Name: assessing cellular stress and inflammation in discrete oxytocin-secreting brain nuclei in the neonatal rat before and after first colostrum feeding
Uploaded: 2018-11-14T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Cellular Stress and Inflammation in Discrete Oxytocin-secreting Brain Nuclei in the Neonatal Rat Before and After First Colostrum Feeding at JoVE.co

Forfatterne takker Manon Ranger og Alexandra Schulz for deres hjelp i utarbeidelsen av denne protokollen.

Denne studien ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteer ved Columbia University og New York statens psykiatrisk Institutt.
1. vev forberedelse
<ol><li>Bestill tidsbestemt gravid rotter fra leverandøren.</li>
	<li>Følg tidsbestemt gravid rotter ved å observere deres voksende sklerotisert i ukene etter deres ankomst og senere ute etter pups på forventet leveringsdato ved inspiserer byrået hver 2T til levering begynner.</li>
	<li>Fjern pups med en hansker hånd av halen ...

<ol>
	<li>Hietaniemi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiles+in+fetal+and+neonatal+rat+offspring+of+energy-restricted+dams.">Gene expression profiles in fetal and neonatal rat offspring of energy-restricted dams.</a> Journal of Nutrigenetics and Nutrigenomics. 2 (4-5), 173-183 (2009).</li><li>Okabe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogenous+glycine+receptor+expression+in+cortical+plate+neurons+and+Cajal-Retzius+cells+of+neonatal+rat+cerebral+cortex.">Homogenous glycine receptor expression in cortical plate neurons and Cajal-Retzius cells of neonatal rat cerebral cortex.</a> Neuroscience. 123 (3), 715-724 (2004).</li><li>Mailleux, P., Takazawa, K., Erneux, C., Vanderhaeghen, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+the+neurons+containing+inositol+1,4,5-trisphosphate+3-kinase+and+its+messenger+RNA+in+the+developing+rat+brain.">Distribution of the neurons containing inositol 1,4,5-trisphosphate 3-kinase and its messenger RNA in the developing rat brain.</a> Journal of Comparative Neurology. 327 (4), 618-629 (1993).</li><li>Carter, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxytocin+and+Human+Evolution.">Oxytocin and Human Evolution.</a> Current Topics in Behavioral Neuroscience. , (2017).</li><li>Sippel, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxytocin+and+Stress-related+Disorders:+Neurobiological+Mechanisms+and+Treatment+Opportunities.">Oxytocin and Stress-related Disorders: Neurobiological Mechanisms and Treatment Opportunities.</a> Chronic Stress (Thousand Oaks). 1, (2017).</li><li>Agnati, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspects+on+the+integrative+actions+of+the+brain+from+neural+networks+to+"brain-body+medicine".">Aspects on the integrative actions of the brain from neural networks to "brain-body medicine".</a> Journal of Receptors and Signal Transduction Research. 32 (4), 163-180 (2012).</li><li>Welch, M. G., Margolis, K. G., Li, Z., Gershon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxytocin+regulates+gastrointestinal+motility,+inflammation,+macromolecular+permeability,+and+mucosal+maintenance+in+mice.">Oxytocin regulates gastrointestinal motility, inflammation, macromolecular permeability, and mucosal maintenance in mice.</a> American Journal Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 307 (8), G848-G862 (2014).</li><li>Welch, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+developmental+regulation+of+oxytocin+(OT)+and+oxytocin+receptors+(OTR)+in+the+enteric+nervous+system+(ENS)+and+intestinal+epithelium.">Expression and developmental regulation of oxytocin (OT) and oxytocin receptors (OTR) in the enteric nervous system (ENS) and intestinal epithelium.</a> Journal of Comparative Neurology. 512 (2), 256-270 (2009).</li><li>Prakash, B. S., Paul, V., Kliem, H., Kulozik, U., Meyer, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+oxytocin+in+milk+of+cows+administered+oxytocin.">Determination of oxytocin in milk of cows administered oxytocin.</a> Analytica Chimica Acta. 636 (1), 111-115 (2009).</li><li>Solangi, A. R., Memon, S. Q., Mallah, A., Khuhawar, M. Y., Bhanger, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+separation+of+oxytocin,+norfloxacin+and+diclofenac+sodium+in+milk+samples+using+capillary+electrophoresis.">Quantitative separation of oxytocin, norfloxacin and diclofenac sodium in milk samples using capillary electrophoresis.</a> Biomedical Chromatography. 23 (9), 1007-1013 (2009).</li><li>Klein, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxytocin+modulates+markers+of+the+unfolded+protein+response+in+Caco2BB+gut+cells.">Oxytocin modulates markers of the unfolded protein response in Caco2BB gut cells.</a> Cell Stress and Chaperones. 