Name: assessing cellular stress and inflammation in discrete oxytocin-secreting brain nuclei in the neonatal rat before and after first colostrum feeding
Uploaded: 2018-11-14T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Cellular Stress and Inflammation in Discrete Oxytocin-secreting Brain Nuclei in the Neonatal Rat Before and After First Colostrum Feeding at JoVE.co

Gli autori ringraziano Manon Ranger e Alexandra Schulz per la loro assistenza nella preparazione di questo protocollo.

Questo studio è stato approvato dalle commissioni di utilizzo alla Columbia University e l'istituto psichiatrico dello stato di New York e istituzionali Animal Care.
1. tessuto preparazione
<ol><li>Ordine di ratte gravide temporizzate dal fornitore.</li>
	<li>Seguire ratti incinti temporizzati osservando loro addomi crescente nelle settimane dopo il loro arrivo e successivamente cercando cuccioli alla data di consegna prevista controllando la gabbia ogni 2 h fino a consegna inizia.</li>
	<l...

<ol>
	<li>Hietaniemi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiles+in+fetal+and+neonatal+rat+offspring+of+energy-restricted+dams.">Gene expression profiles in fetal and neonatal rat offspring of energy-restricted dams.</a> Journal of Nutrigenetics and Nutrigenomics. 2 (4-5), 173-183 (2009).</li><li>Okabe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogenous+glycine+receptor+expression+in+cortical+plate+neurons+and+Cajal-Retzius+cells+of+neonatal+rat+cerebral+cortex.">Homogenous glycine receptor expression in cortical plate neurons and Cajal-Retzius cells of neonatal rat cerebral cortex.</a> Neuroscience. 123 (3), 715-724 (2004).</li><li>Mailleux, P., Takazawa, K., Erneux, C., Vanderhaeghen, J. 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Una tecnica per microdissezione di discreti, nuclei del cervello di OTR-ricchi nel cervello del ratto neonatale è presentata in questa carta. È riconosciuto bene che i neuroni sono altamente specializzati, anche all'interno dei nuclei ben caratterizzati nel cervello. Questo approccio altamente riproducibile per isolare specifici nuclei di OTR-ricchi permette test di ipotesi robusto. Mediante Western blotting automatizzato, la coerenza e la riproducibilità dei risultati sono stati ulteriormente migliorate. Mentre una l...

In contrasto con la nostra comprensione dello sviluppo iniziale del cervello che si verificano nel corso dei giorni a settimane dopo il parto, relativamente piccolo è conosciuto circa la miriade di cambiamenti dinamici che si verificano nelle prime ore di vita in ratti. Delle sfide principali è stata la piccola dimensione del cervello del ratto neonatale e un requisito per strumenti ad alta tecnologia isolare regioni discrete del cervello o singole cellule. Studi valutano spesso gene trascrizione e traduzione di non1,2, che non dà una solida comprensione dei livelli funzionali di molecole di segnalazione attivate. Altri esaminare l'espressione usando immunohistochemistry a regioni del cervello di riferimento, che non consente per la quantificazione dell'espressione livelli3. Nessuno studio finora ha esaminato l'attivazione di segnalazione vie connesse con il colostro primo dei ratti alimentare nelle regioni discrete del cervello, che richiede isolamento rapido e sacrificio e misura di espressione della proteina e fosforilazione della proteina mediante Western macchiare. Mentre il cervello microdissection viene eseguita su più vecchi e più grandi cervelli, non abbiamo individuato un riferimento eseguendo un pugno di cervello non-singolo-cellula in un cervello di P0. Questa carta presenta un protocollo per l'isolamento di ristrette regioni del cervello neonatale utilizzando una tecnica di pugno relativamente low-tech e un Western blotting procedura per misurare l'espressione di proteine in campioni relativamente piccoli. Questo protocollo può essere adatto per domande di ricerca che richiedono la valutazione dell'espressione della proteina e modificazioni post-traduzionali (ad es., fosforilazione) in regioni relativamente ristrette di piccoli cervelli di qualsiasi specie, a condizione che il utente può identificare visivamente la regione del cervello di interesse con un Atlante e identificabili luoghi d'interesse.
