Name: assessing cellular stress and inflammation in discrete oxytocin-secreting brain nuclei in the neonatal rat before and after first colostrum feeding
Uploaded: 2018-11-14T14:15:00
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著者は、このプロトコルの準備に彼らの支援のマノン レンジャーとアレクサンドラ ・ シュルツをありがとうございます。

本研究は、動物介護制度とコロンビア大学、ニューヨーク州立精神医学研究所利用委員会によって承認されました。
1. ティッシュの準備
<ol><li>ベンダーからタイミング妊娠ラットを注文します。</li>
	<li>続くタイミング妊娠ラット到着後数週間で成長している腹部を観察し、その後、ケージを調べることによって出産予定日に子犬を探してすべての 2 h 配信が開始され?...

<ol>
	<li>Hietaniemi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiles+in+fetal+and+neonatal+rat+offspring+of+energy-restricted+dams.">Gene expression profiles in fetal and neonatal rat offspring of energy-restricted dams.</a> Journal of Nutrigenetics and Nutrigenomics. 2 (4-5), 173-183 (2009).</li><li>Okabe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogenous+glycine+receptor+expression+in+cortical+plate+neurons+and+Cajal-Retzius+cells+of+neonatal+rat+cerebral+cortex.">Homogenous glycine receptor expression in cortical plate neurons and Cajal-Retzius cells of neonatal rat cerebral cortex.</a> Neuroscience. 123 (3), 715-724 (2004).</li><li>Mailleux, P., Takazawa, K., Erneux, C., Vanderhaeghen, J. 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離散の顕微解剖法、新生児ラット脳における脳核 OTR は、本稿で提示されます。脳内のよ特徴付けられた核内であっても、ニューロンを専門性の高いことも認識されます。特定の OTR の豊富な核を分離するこの再現性の高い方法により、堅牢な仮説のテストします。自動ウェスタンブロッティングを使用して、一貫性と結果の再現性がさらに向上。この技法の制限のまま適度な脳パンチ変動;?...

