Name: assessing cellular stress and inflammation in discrete oxytocin-secreting brain nuclei in the neonatal rat before and after first colostrum feeding
Uploaded: 2018-11-14T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Cellular Stress and Inflammation in Discrete Oxytocin-secreting Brain Nuclei in the Neonatal Rat Before and After First Colostrum Feeding at JoVE.co

Die Autoren danken für ihre Unterstützung bei der Vorbereitung dieses Protokolls Manon Ranger und Alexandra Schulz.

Diese Studie wurde von der institutionellen Animal Care und Nutzung Ausschüsse an der Columbia University und der New York State Psychiatric Institute genehmigt.
(1) Gewebe-Vorbereitung
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	<li>Hietaniemi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiles+in+fetal+and+neonatal+rat+offspring+of+energy-restricted+dams.">Gene expression profiles in fetal and neonatal rat offspring of energy-restricted dams.</a> Journal of Nutrigenetics and Nutrigenomics. 2 (4-5), 173-183 (2009).</li><li>Okabe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogenous+glycine+receptor+expression+in+cortical+plate+neurons+and+Cajal-Retzius+cells+of+neonatal+rat+cerebral+cortex.">Homogenous glycine receptor expression in cortical plate neurons and Cajal-Retzius cells of neonatal rat cerebral cortex.</a> Neuroscience. 123 (3), 715-724 (2004).</li><li>Mailleux, P., Takazawa, K., Erneux, C., Vanderhaeghen, J. 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Eine Technik zur Mikrodissektion von diskreten, OTR-reiche Gehirn Kerne im neonatalen Rattengehirn wird in diesem Papier präsentiert. Es ist bekannt, dass Neuronen hoch, sogar innerhalb von gut charakterisierten Kerne im Gehirn spezialisiert sind. Diese hoch reproduzierbare Herangehensweise an bestimmte OTR-reiche Kerne isolieren kann robuste Hypothesentests. Verwendung von automatisierten Western blotting, waren die Konsistenz und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse weiter verbessert. Während eine Einschränkung dieser ...

Im Gegensatz zu unserem Verständnis der frühen Entwicklung des Gehirns im Laufe von Tagen bis Wochen nach der Geburt auftreten, ist relativ wenig über die Vielzahl von dynamischen Veränderungen in den ersten Stunden des Lebens in Ratten bekannt. Eine zentrale Herausforderung wurde die geringe Größe des Gehirns neonatalen Ratte und eine Voraussetzung für High-Tech-Werkzeuge, diskrete Hirnregionen oder einzelne Zellen zu isolieren. Studien beurteilen oft gen Transkription und keine Übersetzung1,2, die kein festes Verständnis der funktionalen Ebenen der aktivierten Signalmoleküle geben. Andere untersuchen Ausdruck verwenden Immunohistochemistry, Referenz Hirnregionen, die für die Quantifizierung der Ausdruck Level3nicht zulässt. Keine Studie bis heute hat die Aktivierung der Signalwege verbunden mit Ratten erste Colostrum ernähren sich in diskreten Hirnregionen, die erfordert schnelle Isolierung und Opfer und Messung der Proteinexpression und Protein-Phosphorylierung mit westlichen untersucht beflecken. Während auf älteren und größeren Gehirn Gehirn Mikrodissektion durchgeführt wird, haben wir keinen Verweis durchführen einen Single-Cell Gehirn Schlag in einem P0 Gehirn identifiziert. Dieser Beitrag stellt ein Protokoll für die Isolierung von eingeschränkter Hirnregionen Neugeborenen mit einer relativ Low-Tech-Punch-Technik und ein Western-Blot-Verfahren zur Proteinexpression in relativ kleinen Proben zu messen. Dieses Protokoll möglicherweise geeignet für Forschungsfragen, die die Beurteilung der Proteinexpression und post-translationalen Modifikationen erfordern (z. B.., Phosphorylierung) in relativ begrenzten Regionen kleine Gehirne aller Arten, sofern die Benutzer kann die Hirnregion des Interesses mit Atlas und identifizierbaren Wahrzeichen optisch identifizieren.