19 (4), 465-477 (2014).</li><li>Klein, B. Y., Tamir, H., Hirschberg, D. L., Glickstein, S. B., Welch, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxytocin+modulates+mTORC1+pathway+in+the+gut.">Oxytocin modulates mTORC1 pathway in the gut.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 432 (3), 466-471 (2013).</li><li>Klein, B. Y., Tamir, H., Ludwig, R. J., Glickstein, S. B., Welch, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colostrum+oxytocin+modulates+cellular+stress+response,+inflammation,+and+autophagy+markers+in+newborn+rat+gut+villi.">Colostrum oxytocin modulates cellular stress response, inflammation, and autophagy markers in newborn rat gut villi.</a> Biochemical an Biophysical Research Communications. 487 (1), 47-53 (2017).</li><li>Donnet-Hughes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+role+of+the+intestinal+microbiota+of+the+mother+in+neonatal+immune+education.">Potential role of the intestinal microbiota of the mother in neonatal immune education.</a> Proceedings of the Nutritional Society. 69 (3), 407-415 (2010).</li><li>Perez, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+imprinting+of+the+neonatal+immune+system:+lessons+from+maternal+cells?.">Bacterial imprinting of the neonatal immune system: lessons from maternal cells?.</a> Pediatrics. 119 (3), e724-e732 (2007).</li><li>Takeda, S., Kuwabara, Y., Mizuno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentrations+and+origin+of+oxytocin+in+breast+milk.">Concentrations and origin of oxytocin in breast milk.</a> Endocrinolcia Japonica. 33 (6), 821-826 (1986).</li><li>Quintana, D. S., Outhred, T., Westlye, L. T., Malhi, G. S., Andreassen, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+oxytocin+administration+on+brain+activity:+a+systematic+review+and+meta-analysis+protocol.">The impact of oxytocin administration on brain activity: a systematic review and meta-analysis protocol.</a> Systematic Reviews. 5 (1), 205 (2016).</li><li>Dobbing, J., Sands, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+aspects+of+the+brain+growth+spurt.">Comparative aspects of the brain growth spurt.</a> Early Human Development. 3 (1), 79-83 (1979).</li><li>Orr, M. E., Garbarino, V. R., Salinas, A., Buffenstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extended+Postnatal+Brain+Development+in+the+Longest-Lived+Rodent:+Prolonged+Maintenance+of+Neotenous+Traits+in+the+Naked+Mole-Rat+Brain.">Extended Postnatal Brain Development in the Longest-Lived Rodent: Prolonged Maintenance of Neotenous Traits in the Naked Mole-Rat Brain.</a> Frontiers in Neuroscience. 10, 504 (2016).</li><li>Hansson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+quantitative+proteome+analysis+of+in+vivo+intestinal+development.">Time-resolved quantitative proteome analysis of in vivo intestinal development.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 10 (3), (2011).</li><li>Mochizuki, K., Yorita, S., Goda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+changes+in+the+jejunum+of+rats+during+the+transient+suckling-weaning+period.">Gene expression changes in the jejunum of rats during the transient suckling-weaning period.</a> Journal of Nutritional Science and Vitaminology (Tokyo). 55 (2), 139-148 (2009).</li><li>Rinaman, L., Banihashemi, L., Koehnle, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+life+experience+shapes+the+functional+organization+of+stress-responsive+visceral+circuits.">Early life experience shapes the functional organization of stress-responsive visceral circuits.</a> Physiology and Behavior. 104 (4), 632-640 (2011).</li><li>Johannes, G., Sarnow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cap-independent+polysomal+association+of+natural+mRNAs+encoding+c-myc,+BiP,+and+eIF4G+conferred+by+internal+ribosome+entry+sites.">Cap-independent polysomal association of natural mRNAs encoding c-myc, BiP, and eIF4G conferred by internal ribosome entry sites.</a> RNA. 4 (12), 1500-1513 (1998).</li><li>Rinaman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hindbrain+noradrenergic+A2+neurons:+diverse+roles+in+autonomic,+endocrine,+cognitive,+and+behavioral+functions.">Hindbrain noradrenergic A2 neurons: diverse roles in autonomic, endocrine, cognitive, and behavioral functions.</a> American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 300 (2), R222-R235 (2011).</li><li>Walker, C. D., Toufexis, D. J., Burlet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothalamic+and+limbic+expression+of+CRF+and+vasopressin+during+lactation:+implications+for+the+control+of+ACTH+secretion+and+stress+hyporesponsiveness.">Hypothalamic and limbic expression of CRF and vasopressin during lactation: implications for the control of ACTH secretion and stress hyporesponsiveness.