日-週に産後のコース上に発生する初期の脳の発達の理解と対照をなして比較的少し知られている無数のラットでの生活の最初の数時間で発生する動的な変更について。重要な課題は、ラット新生仔脳と離散脳領域または単一の細胞を分離するハイテク ツールのための要件の小さなサイズをされています。研究は、遺伝子の転写と翻訳ではない1,2, 活性化シグナル伝達分子の機能レベルのしっかりした理解を与えていないしばしば評価します。他の人は表現のレベル3の定量化のため許可しない参照脳領域に免疫組織化学を使用して式を調べます。これまでの研究はラットの最初初乳の迅速単離と犠牲と蛋白質の表現、蛋白質のリン酸化を使っている西の測定を要求する離散脳のフィードに関連付けられているシグナルの活性化は検査されません。しみが付きます。古いより大きい頭脳の脳レーザーマイクロダイ セクションが実行、間ない P0 脳の非単一細胞脳パンチを実行する参照を同定しました。比較的小規模なサンプルの蛋白質の表現を測定する比較的ローテクなパンチ法とウエスタンブロット プロシージャを用いた新生児の脳の制限された領域を分離するためのプロトコルを提案する.このプロトコルは蛋白質の表現およびポスト翻訳の修正の評価を必要とする研究課題に適した可能性があります (e.g、リン酸化)、任意の種の小さな脳の比較的制限された地域で提供する、。ユーザーは、アトラスと明確な目標物興味の脳の領域を視覚的に識別できます。
この技術は、フィード、オキシトシン (OT) が豊富である新生児ラットの最初の初乳の結果として脳の変化を理解するために開発されました。OT は、ミルクの失望と子宮の収縮を刺激するために、その能力の長い知られています。しかし、OT は今多くの身体機能や動作4規制の役割の広い範囲を再生する知られています。たとえば、OT が胃排出遅延、腸の通過を遅くにストレスと適応の親和行動5と組み合わせて炎症に反対します。OT 受容体 (OTR) は、腸溶性ニューロンと腸上皮6,7,8で識別されています。OT の消化管の効果は、出生後早期の間に幼児に特に重要です。例えば、母乳は新生児の腸9,10OT の大量の配信に関連付け、データ表示、OTR 大きくにおいて過剰発現十二指腸絨毛ミルク哺乳期間8時。
そのオキシトシン シグナリング経路11,12ストレスに重要な分子を調節してタンパク質の翻訳で規制の役割を果たして、細胞レベルで実証しているの腸細胞株を用いたin vitro実験12. これらの研究は、母親からの外因性のオキシトシンを含む牛乳の成分、細胞ストレス13を減らすために新生児の小胞体ストレス応答に重要な示唆しています。
体内と体外の研究は、初乳 OT が新生児ラットの腸絨毛における細胞ストレス応答、炎症、およびオートファジーのマーカーを調節することを示しています。新生児の腸内細菌叢に初乳14,15と OT9などのホルモンを含む多数の蛋白質の母親から腸を同時に公開する場合の内腔側に実質的なの細胞圧力に苦しむ,10,16。
脳に OT の効果は、研究17をされています。しかし、出生後早期に腸内で示した OT シグナリング メカニズム脳に研究されていません。本稿で新生児ラット脳幹と視床下部の電気泳動を用いた離散脳核を分離するためメソッドを使用して、分離脳の領域をプロファイルします。このメソッドの全体的な目標は、細胞内情報伝達の脳領域誕生、最初のミルクは最小のグリア ・ ニューロン インデックスの脳組織で、授乳の前後にできるだけ近い状態をキャプチャすることです。この技術の開発のための根拠は、自動化された西部のしみを使用して前のヴィヴォ研究のためのニューロンより均質なコレクションと新生児子犬に制限された、微細な脳領域の急速な隔離のためできます。方法論は、比較的小規模な解剖サンプルに非常に一貫した結果を提供しています。前の仕事の欠点 (脳スライスまたは全脳) 総郭清より古い動物18,19を含まれます。若い子犬の脳は、非常にダイナミック、グリア分化を生れの後の波を搭載します。子犬の最初の供給によって影響を受け脳変化を研究するために再現可能な郭清を伴う制限された神経細胞核を勉強が必要です。
脳の発達中の脳の領域への影響はほとんど勉強したに対し、牛乳フィードは通常 (たとえば、腸20,の21)、健康や遺伝子発現への免疫学的および栄養の影響を分析します。腸コレシストキニン受容体迷走リレー脳幹核が細胞内シグナル伝達経路22参考腸に牛乳輸送が脳機能に及ぼす影響を調べた。妊娠23日中に母親の栄養失調に発展途上の新生児脳の脆弱性に関する膨大な文献があるが、ストレスと炎症シグナルは扱われません。重要なは、現在のメソッドは、内臓刺激の迷走神経の中継から初乳の血生まれる刺激を分離する日ゼロ ラット新生児における現象の活用します。これは孤束の未熟な核 (NTS) によって特徴付けられるいわゆるストレス低刺激応答性期間-国税庁、室傍核 (PVN) を制限する出生24,25の直後に視床下部の回路と視索上核 (SON) は、血生まれる刺激に通知します。
このメソッドは複数のシグナル伝達経路の分析に役立つ、脳組織は母親が挑戦されているかどうかに加えて、または治療の任意の種類ではなく、ラットの生後日 0 で収穫される神経細胞に比較的制限妊娠中。リットルは、pre-feeding 信号対フィード初乳の影響を分析できます。豊富な蛋白質収量の比較と脳領域間の信号を比較すると、このメソッドは、毛細血管が蛋白質の抗原の免疫定量と並行でポリペプチド バンドの総蛋白質の毛細血管に決定をできます。このメソッドは、標準的な定量曲線なし同じ抗体と毛細血管あたり総蛋白への参照によって得られた結果の任意の単位を使用して、定量的な比較をできます。異なった抗体によって得られた結果を比較することは、定量的標準曲線を使用して可能です。
このメソッドは、双方向の両方の器官の26の機能に影響を与える可能性、腸と脳との間で発生するシグナル伝達の評価できました。近年27で広範囲にわたって研究されてきた、オキシトシンと食物の摂取の間の関連付けは、増加オキシトシン シグナリングと栄養アベイラビリティの間のリンクをサポートします。これらの研究は、赤字は、視床下部のオキシトシンがシグナル伝達の削減と結合エネルギー コンバース概念もサポートします。
OT の脳活動に及ぼす影響の以前の研究では、迷走神経切断術28耐火が視床下部の PVN、扁桃体、および梨状皮質における Cfo 転写を誘導腸の炎症に誘発を示した。ただし、セクレチンと OT の全身投与は腸28で誘発される炎症反応に対する脳の Cfo 反応を減少しました。これは外因性の OT の効果はおそらくエリア後野6,29を介して運ばれる血液媒介性シグナル分子で、迷走神経のリレー以外のルートで実施された提案しました。