Diese Technik wurde entwickelt, um Veränderungen im Gehirn durch die Neugeborenen Ratten erste Kolostrum zu füttern, die ist reich an Oxytocin (OT) zu verstehen. OT ist seit langem bekannt für seine Fähigkeit, Milch Milchspendereflex und uterine Kontraktion zu stimulieren. OT ist jedoch jetzt bekannt, um eine Vielzahl von Rollen spielen bei der Regulation vieler Körperfunktionen und Verhaltensweisen4. Z. B. OT wendet sich gegen Stress und Entzündungen in Verbindung mit adaptive affiliative Verhaltensweisen5, verzögert die Magenentleerung und verlangsamt die Darmpassage. OT-Rezeptoren (OTR) wurden im enterischen Neuronen und Darmepithel6,7,8nachgewiesen. Die Magen-Darm-Wirkungen der OT sind besonders wichtig für das Kind während der frühen postnatalen Periode. Zum Beispiel stillen ist verbunden mit der Lieferung von erheblichen Mengen von OT zu den Neugeborenen Darm9,10, und Daten zeigen, dass die OTR während die Milch, die Periode8Spanferkel im Zwölffingerdarm Zotten stark überexprimiert ist.
In-vitro- Experimente mit einer Darm-Zelllinie haben auf zellulärer Ebene unter Beweis gestellt, dass Oxytocin moduliert wichtiger Moleküle in den Stress Weg11,12 -Signalisierung und spielt eine regulierende Rolle in der Übersetzung von Proteinen 12. diese Studien deuten darauf hin, dass Bestandteile der Milch, einschließlich exogener Oxytocin von der Mutter in unfolded Protein Response beim Neugeborenen zu zellulären Stresses13wichtig sind.
In Vivo und ex Vivo -Studien haben gezeigt, dass Kolostrum OT die zellulären Stress Response, Entzündung und Autophagie Marker in Neugeborene Ratte Darmzotten moduliert. Neugeborenen Enterozyten erleiden erhebliche zellulären Stresses auf ihrer luminalen Seite wenn Darm Microbiota gleichzeitig von der Mutter in Kolostrum14,15 und zahlreichen Proteinen, einschließlich der Hormone wie OT9 ausgesetzt ist , 10 , 16.
Die Auswirkungen der OT auf das Gehirn wurden studierte17. Die OT Signalisierung Mechanismen im Darm während der frühen postnatalen Periode nachgewiesen wurden jedoch nicht im Gehirn untersucht. In diesem Papier wird eine Methode zur Isolierung von diskreten Gehirn Kerne in der neonatalen Ratte Hirnstamm und Hypothalamus mit Elektrophorese verwendet, isolierte Hirnregionen zu profilieren. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, den Zustand der Zelle signalisieren in Hirnareale so nah wie möglich an Geburt, vor und nach der ersten Milch saugen, im Hirngewebe mit dem niedrigsten Glia/neuronale Index zu erfassen. Die Gründe für die Entwicklung dieser Technik ist, dass es für die schnelle Lokalisierung der eingeschränkt, mikroskopische Gehirnregionen bei neugeborenen Welpen mit einer homogeneren Sammlung von Neuronen für ex-Vivo -Studien mit einer automatisierten Western blotting Methodik, bietet sehr konsistente Ergebnisse auf relativ kleine seziert Proben. Ein Manko der vorherige Arbeit beinhaltet mehr Brutto Dissektion (Gehirnscheiben oder ganze Gehirn) und ältere Tiere18,19. Die Gehirne von jungen Welpen sind unglaublich dynamisch, mit Wellen von Gliazellen Differenzierung nach der Geburt. Um Veränderungen im Gehirn beeinflusst durch der Welpen erste Fütterung zu studieren, ist das Studium beschränkt neuronalen Kerne mit reproduzierbaren Dissektion notwendig.
