhold til alle de andre regioner.Priming af tarmvævet med råmælk nedsætter bindende amino globulinproteinniveauer i kernerne på det ensomme spor og har ingen effekt på paraventrikulære kerner og superoptiske kerner. Omvendt, priming øger bindende amino globulin protein niveauer i cortex, rillation kerner, og mediale preoptic kerner i forhold til unprimed væv, hvilket indebærer, at bindende amino globulin protein niveauer i de forskellige testede hjernekerner reagere forskelligt på tarm priming og der er endnu ikke nogen påvist krydstale mellem de forskellige kerner testet. Eukaryotic oversættelse indledning faktor 2A og fosforyleret eukaryote oversættelse indledning faktor 2A niveauer er forhøjet i den ikke-primære tilstand i forhold til andre kerner.Efter priming reduceres niveauet af både eukaryote oversættelsesinieringsfaktor 2A og fosforyleret eukaryote oversættelsesiniterende initieringsfaktor 2A i forhold til kerner i det ensomme spor sammenlignet med ikke-primeret væv. I alle andre testede kerner øger priming niveauet af eukaryote oversættelsesinitenstakt 2A og fosforyleret eukaryote oversættelsesinieringsstartfaktor 2A i forhold til ikke-primært væv. Men, niveauer af fosforyleret protein kinase receptor er lav i ikke-primerede prøver i forhold til primede prøver i kerner af den ensomme spor, stærkt tyder på, at en anden kinase er involveret i fosforylering af eukaryot oversættelse indledning faktor 2A.Efter sin udvikling banede denne teknik vejen for forskere inden for postnatal udvikling for at udforske de signalveje, der er involveret i vævsvækst og -differentiering, og om de er påvirket af eller uafhængige af diende. Glem ikke, at arbejde med flygtige reduktionsmidler som for eksempel dithiothreitol, kan være farligt, og forholdsregler såsom forberedelse i den kemiske hætte bør altid tages, når du forbereder denne procedure.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

Trichuris muris is a natural pathogen of mice and is biologically and antigenically similar to species of Trichuris that 
infect humans and livestock1. ...

Assessing Somatic Hypermutation in Ramos B Cells after Overexpression or Knockdown of Specific Genes

Vurdering af Somatisk Hypermutation i Ramos B-celler efter Overekspression eller Knockdown af specifikke gener

B cells start their life with low affinity antibodies generated by V(D)J recombination.  However, upon detecting a pathogen, the variable (V) region of an ...

Primary Microglia Isolation from Mixed Glial Cell Cultures of Neonatal Rat Brain Tissue

Primære Mikroglia Isolering af blandede gliacelle Kulturer af neonatal rottehjerne Tissue

Microglia account for approximately 12% of the  total cellular population in the mammalian brain. While neurons and astrocytes are considered  the major ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Dyrkning Mikroglia fra Neonatal og Adult Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Non-invasive Model of Neuropathogenic<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Infektion i Neonatal Rat

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolering af Salmonella typhimurium-indeholdende Phagosomes fra makrofager

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

Vurdering af cellulære immunrespons i frugtflue Drosophila melanogaster, ved hjælp af en i Vivo fagocytose Assay

In all animals, innate immunity provides an immediate and robust defense against a broad spectrum of pathogens. Humoral and cellular immune responses are ...

Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA

Højeffektiv Transfection af primær makrofager med in vitro transkriberet mRNA

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern ...

Blocking Lymph Flow by Suturing Afferent Lymphatic Vessels in Mice

Blokering Lymfeknuder Flow ved suturering afferent lymfekar i mus

Lymphatic vessels are critical in maintaining tissue fluid balance and optimizing immune protection by transporting antigens, cytokines, and cells to ...