本研究では、腸内で以前に観察した細胞ストレスのシグナル伝達経路は脳で評価されました。順番に及ぼす脳機能、乳成分、保護、又は微生物やその他の代謝物、腸の透過性におよぼす炎症を延期しました。IkB で明確な拮抗の違い BiP シグナリング初乳13によるプライミングの前後に絨毛が見つかりましたと提案を開発する過程で、まだ新生児の脳がこれらの腸の免疫誘導信号を感じるかもしれない。
小胞体ストレスに関連付けられている以前の腸実験で使用されるシグナリング蛋白質のマーカーを測定しました。彼らは小胞体シャペロン BiP、翻訳開始因子 eIF2a (ストレス応答インテグレーター30となる)、eIF2a キナーゼが含まれて-PKR、および 2 つの炎症シグナル伝達蛋白質 (NF kB とその阻害剤、IkB)。
六つの脳領域が分泌する、または OT に応答する大人の能力に基づいて選ばれました。上部髄質にある国税庁は、内臓の入力の最初のリレーで腸31とサイトカインは、おそらく血液生まれて、毒素、隣接する野32を介してホルモンで迷走神経の感覚ニューロンから直接信号を受け取る。PVN、視索上核 (SON), 線条体核 (STR)、大脳皮質 (CX) と内側視索前野核 (MPO) 国税庁を介して腸から信号を受信します。
その結果、細胞ストレス応答初乳プライミング前、PVN と息子と比較して国税庁で異なるが摂餌開始直後すぐ産後の期間中CX のシグナリング、STR と MPO 異なって PVN と息子同様。細胞ストレスと腸内の炎症を調節する前に示した OT の明確な保護機能、脳のいくつかの領域によって検出される可能性が高い。まとめて、データを示す細胞レベルで出産後、最初の時間の間に脳に応答する代謝ストレス栄養不足に関連付けられています。データも表示範囲とフィード初乳の変調効果の方向が地域依存性であること、および彼らの腸の例で示した OT 効果ミラー、いくつかの地域では。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bradford solution</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein lysis kit</td>
			<td>Protein simple</td>
			<td>CBS403</td>
			<td>Bicine/CHAPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WES kits</td>
			<td>Protein simple</td>
			<td>WES-Mouse 12-230 master kit (PS-MK15), WES-Rabbit 12-230 master kit (PS-MK14), WES 12-230 kDa total Protein master kit (PS-TP07)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse IgG HRP conjugate</td>
			<td>Protein simple</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-phospho-eIF2a</td>
			<td>Cell Signaling technology</td>
			<td>SER51, 9721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse mAb anti-PKR</td>
			<td>Cell Signaling technology</td>
			<td>2103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-phospho-PKR</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Thr451, 07-886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit mAb anti-PKR</td>
			<td>Cell Signaling technology</td>
			<td>12297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit mAb anti-GAPDH</td>
			<td>Cell Signaling technology</td>
			<td>2118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse mAb anti-phospho-IKB</td>
			<td>Cell Signaling technology</td>
			<td>9246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse mAb anti-IKB</td>
			<td>Cell Signaling technology</td>
			<td>4814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-BiP</td>
			<td>Cell Signaling technology</td>
			<td>3183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti GCN2</td>
			<td>Cell Signaling technology</td>
			<td>3302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit mAb anti-phospho-GCN2</td>
			<td>BIORBYT</td>
			<td>T899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pregnant Sprague-Dawley rats</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Punch device</td>
			<td>WellTech Rapid Core or Harris Uni-Core</td>
			<td>0.35, 0.50, 0.75, 1.0, 1.20, 1.50</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing cellular stress and inflammation in discrete oxytocin-secreting brain nuclei in the neonatal rat before and after first colostrum feeding