Milch-Feed wird in der Regel für ihre Ernährungs- und immunologische Auswirkungen auf Gesundheit oder gen-Ausdruck (z. B. im Enterozyten20,21), analysiert, während seine Wirkung auf Hirnareale während der Entwicklung des Gehirns ist kaum untersucht. Die Wirkung der Milch Transit im Darm auf die Gehirnfunktion wurde in Anlehnung an Darm Cholecystokinin Rezeptoren vagalen Relais Hirnstamm Kerne, aber nicht auf intrazelluläre Signal-Wege22analysiert. Gibt es eine umfangreiche Literatur auf das sich entwickelnde Gehirn Neugeborene Anfälligkeit für Unterernährung der Mütter während der Schwangerschaft23, aber der Stress und Entzündungen Signale werden nicht angesprochen. Die aktuelle Methode nutzt vor allem ein Phänomen bei Tag Null Ratte Neugeborenen, das Blut geboren Kolostrum Reize von vagalen Relais des viszeralen Reize isoliert. Dies ist die so genannte Hypo-Reaktionsfähigkeit Stressphase geprägt von unreifen Nucleus Gowersbündel Solitarius (NTS)-Hypothalamus Schaltung unmittelbar nach der Geburt24,25 , die NTS, paraventrikulären Nukleus (PVN), einschränkt und supraoptischen Kern (Sohn) Signale auf Blut geboren Reize.
Diese Methode ist nützlich für die Analyse von mehreren Signalwege und relativ auf neuronalen Zellen beschränkt, sofern Hirngewebe bei postnatalen Tag-0 bei Ratten geerntet wird, neben ob Mütter in Frage gestellt haben, indem Sie jede Art von Behandlung während der Schwangerschaft. Würfe können für die Wirkungen von Kolostrum feed versus Pre füttern Signalisierung analysiert werden. Beim Vergleich von Signalen zwischen den Hirnarealen mit Armen im Vergleich zu reiche Proteinausbeute ermöglicht diese Methode in der Kapillare Bestimmung des Gesamt-Protein der Polypeptid-Bands in Kapillaren, die parallel zur immun-Quantifizierung der Protein-Antigene. Diese Methode ermöglicht den quantitativen Vergleich, mit willkürlichen Maßeinheiten, Ergebnisse, die durch die gleichen Antikörper ohne quantitative Standardkurven und unter Bezugnahme auf Gesamt-Protein pro Kapillare. Vergleich der Ergebnisse von verschiedenen Antikörpern ist möglich nur mit quantitativen standard Kurven.
Diese Methode erlaubt für die Beurteilung der bidirektionalen Signaltechnik zwischen Darm und Gehirn und dass Funktion in beiden Organen26auswirken kann. Die Zuordnung zwischen Oxytocin und Nahrungsaufnahme, die in den letzten Jahren27ausführlich studiert hat, unterstützt einen Zusammenhang zwischen erhöhten Oxytocin Signal- und Nährstoffverfügbarkeit. Diese Studien auch unterstützen das Converse-Konzept diese Energie, die Defizite mit Reduzierung des Hypothalamus Oxytocin Signalisierung gekoppelt sind.
Frühere Studien über die Wirkung von OT auf Aktivität des Gehirns gezeigt, dass induzierte Darm Entzündung cFos Transkription im Hypothalamus PVN, Amygdala und Piriform Rinde löste die refraktär gegenüber Vagotomie28war. Systemische Infusion von OT mit Sekretin sank jedoch die Gehirn cFos Reaktion provoziert entzündliche Reaktion in der Darm-28. Dies suggeriert, dass die Wirkung von exogenen OT durch Strecken außer vagalen Relais, möglicherweise durch Blut übertragbare Signalmoleküle, durchgeführt durch die Area Postrema6,29durchgeführt wurde.
In dieser Studie wurden die zellulären Stresses Signalwege, die zuvor im Darm beobachtet haben im Gehirn bewertet. Die Hypothese war, dass Milchbestandteile können zu schützen oder die Wirkung von Entzündungen im Darm Durchlässigkeit für mikrobielle und andere Metaboliten zu verschieben, und wiederum, die Auswirkungen auf die Gehirnfunktion. Die klare antagonistischen Unterschiede in der IkB versus BiP Signalisierung gefunden in Zotten, vor und nach dem Grundieren von Kolostrum13, vorgeschlagen, dass die Gehirne von Neugeborenen, noch in der Entwicklung, diese Signale Kolostrum-induzierte Darm spüren können.
Signalisierung Protein-Marker verwendet in früheren Darm-Experimente, die mit endoplasmatische Retikulum Stress verbunden sind, wurden gemessen. Dazu gehören das ER Chaperon BiP, Übersetzung Einleitung Faktor eIF2a (dient als eine Stress-Reaktion Integrator30), eIF2a-Kinase p-PKR, und zwei Entzündung-Signalisierung Proteine (NF-kB und die IkB-Hemmer).