</a> Progress in Brain Research. 133, 99-110 (2001).</li><li>Montiel-Castro, A. J., Gonzalez-Cervantes, R. M., Bravo-Ruiseco, G., Pacheco-Lopez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microbiota-gut-brain+axis:+neurobehavioral+correlates,+health+and+sociality.">The microbiota-gut-brain axis: neurobehavioral correlates, health and sociality.</a> Frontiers in Integrative Neuroscience. 7, 70 (2013).</li><li>Blevins, J. E., Ho, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+oxytocin+signaling+in+the+regulation+of+body+weight.">Role of oxytocin signaling in the regulation of body weight.</a> Reviews in Endocrine and Metabolic Disorders. 14 (4), 311-329 (2013).</li><li>Welch, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+administration+of+secretin+and+oxytocin+inhibits+chronic+colitis+and+associated+activation+of+forebrain+neurons.">Combined administration of secretin and oxytocin inhibits chronic colitis and associated activation of forebrain neurons.</a> Neurogastroenterology Motility. 22 (6), 654 (2010).</li><li>Berthoud, H. R., Neuhuber, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+chemical+anatomy+of+the+afferent+vagal+system.">Functional and chemical anatomy of the afferent vagal system.</a> Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical. 85 (1-3), 1-17 (2000).</li><li>Taniuchi, S., Miyake, M., Tsugawa, K., Oyadomari, M., Oyadomari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+stress+response+of+vertebrates+is+regulated+by+four+eIF2alpha+kinases.">Integrated stress response of vertebrates is regulated by four eIF2alpha kinases.</a> Scientific Reports. 6, 32886 (2016).</li><li>Altschuler, S. M., Bao, X. M., Bieger, D., Hopkins, D. A., Miselis, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscerotopic+representation+of+the+upper+alimentary+tract+in+the+rat:+sensory+ganglia+and+nuclei+of+the+solitary+and+spinal+trigeminal+tracts.">Viscerotopic representation of the upper alimentary tract in the rat: sensory ganglia and nuclei of the solitary and spinal trigeminal tracts.</a> Journal of Comparative Neurology. 283 (2), 248-268 (1989).</li><li>Shapiro, R. E., Miselis, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+central+neural+connections+of+the+area+postrema+of+the+rat.">The central neural connections of the area postrema of the rat.</a> Journal of Comparative Neurology. 234 (3), 344-364 (1985).</li><li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , (1997).</li><li>Nayak, R., Pintel, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+viruses+can+induce+phosphorylation+of+eIF2alpha+via+PKR+activation,+which+can+be+overcome+by+helper+adenovirus+type+5+virus-associated+RNA.">Adeno-associated viruses can induce phosphorylation of eIF2alpha via PKR activation, which can be overcome by helper adenovirus type 5 virus-associated RNA.</a> Journal of Virology. 81 (21), 11908-11916 (2007).</li><li>Zaborske, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+tRNA+charging+and+activation+of+the+eIF2+kinase+Gcn2p.">Genome-wide analysis of tRNA charging and activation of the eIF2 kinase Gcn2p.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (37), 25254-25267 (2009).</li><li>Hollis, J. H., Lightman, S. L., Lowry, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+systemic+and+visceral+sensory+information+by+medullary+catecholaminergic+systems+during+peripheral+inflammation.">Integration of systemic and visceral sensory information by medullary catecholaminergic systems during peripheral inflammation.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1018, 71-75 (2004).</li><li>Klein, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxytocin+opposes+effects+of+bacterial+endotoxin+on+ER-stress+signaling+in+Caco2BB+gut+cells.">Oxytocin opposes effects of bacterial endotoxin on ER-stress signaling in Caco2BB gut cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1860 (2), 402-411 (2016).</li><li>Kaltschmidt, B., Kaltschmidt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB+in+the+nervous+system.">NF-kappaB in the nervous system.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (3), a001271 (2009).</li></ol>

En teknikk for microdissection av diskrete, OTR-rik hjernen kjerner i neonatal rotte hjernen presenteres i dette dokumentet. Det er også anerkjent at neurons er høyt spesialisert, selv innenfor godt karakterisert kjerner i hjernen. Dette svært reproduserbar isolere bestemte OTR-rik kjerner gir robust hypotesetesting. Bruke automatisert vestlige blotting, ble konsekvent og reproduserbarhet resultatene ytterligere forbedret. Mens en begrensning av denne teknikken er fortsatt beskjedne hjernen punch variasjon; Denne tekn...