Questa tecnica è stata sviluppata per comprendere i cambiamenti che si verificano nel cervello a seguito di colostro primo dei ratti neonatali, feed, che è ricca di ossitocina (OT). OT è stato a lungo conosciuto per la sua capacità di stimolare la contrazione uterina e di delusione di latte. Tuttavia, OT ora è conosciuto per svolgere una vasta gamma di ruoli nella regolazione di molte funzioni corporee e comportamenti4. Ad esempio, OT si oppone lo stress e l'infiammazione in combinazione con comportamenti affiliativi adattivi5, ritarda lo svuotamento gastrico e rallenta il transito intestinale. Sono stati identificati recettori OT (OTR) in neuroni enterici ed epitelio intestinale6,7,8. Gli effetti gastrointestinali di OT sono particolarmente importanti per il bambino durante il primo periodo postnatale. Per esempio, l'allattamento al seno è associato con la consegna di quantitativi notevoli di OT per l'intestino neonatale9,10, e i dati mostrano che l'OTR è pesantemente overexpressed in villi perfusioni durante il latte lattante periodo8.
Esperimenti in vitro utilizzando una linea cellulare di intestino hanno dimostrato a livello cellulare che l'ossitocina modula importanti molecole nello stress signaling pathway11,12 e svolge un ruolo regolatore nella traduzione delle proteine 12. questi studi suggeriscono che i componenti del latte, tra cui l'ossitocina esogena dalla madre, sono importanti in unfolded protein response in neonati per ridurre stress cellulare13.
Studi in vivo ed ex vivo hanno dimostrato che il colostro OT modula i marcatori di autofagia, infiammazione e la risposta di stress cellulare nei villi dell'intestino di ratto neonato. Enterociti neonati soffrono stress cellulare sostanziale sul loro lato luminal quando l'intestino è esposto simultaneamente a microbiota dalla madre nel colostro14,15 e numerose proteine, tra cui gli ormoni quali OT9 , 10 , 16.
Gli effetti di OT sul cervello sono stati studiati17. Tuttavia, i meccanismi di segnalazione OT ha dimostrati nell'intestino durante il periodo postnatale precoce non sono stati studiati nel cervello. In questa carta, un metodo per isolare nuclei discrete del cervello nel tronco cerebrale neonatale del ratto e ipotalamo usando l'elettroforesi viene utilizzato per profilare regioni isolate del cervello. L'obiettivo generale di questo metodo è quello di acquisire lo stato di segnalazione delle cellule nelle aree del cervello più vicino possibile alla nascita, prima e dopo il primo latte lattante, nel tessuto cerebrale con l'indice più basso di neuroni e glia. La spiegazione razionale per lo sviluppo di questa tecnica è che permette l'isolamento rapido delle regioni limitate, microscopico cervello neonatale cuccioli con una collezione più omogenea dei neuroni per studi ex vivo utilizzando un automatizzato macchiarsi occidentale metodologia, offrendo risultati altamente coerenti su relativamente piccoli campioni sezionati. Una lacuna del precedente lavoro comprende più di dissezione lorda (fettine di cervello o cervello intero) e più vecchi animali18,19. I cervelli di giovani cuccioli sono incredibilmente dinamici, caratterizzato da onde di differenziazione gliale dopo la nascita. Al fine di studiare i cambiamenti del cervello influenzato da cuccioli prima alimentazione, studiando con restrizioni nuclei neuronali con dissezione riproducibile è necessario.