Sechs Regionen des Gehirns aufgrund ihrer Fähigkeit bei Erwachsenen absondern oder reagieren auf OT wurden ausgewählt. NTS, befindet sich in der oberen Medulla, ist das erste Relais der viszeralen Eingabe und erhält direkte Signalisierung von vagalen sensorischen Neuronen im Darm31 und möglicherweise Blut geboren Zytokine, Toxine und Hormone über die angrenzenden Bereich Postrema32. Der PVN supraoptischen Kern (Sohn), Striatum Kerne (STR), Großhirnrinde (CX) und mediale präoptischen Kern (MPO) erhalten aus dem Bauch heraus über die NTS-Signalisierung.
Ergebnisse zeigten, dass die zellulären Stress-Reaktion während der unmittelbaren postnatalen vor Kolostrum Grundierung und unmittelbar nach der ersten Fütterung in NTS im Vergleich zum PVN und Sohn unterscheidet. Signalisierung im CX, unterschieden sich STR und MPO PVN und Sohn, sowie. Die unterschiedlichen Schutzfunktionen der zuvor gezeigten Zelle Stress und Entzündungen im Darm zu modulieren OT sind wahrscheinlich durch einige Bereiche des Gehirns spürte. Kollektiv, zeigen die Daten, dass auf zellulärer Ebene, während der ersten Stunden nach der Geburt, das Gehirn zu den metabolischen Stress mit Nährstoff-Insuffizienz reagiert. Die Daten zeigen auch, dass das Ausmaß und die Richtung der modulierenden Wirkungen der feed Kolostrum Region-abhängig sind und in einigen Regionen sie OT Effekte im Darm zuvor gezeigten spiegeln.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bradford solution</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein lysis kit</td>
			<td>Protein simple</td>
			<td>CBS403</td>
			<td>Bicine/CHAPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WES kits</td>
			<td>Protein simple</td>
			<td>WES-Mouse 12-230 master kit (PS-MK15), WES-Rabbit 12-230 master kit (PS-MK14), WES 12-230 kDa total Protein master kit (PS-TP07)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse IgG HRP conjugate</td>
			<td>Protein simple</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-phospho-eIF2a</td>
			<td>Cell Signaling technology</td>
			<td>SER51, 9721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse mAb anti-PKR</td>
			<td>Cell Signaling technology</td>
			<td>2103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-phospho-PKR</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Thr451, 07-886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit mAb anti-PKR</td>
			<td>Cell Signaling technology</td>
			<td>12297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit mAb anti-GAPDH</td>
			<td>Cell Signaling technology</td>
			<td>2118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse mAb anti-phospho-IKB</td>
			<td>Cell Signaling technology</td>
			<td>9246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse mAb anti-IKB</td>
			<td>Cell Signaling technology</td>
			<td>4814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-BiP</td>
			<td>Cell Signaling technology</td>
			<td>3183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti GCN2</td>
			<td>Cell Signaling technology</td>
			<td>3302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit mAb anti-phospho-GCN2</td>
			<td>BIORBYT</td>
			<td>T899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pregnant Sprague-Dawley rats</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Punch device</td>
			<td>WellTech Rapid Core or Harris Uni-Core</td>
			<td>0.35, 0.50, 0.75, 1.0, 1.20, 1.50</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing cellular stress and inflammation in discrete oxytocin-secreting brain nuclei in the neonatal rat before and after first colostrum feeding