I motsetning til vår forståelse av tidlig hjernens utvikling skjer i løpet av dager til uker postpartum, er relativt lite kjent om mylderet av dynamiske endringer forekommer i de første timene av livet i rotter. En viktig utfordring er den lille størrelsen på neonatal rotte hjernen og en forutsetning for high-tech verktøy å isolere diskret hjernen regioner eller enkeltceller. Studier vurdere ofte genet transkripsjon og ikke oversettelse1,2, som ikke gir en solid forståelse av funksjonelle aktivert signalnettverk molekyler. Andre undersøke uttrykk med immunohistochemistry til referanse hjernen områder, som ikke tillater for kvantifisering av uttrykket nivå3. Ingen studie hittil har undersøkt aktivering av signalnettverk trasé forbundet med rotter første råmelk feed i diskret hjernen regioner, som krever rask isolasjon og offer og måling av protein uttrykk og protein fosforylering bruker Western blotting. Mens hjernen microdissection utføres på eldre og større hjerner, har vi ikke funnet en referanse utfører en ikke-enkeltcelle hjernen punch i P0 hjernen. Dette dokumentet presenterer en protokoll for å isolere begrensede områder av neonatal hjernen ved hjelp av en relativt low-tech punch teknikk og en vestlig blotting prosedyre for å måle protein uttrykk i relativt små utvalg. Denne protokollen kan være passende for forskning spørsmål som krever vurdering av protein uttrykk og post-translasjonell modifikasjoner (f.eks., fosforylering) i relativt begrensede områder små hjerner av alle arter, forutsatt at det brukeren kan visuelt identifiserer hjernen regionen rundt med en atlas og identifiserbar landemerker.
Denne teknikken ble utviklet for å forstå endringene skjer i hjernen som følge av neonatal rottene første råmelk feed, som er rik på oksytosin (OT). OT har lenge vært kjent for sin evne til å stimulere melk laktasjon og livmor sammentrekning. Men er OT nå kjent for å spille et bredt spekter av roller i regulering av mange kroppsfunksjoner og atferd4. For eksempel OT motsetter stress og betennelse i forbindelse med adaptive affiliative atferd5forsinkelser mage tømming og bremser intestinal transitt. OT reseptorer (OTR) har blitt identifisert i enteric nevroner og intestinal epitel6,7,8. Gastrointestinale effekten av OT er spesielt viktig for barnet under tidlig barseltiden. For eksempel amming er knyttet til leveringen av betydelige mengder OT til neonatal gut9,10, og data viser at OTR er tungt overexpressed i duodenalsår villi under melk suckling perioden8.
In vitro eksperimenter ved hjelp av en gut cellen linje har vist på cellenivå at oksytosin modulerer viktig molekyler i stress signalering veien11,12 og spiller en regulerende rolle i oversettelse av proteiner 12. disse studiene tyder på at komponenter melk, inkludert eksogene oksytosin fra mor, er viktig for den oppslåtte protein responsen i nyfødte til reduserer mobilnettet stress13.
I vivo og ex vivo studier har vist at råmelk OT modulerer mobilnettet stress respons, betennelse og autophagy markørene i nyfødte rotte gut villi. Nyfødte enterocytes lider betydelig mobilnettet stress på sin luminal side når tarmen er samtidig eksponert for bakterieflora fra moren i colostrum14,15 og mange proteiner, inkludert hormoner som OT9 , 10 , 16.
Effekten av OT på hjernen har vært studert17. OT signalnettverk mekanismer demonstrert i tarmen under tidlig barseltiden har imidlertid ikke vært undersøkt i hjernen. I dette papiret brukes en metode for å isolere diskret hjernen kjerner i neonatal rotte hjernestammen og hypothalamus bruker geleelektroforese å profilere isolert hjernen regioner. Det overordnede målet med denne metoden er å fange tilstanden til celle signalisering i hjernen områder så nært som mulig til fødsel, før og etter den første melken suckling, i hjernevevet med lavest glial/neuronal indeksen. Begrunnelsen for utviklingen av denne teknikken er at det tillater for rask isolering av begrenset, mikroskopiske hjernen regioner i neonatal pups med en mer homogene samling av neurons for ex vivo studier med en automatisert vestlige blotting metodikk, tilbyr svært konsistente resultater på relativt liten dissekert prøver. En svakhet på tidligere arbeid inkluderer flere brutto disseksjon (hjernen skiver eller hele hjernen) og eldre dyr18,19. Hjernen av ung pups er utrolig dynamisk, med bølger av glial differensiering etter fødselen. For å studere hjernen endringene påvirket av pups' første mate, er studere begrenset neuronal kjerner med reproduserbar disseksjon nødvendig.