Latte foraggio solitamente viene analizzato per il suo impatto immunologico e nutrizionale sull'espressione del gene o di salute (ad esempio, in enterociti20,21), mentre il suo effetto sulle aree del cervello durante lo sviluppo cerebrale è raramente studiato. In riferimento a gut colecistochinina recettori vagali relè a nuclei del tronco cerebrale, ma non a intracellulare segnalazione vie22è stato analizzato l'effetto del transito di latte nell'intestino sulla funzione del cervello. C'è una vasta letteratura sulla vulnerabilità del cervello in via di sviluppo neonato a malnutrizione delle madri durante la gravidanza23, ma non vengono affrontati i segnali di sforzo e l'infiammazione. D'importanza, il metodo corrente si avvale di un fenomeno nei neonati di ratto zero-day che gli stimoli di colostro anima-nati dal relè vagale di stimoli viscerali di isola. Questo è il periodo di IPO-reattività del cosiddetto stress caratterizzato da nucleo immaturo tractus solitarius (NTS)-ipotalamico circuito immediatamente dopo la nascita24,25 che limita il NTS, nucleo paraventricolare (PVN), e Nucleo Sopraottico (figlio) segnali agli stimoli di anima-nati.
Questo metodo è utile per l'analisi delle molteplici vie di segnalazione e relativamente limitato di cellule neuronali, purché il tessuto cerebrale è raccolto al giorno-0 postnatale nei ratti, oltre a se le madri sono state contestate o non di qualsiasi tipo di trattamento durante la gravidanza. Cucciolate possono essere analizzati per gli effetti del colostro alimentazione contro pre-alimentazione segnalazione. Quando si confrontano i segnali tra aree del cervello con poveri contro resa ricca di proteine, questo metodo consente la determinazione nel capillare delle proteine totali delle bande del polipeptide in capillari corrono paralleli immunitario-quantificazione di antigeni della proteina. Questo metodo consente il confronto quantitativo, usando unità arbitrarie, dei risultati ottenuti dall'anticorpo stesso senza curve standard quantitativi e con riferimento alle proteine totali a capillare. Confrontando i risultati ottenuti dagli anticorpi differenti è possibile solo utilizzando le curve standard quantitative.
Questo metodo ha permesso per la valutazione della segnalazione che si verificano tra l'intestino e il cervello e che possa avere un impatto funzione in entrambi gli organi26bidirezionale. L'associazione fra ingestione di cibo e l'ossitocina, che è stato ampiamente studiato in anni recenti27, sostiene un collegamento tra segnalazione aumentata l'ossitocina e la disponibilità di nutrienti. Questi studi inoltre sostengono il concetto di converse che i deficit sono accoppiati con le riduzioni di ossitocina ipotalamico segnalazione l'energia.
Precedenti studi sull'effetto di OT su attività di cervello hanno dimostrato che l'infiammazione intestinale indotta ha suscitato cFos trascrizione nella corteccia PVN, amigdala e piriform ipotalamica che era refrattaria a vagotomia28. Tuttavia, l'infusione sistemica di OT con secretina è diminuito la risposta di cFos cervello alla reazione infiammatoria provocata nell' intestino28. Ciò ha suggerito che l'effetto di OT esogeno è stato effettuato da percorsi diversi da relè vagale, possibilmente via ematica molecole di segnalazione effettuate attraverso l'area postrema6,29.
In questo studio, le vie di segnalazione di stress cellulare che precedentemente hanno osservato nell'intestino sono state valutate nel cervello. L'ipotesi era che componenti di latte possono proteggere o rimandare l'effetto di infiammazione su permeabilità dell'intestino ai metaboliti microbici e altri, e a sua volta, gli effetti sulla funzione cerebrale. Le differenze chiaro antagonistiche di IkB contro BiP di segnalazione trovato nei villi, prima e dopo l'innesco di colostro13, ha suggerito che i cervelli dei neonati, ancora in fase di sviluppo, possono percepire questi segnali indotti da colostro gut.