Das Ziel dieses Protokolls ist, Oxytocin-Rezeptoren reichen Gehirn Kerne im neonatalen Gehirn vor und nach der ersten Fütterung Kolostrum zu isolieren. Die Expression von Proteinen reagieren auf metabolischer Stress bekannt wurde im Gehirn-Kerne Isolate mit Western blotting gemessen. Dies wurde getan, um festzustellen, ob metabolischen Stress-induzierte Nährstoff Mangel im Körper neuronalen Stress ausgelöst. Wir haben bereits gezeigt, dass Nährstoff Insuffizienz bei Neugeborenen metabolischer Stress im Darm entlockt. Darüber hinaus moduliert Kolostrum Oxytocin zellulären Stress Response, Entzündung und Autophagie Marker in Neugeborene Ratte Darmzotten vor und nach ersten Feed. Signalisierung von Protein-Marker, die mit dem endoplasmatischen Retikulum Stress [ER Chaperon Immunglobulin Bindeprotein (BiP), eukaryotic Übersetzung Einleitung Faktor 2A (eIF2a), und eIF2a-Kinase Proteinkinase R (p-PKR)], sowie zwei Entzündung-Signalisierung Proteine [nuklearer Faktor κB (NF-kB) und Inhibitor κB (IkB)], wurden in Neugeborenen Gehirn Kerne gemessen [Kern des einsamen Trakt (NTS), paraventrikulären Nukleus (PVN), supra-Optik Kern (Sohn), Kortex (CX), Striatum Kerne (STR), und mediale präoptischen Kern (MPO)] vor der ersten Feed (entschärften von Kolostrum) und nach dem Start der Krankenpflege (grundiert von Kolostrum). Ausdruck des BiP/GRP78 und p-eIF2a wurden hochreguliert in ungestrichenen und herunterreguliert in grundiert NTS Gewebe. NF-κB wurde (hoch) in das Zytoplasma CX, STR und MPO beibehalten, während NF-κB niedriger und im NTS, PVN und Sohn unter beiden Bedingungen unverändert war. Die kollektiven BiP und p-eIF2 Erkenntnisse stehen im Einklang mit einer Stress-Reaktion. eIf2a war der Sohn, CX, STR und MPO durch DsRNA abhängige Kinase (p-PKR) phosphoryliert. Allerdings wurde in der NTS (und in geringerem Maße in PVN), eIf2a von einem anderen Kinase, allgemeine Kontrolle-Nonderepressible-2-Kinase (GCN2) phosphoryliert. Die Stress-modulierende Mechanismen zuvor beobachtet in Neugeborenen Darm Enterozyten erscheinen in einigen OTR-reiche Gehirnregionen gespiegelt werden. Die NTS und PVN kann einen unterschiedlichen Phosphorylierung-Mechanismus (unter Nährstoffmangel) aus anderen Regionen zu nutzen und refraktär gegenüber den Auswirkungen der Nährstoff-Insuffizienz. Diese Daten zufolge Kollektiv Gehirn Reaktionen auf Nährstoff-Insuffizienz Stress durch Signalisierung von Kolostrum grundiert Enterozyten ausgeglichen sind.

Die repräsentative Bands Immunoreactivity bezogen auf Gesamt-Protein zeigen, dass es Gehirn Kerne mit sehr niedrigen geschlagenem Eiweiß. Dies erfordert die Verwendung der automatisierten Western-Blot-Technik, die sehr empfindlich im Vergleich zu den kanonischen Western-Blot ist. Dieser Ansatz kann mit fortyfold weniger Protein pro Kapillare im Vergleich zu der pro-Spur in Western Blots ausgeführt werden.
Differentielle Effekte ...

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Assessing Cellular Stress and Inflammation in Discrete Oxytocin-secreting Brain Nuclei in the Neonatal Rat Before and After First Colostrum Feeding

Bewertung von zellulären Stresses und Entzündung im diskreten Oxytocin-sezernierenden Gehirn Kerne bei Neugeborenen Ratten vor und nach der ersten Fütterung Kolostrum

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Gehirn Kerne im neonatalen Rattengehirn in Verbindung mit der ersten Fütterung Kolostrum zu isolieren. Diese Technik erlaubt die Studie von Nährstoff-Insuffizienz Stress im Gehirn wie von Enterozyten Signal moduliert.