このプロトコルの目的は、最初の初乳の授乳の前後に新生児の脳でオキシトシン受容体豊かな脳核を分離することです。西部にしみが付くことを使用して脳核分離株における代謝ストレス応答する知られていた蛋白質の発現を測定しました。これは、体内代謝ストレス誘発性の栄養不全が神経ストレスをトリガーするかどうかを評価するために行われました。以前新生児の栄養不全が腸内代謝ストレスを引き出すことができた。さらに、初乳オキシトシンは、最初のフィードの前後前に新生児ラットの腸絨毛における細胞ストレス応答、炎症、およびオートファジー マーカーを変調します。小胞体ストレスに関連付けられている蛋白質のマーカーをシグナリング [小胞体シャペロン結合免疫グロブリン蛋白質 (BiP) 真核生物翻訳開始因子 2 a (eIF2a) と eIF2a キナーゼ蛋白質キナーゼ R (p PKR)]、2 だけでなく、炎症シグナル伝達蛋白質 [核因子 κ B (NF kB) および阻害剤 κB (IkB)] 新生児脳核測定した [孤 (NTS)、室傍核 (PVN)、スープラ網膜神経核 (息子)、野 (CX)、線条体核 (STR) の核と内側視索前野核 (MPO)] 最初のフィード (初乳处置 p) の前に (初乳によってプライミング) 看護の開始後。Bip/grp78 と p eIF2a の発現はプライミング NTS 組織、处置 p で亢進とダウンレギュ レート。NF kB は、NF kB が低いとそのまま国税庁、PVN と息子の両方の条件に対し CX、STR と MPO の細胞質 (高) 保持されました。集団 BiP と p eIF2 所見は、ストレス応答と一致しています。eIf2a はだった息子、CX、STR、MPO で dsRNA 依存型キナーゼ (PKR-p) によりリン酸化されます。ただし、国税庁 (および PVN でより少ない程度に)、eIf2a は別のキナーゼ、一般制御 nonderepressible 2 キナーゼ (GCN2) によりリン酸化されます。いくつかの OTR の豊富な脳領域でミラー化される以前新生児の腸上皮細胞に見られるストレス変調構造が表示されます。国税庁、PVN 可能性があります他の地域から別のリン酸化機構 (栄養不足) 下を利用し、栄養不足の影響に抵抗性であります。総称して、このデータは、初乳プライミング上皮細胞からのシグナルによって栄養不足ストレス脳応答をオフセットすることを示唆しています。