Segnalazione marcatori proteici utilizzati in precedenti esperimenti di intestino che sono associati con lo stress del reticolo endoplasmatico sono stati misurati. Essi comprendono il chaperone ER BiP, traduzione iniziazione fattore eIF2a (che serve come una risposta di stress integrator30), eIF2a chinasi p-PKR e due proteine di infiammazione-segnalazione (NF-kB e suo inibitore, IkB).
Sei regioni cerebrali basate sulla loro capacità negli adulti a secernere o rispondere agli OT sono stati scelti. La NTS, situata presso il midollo superiore, è il primo relè dell'input viscerale e riceve la segnalazione diretta dai neuroni sensoriali vagali nell'intestino31 e citochine possibilmente anima-nati, tossine e ormoni attraverso l' adiacente zona-postrema32. PVN, Nucleo Sopraottico (figlio), nuclei del corpo striato (STR), corteccia cerebrale (CX) e nucleo mediale preottica (MPO) ricevere segnalazione dall'intestino tramite NTS.
Risultati hanno mostrato che la risposta cellulare allo stress durante il periodo postnatale immediato prima dell'innesco di colostro e immediatamente dopo la prima alimentazione è diverso in NTS rispetto al PVN e figlio. Segnalazione in CX, STR e MPO differiva da quella del PVN e figlio, pure. Le funzioni di protezione distinte di OT indicato precedentemente per modulare lo sforzo delle cellule e l'infiammazione nell'intestino sono probabilmente percepite da alcune zone del cervello. Collettivamente, i dati indicano che a livello cellulare, durante le prime ore dopo la nascita, il cervello risponde allo stress metabolici connessi con insufficienza dei nutrienti. I dati mostrano anche che la misura e la direzione degli effetti di modulazione del colostro alimentazione dipendono dalla regione e che in alcune regioni, essi rispecchiano gli effetti OT illustrati in precedenza nell'intestino.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bradford solution</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein lysis kit</td>
			<td>Protein simple</td>
			<td>CBS403</td>
			<td>Bicine/CHAPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WES kits</td>
			<td>Protein simple</td>
			<td>WES-Mouse 12-230 master kit (PS-MK15), WES-Rabbit 12-230 master kit (PS-MK14), WES 12-230 kDa total Protein master kit (PS-TP07)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse IgG HRP conjugate</td>
			<td>Protein simple</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-phospho-eIF2a</td>
			<td>Cell Signaling technology</td>
			<td>SER51, 9721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse mAb anti-PKR</td>
			<td>Cell Signaling technology</td>
			<td>2103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-phospho-PKR</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Thr451, 07-886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit mAb anti-PKR</td>
			<td>Cell Signaling technology</td>
			<td>12297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit mAb anti-GAPDH</td>
			<td>Cell Signaling technology</td>
			<td>2118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse mAb anti-phospho-IKB</td>
			<td>Cell Signaling technology</td>
			<td>9246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse mAb anti-IKB</td>
			<td>Cell Signaling technology</td>
			<td>4814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-BiP</td>
			<td>Cell Signaling technology</td>
			<td>3183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti GCN2</td>
			<td>Cell Signaling technology</td>
			<td>3302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit mAb anti-phospho-GCN2</td>
			<td>BIORBYT</td>
			<td>T899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pregnant Sprague-Dawley rats</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Punch device</td>
			<td>WellTech Rapid Core or Harris Uni-Core</td>