The goal of this protocol is to isolate oxytocin-receptor rich brain nuclei in the neonatal brain before and after first colostrum feeding. The expression ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im postnatalen Entwicklungsbereich zu beantworten, wie Milchsäugung die Stresssignalisierung im Gehirn beeinflusst. Diese Technik kann verwendet werden, um bestimmte Hirnbereiche während der ersten natürlichen Hungerperiode zu erfassen und sie mit den jeweiligen Bereichen kurz nach dem ersten natürlichen Kolostrumfutter zu vergleichen. Das Verstehen, wie Dassäugen die Physiologie von Verhalten und Emotion beeinflusst, ermöglicht die Verwendung eines Antagonisten an verschiedenen Rezeptoren während der Ex-vivo-Gehirngewebeanalyse.Um die Kernschläge zu erhalten, entfernen Sie die Rattenwelpen am Schwanz mit einer handgeliebten Hand. Nach der Ernte des Gehirns, legen Sie schnell das gesamte Organ in einem Polymethylmethacrylat Gehirnform bei Raumtemperatur und sofort verwenden eine neue Rasierklinge, um 500 Mikrometer dicke Scheiben des Gewebes zu machen. Legen Sie die Scheiben rostral zu kaudal in einer Petrischale, wie sie erhalten werden, um die richtige Ausrichtung der Abschnitte zu halten.Wenn das gesamte Gehirn geschnitten wurde, fügen Sie schnell künstliche zerebrale Rückenmarksflüssigkeit ohne Glukose in die Schale und inkubieren Sie die Scheiben für 60 Minuten bei 28 bis 30 Grad Celsius unter ständigem Rühren auf einem Orbitalschüttler. Verwenden Sie einen Hirnatlas und anatomische Landmarken auf jedem Gewebe, um die zu stanzten Hirnkerne zu identifizieren und die Scheibe mit den Kernen von Interesse in eine neue Petrischale unter einem Sezierendes Mikroskop zu platzieren. Nach der Visualisierung verwenden Sie ein Koringwerkzeug, um schnell vier bis sechs verschiedene Kerne auszustechen und jeden gestanzten Kern schnell in 0,06 ml eiskalten Proteinextraktionspuffer in das entsprechend gekennzeichnete Mikrozentrifugenrohr mit Proteusinhibitoren und Phosphataseinhibitoren für 60 Minuten einzutauchen.Zentrifugieren Sie am Ende der Inkubation die extrahierten Kerne in einer gekühlten Minizentrifuge und übertragen Sie mit einer Mikropipette sorgfältig 0,055 ml Überstand von jedem Rohr in das entsprechende vorgekühlte 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr auf Eis. Vor der negativen Lagerung von 20 Grad Celsius 0,012 ml Überstand aus jedem Proteinstockrohr in die entsprechende 0,5 ml vorgekühlte Röhre auf Eis für die erste Probenvorbereitung übertragen. Um die Proben für die Messung des kapillaren Proteins vorzubereiten, fügen Sie 0,003 ml Master-Mix-Reagenz aus einem Proteinlyse-Kit zu jeder der Proben in den 0,5 ml-markierten Röhrchen hinzu.Als nächstes fügen Sie 0,004 ml Master-Mix-Reagenz zu einer biotinylierten Molekulargewichtsleiterlösung in 0,016 ml entionisiertem Wasser hinzu und denaturieren die Leiter- und Proteinextraktproben in einem 95 Grad Celsius-Wärmeblock, wodurch alle Rohre nach fünf Minuten bei vier Grad Celsius gelagert werden. Für die Signalproteinanalyse 0,01 ml frisch zubereitete Luminolperoxidlösung zu den Brunnen E-1 bis E-25 einer neuen automatisierten Westernplatte, 0,01 ml sekundärem Anti-Maus-Antikörper zu den Brunnen D-2 bis D-25 hinzufügen und 0,01 ml Streptavidin-Meerrettichperoxidase vom Kit auf gut D-1 hinzufügen. Fügen Sie 0,01 ml frisch zubereiteten Primärantikörper in die Brunnen C-2 bis C-25 und 0,01 ml Antikörperverdünnungsmittel zwei Lösungen für die Bohrungen C-1 und B-1 bis B-25 hinzu.Lassen Sie die Bohrungen der Reihe F leer und füllen Sie die fünf Fächer der drei Reihen unterhalb der F-Reihe mit 0,45 ml Waschpuffer. Als nächstes drehen Sie die gekühlten Proben 30 Sekunden lang kurz und fügen Sie 0,03 ml jeder Probe zu jedem Brunnen der Reihe A hinzu, beginnend mit A-2. Dann 0,005 ml der biotinylierten Molekulargewichtsleiter zu gut A-1 hinzufügen und die Platte für die Zentrifugation bedecken.Während die Platte zentrifugiert ist, öffnen Sie