総蛋白に対する免疫反応性の代表的なバンド示す非常に低い収穫された蛋白質と脳核。標準的な西部のしみに比べて高感度である自動化された西部のしみの技術の使用が必要です。このアプローチは、西部のしみのレーンあたりと比較して毛細血管あたり fortyfold より少ない蛋白質を実行できます。
差分脳核 BiP レベルに及?...

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Assessing Cellular Stress and Inflammation in Discrete Oxytocin-secreting Brain Nuclei in the Neonatal Rat Before and After First Colostrum Feeding

前に、最初の初乳の授乳後細胞ストレスと新生児ラットにおける離散のオキシトシン分泌脳核の炎症を評価します。

ここでは、最初の初乳の授乳と組み合わせて新生児ラット脳における脳核を分離するプロトコルを提案します。この技法は、上皮細胞のシグナリングを用いた変調、脳の栄養不足ストレスの研究をできます。

The goal of this protocol is to isolate oxytocin-receptor rich brain nuclei in the neonatal brain before and after first colostrum feeding. The expression ...

この方法は、ミルク吸引が脳内のストレスシグナル伝達に影響を与える方法について、出生後の発達分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術は、最初の自然飢餓期間中に特定の脳領域をキャプチャし、最初の自然初乳フィードの直後にそれぞれの領域と比較するために使用することができます。吸引が行動や感情の生理学にどのような影響を与えるかを理解することで、元生体内脳組織分析中に様々な受容体に対するアンタゴニストの使用が可能になります。核パンチを得るために、手袋をした手で尾でラットの子犬を取り除きます。脳を収穫した後、迅速に室温でポリメチルメタクリレート脳型に臓器全体を配置し、すぐに組織の500マイクロメートルの厚いスライスを作るために新しいカミソリの刃を使用します。スライスのロストラルをペトリ皿に置き、セクションの正しい方向を維持します。脳全体が切り離されると、ブドウ糖のない人工脳脊髄液を素早く皿に加え、28~30°Cで60分間、軌道シェーカーで一定の攪拌を行います。各組織に脳アトラスと解剖学的ランドマークを使用して、パンチされる脳核を特定し、新しいペトリ皿に関心のある核を持つスライスを解剖顕微鏡の下に置きます。一度視覚化したら、4~6個の異なる核を素早く打ち抜き、プロテウス阻害剤とホスファターゼ阻害剤を含む適切な標識されたマイクロ遠心分離管に各パンチ核を0.06mLの氷冷タンパク質抽出バッファーに迅速に浸漬します。インキュベーションの終わりに、抽出した核を冷却されたミニ遠心分離機で遠心分離し、マイクロピペットを使用して、各チューブから適切な予熱1.5mLマイクロ遠心分離管に0.055mLの上清を慎重に移します。マイナス20°Cの貯蔵前に、各タンパク質ストックチューブから、最初のサンプル調製のために氷上の適切な0.5 mL事前冷却チューブに上清の0.012 mLを移します。毛細管内タンパク質測定用のサンプルを準備するには、0.5 mLラベルチューブ内の各サンプルに、タンパク質のリシスキットから0.003 mLのマスターミックス試薬を追加します。次に、0.016 mLの脱イオン水中のビオチン化分子量ラダー溶液に0.004mLのマスターミックス試薬を加え、ラダーとタンパク質抽出サンプルを摂氏95度の熱塊で変性させ、5分後にすべてのチューブを摂氏4度で保存します。シグナルタンパク質分析のために、新しい自動化された西洋プレートのウェルE-1からE-25、D-25への二次抗マウス抗体の0.01 mLに作りたてのルミノール過酸化物溶液0.01 mLを加え、キットからD-1-ウェルに0.01 mLのストレプトアビジン・ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼを加える。作製した初等抗体の0.01 mLをC-25にウェルC-2に加え、0.01 mLの抗体希釈液をウェルC-1とB-1からB-25に加えます。行Fウェルを空のままにし、F行の下の3つの行の5つのコンパートメントを0.45 mLの洗浄バッファで満たします。次に、冷蔵サンプルを30秒間簡単に回転させ、各サンプルの0.03 mLをA-2から始めて行Aの各ウェルに追加します。その後、ビオチン化分子量ラダーの0.005 mLをA-1ウェルに加え、遠心分離のためにプレートを覆います。プレートが遠心分離されている間、自動化された西洋関連ソフトウェアで新しい実行ファイルを開き、分子サイズアッセイを開始します。アッセイページでは、サンプル名を各毛細血管に入力し、一次抗体と二次抗体の名前を入力します。遠心分離の終わりに、自動西洋の器具にプレートを置き、キャピラリーカートリッジボックスからカバーを剥がします。遠心分離の後、毛細管の気泡が電気泳動電流を遮断し、ラウンド全体に失敗する可能性があるため、気泡がないか検査することを忘れないでください。カートリッジを器具内の指定位置に挿入し、ドアを閉めます。[開始] をクリックします。アッセイの種類を求められたら、適切なテキストボックスに実験の名前を入力し、[大丈夫]をクリックします。アクティブ化された実行日付と実行ファイルの ID 番号が表示されたら、実行が終了した時刻をメモします。走行の終了時に、キャピラリーカートリッジをシャープ処分に廃棄し、プレートを生体有害物質の処分に廃棄します。電気泳動分離後、リン酸化真核生物翻訳開始因子2Aを表す40〜43キロダルトンで抗原の免疫反応性ピークを実行ファイルで確認します。このサイズの分子量のピークが欠落している場合は、カーブの下を右クリックし、曲線の下のサイズと任意の量が記録されるように、ピークに分子量を追加を選択します。未形成組織サンプル内では、孤独なトラックの核中の結合アミノグロブリンタンパク質レベルは、他のすべての領域と比較して有意に高い。初乳を有する腸組織のプライミングは、孤独なトラックの核中の結合性アミノグロブリンタンパク質レベルを減少させ、パラベントリク核および超光学核に影響を及ぼさない。逆に、プライミングは、未形成組織に対する皮質内の結合性アミノグロブリンタンパク質レベル、ストリエーション核および内側プレオプティック核を増加させ、種々の試験された脳核における結合性アミノグロブリンタンパク質レベルが腸のプライミングに異なる反応を示すことを示唆し、試験された様々な核間のクロストークはまだ実証されていない。真核翻訳開始因子2Aおよびリン酸化真核生物翻訳開始因子2Aレベルは、他の核に対して未形成状態で上昇する。プライミング後、真核翻訳開始因子2Aおよびリン酸化真核生物翻訳開始因子2Aの両方のレベルは、未プライメーション組織と比較して、孤独なトラックの核に対して減少する。他のすべての試験核において、プライミングは、真核生物翻訳開始因子2Aおよびリン酸化真核生物翻訳開始因子2Aのレベルを未プライメーション組織に対して増加させる。しかしながら、リン酸化タンパク質キナーゼ受容体のレベルは、単一のトラックの核におけるプライミングされたサンプルに対して、未プライミングサンプルにおいて低く、真核翻訳開始因子2Aのリン酸化に別のキナーゼが関与していることを強く示唆している。その開発後、この技術は、出生後の発達の分野の研究者が、組織の成長と分化に関与するシグナル伝達経路と、それらが吸引の影響を受けるか独立しているかを探求する道を開いた。例えば、ジチオスレイトールのような揮発性還元剤を使用すると危険であり、この手順を準備する際には、化学フード内の準備などの予防措置を常に取るべきであることを忘れないでください。

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