			<td>0.35, 0.50, 0.75, 1.0, 1.20, 1.50</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing cellular stress and inflammation in discrete oxytocin-secreting brain nuclei in the neonatal rat before and after first colostrum feeding

L'obiettivo del presente protocollo è quello di isolare i nuclei del cervello ricco di ossitocina-recettore nel cervello neonatale prima e dopo la prima poppata di colostro. L'espressione di proteine note per rispondere agli stress metabolico è stato misurato in cervello-nuclei isolati mediante Western blotting. Questo è stato fatto per valutare se insufficienza metabolica indotta da stress in nutrienti nel corpo innescato lo stress di un neurone. Precedentemente abbiamo dimostrato che l'insufficienza dei nutrienti in neonati suscita lo sforzo metabolico nell'intestino. Inoltre, l'ossitocina colostro modula indicatori di risposta, l'infiammazione e l'autofagia stress cellulare nei villi dell'intestino di ratto neonato prima e dopo la prima poppata. Indicatori di proteina connessi con lo stress del reticolo endoplasmatico di segnalazione [ER chaperone immunoglobulina proteina (BiP), traduzione negli eucarioti iniziazione fattore 2A (eIF2a) ed eIF2a chinasi della chinasi di proteina R (p-PKR)], così come due infiammazione-segnalazione proteine [fattore nucleare-KB (NF-kB) e inibitore κB (IkB)], sono stati misurati nei nuclei del cervello neonato [nucleo del tratto solitario (NTS), nucleo paraventricolare (PVN), nucleo supra-ottica (figlio), corteccia (CX), nuclei del corpo striato (STR), e nucleo mediale preottica (MPO)] prima del primo feed (disinnestato da colostro) e dopo l'inizio della professione infermieristica (innescato da colostro). Espressione di BiP/GRP78 e p-eIF2a erano sovraregolati in unprimed e downregulated nel tessuto NTS innescato. NF-kB è stata mantenuta (alta) nel citoplasma CX, STR e MPO, considerando che NF-kB era più bassa e identicamente in NTS, PVN ed il figlio in entrambe le condizioni. Il collettivo BiP e p-eIF2 risultati sono coerenti con una risposta allo stress. eIf2a è stato fosforilati da chinasi dsRNA (p-PKR) nel figlio, CX, STR e MPO. Tuttavia, in NTS (e in misura minore nel PVN), eIf2a è stato fosforilato da un'altra chinasi, chinasi di nonderepressible-2 controllo generale (GCN2). I meccanismi di stress-modulanti precedentemente osservati negli enterociti neonato intestino sembrano riflettersi in alcune regioni del cervello di OTR-ricco. La NTS e PVN può utilizzare un meccanismo di fosforilazione differenti (sotto sottoalimentazione) da altre regioni ed essere refrattario all'impatto dell'insufficienza dei nutrienti. Collettivamente, questi dati suggeriscono che le risposte del cervello allo stress nutritivo insufficienza sono compensate da segnalazione da colostro-innescato enterociti.

Le bande rappresentative di immunoreactivity relativa proteina totale mostrano che ci sono nuclei di cervello con raccolto molto povera in proteine. Questo richiede l'utilizzo della tecnica automatizzata Western blot, che è altamente sensibile rispetto al canonico Western blot. Questo approccio può essere eseguito con fortyfold meno proteine per capillare rispetto a-corsia in Western blot.
Effetti differenziali di priming di colo...

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Assessing Cellular Stress and Inflammation in Discrete Oxytocin-secreting Brain Nuclei in the Neonatal Rat Before and After First Colostrum Feeding

Valutazione Stress cellulare e l'infiammazione nei Nuclei di cervello che secerne l'ossitocina discreti nel ratto neonatale prima e dopo la prima poppata di colostro

Qui, presentiamo un protocollo per isolare i nuclei del cervello nel cervello del ratto neonatale in concomitanza con la prima alimentazione colostro. Questa tecnica permette lo studio dello stress nutritivo insufficienza nel cervello come modulata dalla segnalazione del enterocyte.