eine neue Run-Datei in der automatisierten Western-Software und initiieren Sie einen molekularen Größentest. Geben Sie auf der Assay-Seite die Beispielnamen in jede Kapillare sowie die Namen der primären und sekundären Antikörper ein. Am Ende der Zentrifugation die Platte in das automatisierte Western-Instrument legen und die Abdeckung aus der Kapillarpatronenbox schälen.Nach der Zentrifugation vergessen Sie nicht, Luftblasen zu untersuchen, denn Luftblasen in der Kapillare können den elektrophoretischen Strom blockieren und die ganze Runde ausfallen lassen. Setzen Sie die Patrone in die vorgesehene Position innerhalb des Geräts ein und schließen Sie die Tür. Klicken Sie auf Start.Wenn Sie den Typ des Testes dazu auffragen, geben Sie den Namen des Experiments in das entsprechende Textfeld ein, und klicken Sie auf "OKAY". Wenn Sie vom aktivierten Ausführungsdatum und der ID-Nummer in der Ausführungsdatei aufgefordert werden, notieren Sie sich die Zeit, zu der die Ausführung endet. Entsorgen Sie am Ende des Laufs die Kapillarpatrone in die Schärfeentsorgung und die Platte in die Entsorgung biogefährlicher Stoffe.Nach der Elektrophorese-Trennung, überprüfen Sie die Run-Dateien auf ImmunreaktivitätSpitzen von Antigenen bei 40 bis 43 Kilodalton, die für phosphorylierte eukaryotische Translation Initiationsfaktor 2A stehen. Wenn Molekulargewichtsspitzen dieser Größe fehlen, klicken Sie mit der rechten Maustaste unter die Kurve, und wählen Sie Molekulargewicht hinzufügen, um sicherzustellen, dass die Größen und beliebigen Größen unterhalb der Kurve aufgezeichnet werden. Innerhalb der unprimeds Gewebeproben sind die bindungden Aminoglobulinproteinspiegel in den Kernen der Einsittbahn im Vergleich zu allen anderen Regionen signifikant höher.Die Primierung des Darmgewebes mit Kolostrum verringert den bindungden Aminoglobulin-Proteinspiegel in den Kernen der Einsit-Track und hat keinen Einfluss auf paraventrikuläre Kerne und superoptische Kerne. Umgekehrt erhöht die Grundierung den Bindungs-Aminoglobulin-Proteinspiegel innerhalb der Kortex, der Striationskerne und der medialen präoptischen Kerne relativ zum nicht grundierten Gewebe, was bedeutet, dass die bindungden Aminoglobulin-Proteinspiegel in den verschiedenen getesteten Hirnkernen unterschiedlich auf Darmgrundierung reagieren und es noch kein nachgewiesenes Übersprechen zwischen den verschiedenen getesteten Kernen gibt. Eukaryotische Translation Initiationfaktor 2A und phosphorylierte eukaryotische Translation InitiationFaktor 2A Ebenen sind in der unprimed Zustand im Vergleich zu anderen Kernen erhöht.Nach der Grundierung werden die Konzentrationen sowohl des eukaryotischen Translationsinitiationsfaktors 2A als auch des phosphorylierten eukaryotischen Translationinitiationsfaktors 2A im Vergleich zu Denkernen der einsamen Spur im Vergleich zu nicht grundiertem Gewebe reduziert. In allen anderen getesteten Kernen erhöht die Grundierung den Eukaryotischen Translationinitiationsfaktor 2A und den phosphorylierten eukaryotischen Translationsinitiationsfaktor 2A im Verhältnis zu nicht grundiertem Gewebe. Jedoch, Ebenen der phosphorylierten Proteinkinase-Rezeptor sind niedrig in unprimed Proben relativ zu grundierten Proben in Kernen der einsamen Spur, stark darauf hindeutet, dass eine andere Kinase an der Phosphorylierung der eukaryotischen Translation Initiationfaktor 2A beteiligt ist.Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der postnatalen Entwicklung, um die Signalwege zu erforschen, die an Gewebewachstum und -differenzierung beteiligt sind und ob sie durch Säugen beeinflusst oder unabhängig vom Säugen sind. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit flüchtigen Reduktionsmitteln wie z. B. Dithiothreitol gefährlich sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen wie die Vorbereitung in der chemischen Haube sollten bei der Vorbereitung dieses Verfahrens immer getroffen werden.

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