The goal of this protocol is to isolate oxytocin-receptor rich brain nuclei in the neonatal brain before and after first colostrum feeding. The expression ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dello sviluppo post-natale sul modo in cui l'allucchiamento del latte influenza la segnalazione dello stress nel cervello. Questa tecnica può essere utilizzata per catturare specifiche aree cerebrali durante il primo periodo di fame naturale e per confrontarle con le rispettive aree poco dopo il primo mangime naturale per colostro. Comprendere come l'allucchio influenzi la fisiologia del comportamento e delle emozioni consente l'uso di un antagonista a vari recettori durante l'analisi ex-vivo del tessuto cerebrale.Per ottenere i pugni dei nuclei, rimuovere i cuccioli di ratto dalla coda con una mano guantata. Dopo aver raccolto il cervello, posizionare rapidamente l'intero organo in uno stampo cerebrale polimetilmetacrilato a temperatura ambiente e utilizzare immediatamente una nuova lama di rasoio per fare fette spesse 500 micrometri del tessuto. Posare le fette rostrali a caudal in una piastra di Petri in quanto si ottengono per mantenere il corretto orientamento delle sezioni.Quando l'intero cervello è stato sezionato, aggiungere rapidamente liquido spinale cerebrale artificiale senza glucosio al piatto e incubare le fette per 60 minuti a 28-30 gradi Celsius con agitazione costante su uno shaker orbitale. Usa un atlante cerebrale e punti di riferimento anatomici su ogni tessuto per identificare i nuclei cerebrali da colpire e posizionare la fetta con i nuclei di interesse in una nuova piastra di Petri al microscopio sezionato. Una volta visualizzato, utilizzare uno strumento di coring per punzonare rapidamente da quattro a sei nuclei diversi e immergere rapidamente ogni nucleo perforato in 0,06 ml di tampone di estrazione di proteine fredde nel tubo di microcentfuga opportunamente etichettato contenente inibitori del proteo e inibitori della fosfatasi per 60 minuti.Al termine dell'incubazione, centrifugare i nuclei estratti in una mini-centrifuga raffreddata e utilizzare una micro-pipetta per trasferire con cura 0,055 mL di supernatante da ciascun tubo nell'appropriato tubo di micro-centrifuga pre-raffreddato da 1,5 ml sul ghiaccio. Prima dello stoccaggio negativo di 20 gradi Celsius, trasferire 0,012 ml di supernatante da ogni tubo di stoccaggio proteico nel tubo pre-raffreddato da 0,5 ml appropriato sul ghiaccio per la prima preparazione del campione. Per preparare i campioni per la misurazione delle proteine capillari, aggiungere 0,003 ml di reagente master mix da un kit di lysis proteica a ciascuno dei campioni nei tubi etichettati da 0,5 ml.Successivamente, aggiungere 0,004 ml di reagente master mix a una soluzione di scala del peso molecolare biotinilata in 0,016 ml di acqua deionizzata e denaturare i campioni di scala ed estratto proteico in un blocco di calore di 95 gradi Celsius, immagazzinando tutti i tubi a quattro gradi Celsius dopo cinque minuti. Per l'analisi delle proteine del segnale, aggiungere 0,01 mL di soluzione di perossido di luminolo appena preparata ai pozzi da E-1 a E-25 di una nuova piastra occidentale automatizzata, 0,01 mL di anticorpo anti-topo secondario ai pozzi da D-2 a D-25 e aggiungere 0,01 mL di perossidasi di rafano streptavidina dal kit al pozzo D-1. Aggiungere 0,01 mL di anticorpo primario appena preparato nei pozzi da C-2 a C-25 e 0,01 mL di anticorpi diluenti due soluzioni ai pozzi da C-1 e B-1 a B-25.Lasciare vuoti i pozzali F di fila e riempire i cinque scomparti delle tre file sotto la fila F con 0,45 mL di tampone di lavaggio. Successivamente, ruotare brevemente i campioni refrigerati per 30 secondi e aggiungere 0,03 mL di ogni campione a ogni pozzo della fila A, a partire da A-2. Quindi, aggiungere 0,005 mL della scala del peso molecolare biotinilata al pozzo A-1 e coprire la piastra per la centrifugazione.Mentre la piastra è centrifugata, aprire un nuovo file di esecuzione nel software associato occidentale automatizzato e avviare un test di dimensione molecolare. Nella pagina di dosaggio, inserire i nomi dei campioni in ogni capillare e i nomi degli anticorpi primari e secondari. Al termine della centrifugazione, posizionare la piastra nello strumento occidentale automatizzato e sbucciare il coperchio dalla scatola della cartuccia capillare.Dopo la centrifugazione, non dimenticare di ispezionare le bolle d'aria, perché le bolle d'aria nel capillare possono bloccare la corrente elettroforetica e fallire l'intero round. Inserire la cartuccia nella posizione designata all'interno dello strumento e chiudere la porta. Fare clic sul pulsante Start.Quando viene richiesto il tipo di saggio, immettere il nome dell'esperimento nella casella di testo appropriata e fare clic su OK. Quando richiesto dalla data di esecuzione attivata e dal numero ID nel file di esecuzione, prendere nota dell'ora di fine dell'esecuzione. Alla fine della corsa, scartare la cartuccia capillare nello smaltimento dei taglienti e la piastra nello smaltimento dei materiali pericolosi.Dopo la separazione dell'elettroforesi, controllare i file di esecuzione per i picchi di reattività immunitaria degli antigeni a 40-43 kilodalton che stanno per fattore di iniziazione alla traduzione eucariotica fosforilato 2A. Dove mancano picchi di peso molecolare di queste dimensioni, fare clic con il pulsante destro del mouse sotto la curva e scegliere aggiungi peso molecolare al picco per garantire che le dimensioni e le quantità arbitrarie al di sotto della curva siano registrate. All'interno dei campioni di tessuto unprimeds, i livelli di proteina ammino globulina leganti nei nuclei della pista solitaria sono significativamente più alti rispetto a tutte le altre regioni.L'adescamento del tessuto intestinale con colostro diminuisce i livelli di proteina ammino globulina leganti nei nuclei della pista solitaria e non ha alcun effetto sui nuclei paraventricolari e sui nuclei super-ottici. Al contrario, l'adescamento aumenta i livelli di proteina dell'ammino globulina legante all'interno della corteccia, dei nuclei di striazione e dei nuclei preoptici mediali rispetto al tessuto non primo, il che implica che i livelli di proteina ammino globulina leganti nei vari nuclei cerebrali testati rispondono in modo diverso all'adescamento intestinale e non esiste ancora un crosstalk dimostrato tra i vari nuclei testati. Il fattore di iniziazione alla traduzione eucariotica 2A e il fattore di iniziazione alla traduzione eucariotica fosforilata 2A sono elevati nella condizione non primata rispetto ad altri nuclei.Dopo l'adescamento, i livelli sia del fattore di iniziazione della traduzione eucariotica 2A che del fattore di iniziazione alla traduzione eucariota fosforilato 2A sono ridotti rispetto ai nuclei della traccia solitaria rispetto al tessuto non primo. In tutti gli altri nuclei testati, l'adescamento aumenta i livelli del fattore di iniziazione alla traduzione eucariotica 2A e del fattore di iniziazione alla traduzione eucariota fosforilato 2A rispetto al tessuto non primo. Tuttavia, i livelli di recettore della protein chinasi fosforilata sono bassi nei campioni nonprimi rispetto ai campioni innescati nei nuclei della pista solitaria, suggerendo fortemente che un'altra chinasi sia coinvolta nella fosforilazione del fattore di iniziazione alla traduzione eucariotica 2A.Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo dello sviluppo post-natale per esplorare i percorsi di segnalazione coinvolti nella crescita e differenziazione dei tessuti e se sono influenzati o indipendenti dall'allucchio. Non dimenticare che lavorare con agenti riducenti volatili come, ad esempio, ditiothreitol, può essere pericoloso e precauzioni come la preparazione nella cappa chimica dovrebbero sempre essere prese durante la preparazione di questa procedura.

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