Melk feed er vanligvis analysert for dens immunologiske og ernæringsmessige innvirkning på helse eller genet uttrykk (for eksempel i enterocytes20,21), mens dens effekt på hjernen områder under hjernens utvikling er sjelden studert. Effekten av melk transitt i tarmen på hjernefunksjon var analysert i referanse gut cholecystokinin reseptorer vagal relé hjernestammen kjerner, men ikke intracellulær signalnettverk trasé22. Det er en omfattende litteratur på sårbarheten i utvikle neonate hjernen til underernæring mødre under graviditet23, men stress og betennelse signalene er adressert ikke. Viktigst, utnytter det aktuelle metoden et fenomen i dag null rotte nyfødte som isolerer blod-født råmelk stimuli fra vagal relé visceral stimuli. Dette er såkalte stress hypo-respons perioden preget av umodne kjernen løpet solitarius (NTS)-hypothalamus krets umiddelbart etter fødselen24,25 som begrenser NTS, paraventricular kjernen (PVN), og supraoptic kjernen (sønn) signaler til blod-født stimuli.
Denne metoden er nyttig for analyse av flere signalveier og begrenset relativt til nevronale celler, forutsatt at hjernevev er høstet på postnatal dag-0 i rotter, i tillegg til om mødre har blitt utfordret eller ikke av noen form for behandling under graviditet. Søppel kan bli analysert for virkningene av råmelk feed i motsetning pre fôring signalering. Når du sammenligner signaler mellom hjernen områder med fattige versus rik protein avkastning, kan denne metoden i kapillær besluttsomhet totale protein polypeptid band i kapillærene går parallelt immun-kvantifisering av protein antigener. Denne metoden gjør det mulig for kvantitative sammenligningen med vilkårlig enheter, resultatene av samme antistoffer uten standard kvantitative kurver og referanse til totalt protein per kapillær. Sammenligne resultatene av ulike antistoffer er mulig bare ved hjelp av kvantitative standard kurver.
Denne metoden tillatt for vurdering av toveis signalering oppstår mellom tarmen og hjernen, og som kan påvirke funksjonen i begge organer26. Tilknytningen mellom oksytosin og mat inntak, som har vært grundig studert i årene27, støtter en sammenheng mellom økt oksytosin signalering og næringsstoffer tilgjengelighet. Disse studiene støtter også converse konseptet at energi underskudd er kombinert med reduksjon i hypothalamus oksytosin signalering.
Tidligere studier av effekten av OT på hjerneaktiviteten vist at indusert gut betennelse elicited cFos transkripsjon i hypothalamus PVN og amygdala piriform cortex som var ildfaste til vagotomy28. Imidlertid redusert systemisk infusjon av OT med secretin hjernen cFos reaksjon på provosert inflammatorisk reaksjon i tarmen28. Dette foreslo at effekten av eksogene OT ble utført av ruter enn vagal reléer, muligens via blodbårne signalnettverk molekylene båret gjennom området postrema6,29.
I denne studien ble de cellulære stress signalveier som har tidligere observert i tarmen vurdert i hjernen. Hypotesen var at melk komponenter kan beskytte eller utsette effekten av betennelse på gut permeabilitet til mikrobiell og andre metabolitter, og i sin tur effekter på hjernefunksjonen. De klart motsetninger i IkB versus BiP signalering funnet i villi før og etter grunning av råmelk13, foreslo at hjernen til nyfødte, fortsatt holder på å utvikle, føler disse råmelk-indusert gut-signaler.
Signalnettverk protein markører tidligere gut-forsøk som er tilordnet endoplasmatiske retikulum stress ble målt. De inkluderer ER Anstandsdame BiP, oversettelse initiering faktor eIF2a (som fungerer som en stress reaksjon integrator30), eIF2a kinase p-PKR, og to betennelse-signalisering proteiner (NF-kB og dens inhibitor, IkB).
Seks hjernen regioner basert på deres evne hos voksne skiller eller svare på OT ble valgt. NTS, i den øvre margen, er første relésending av visceral input og får direkte signalene fra vagal sensoriske neurons i tarmen31 og muligens blod-født cytokiner, giftstoffer og hormoner via de tilstøtende område-postrema32. PVN, supraoptic kjernen (sønn), striatum kjerner (STR), hjernebarken (CX) og mediale preoptic kjernen (MPO) motta signalene fra tarmen via NTS.
Resultatene viste at mobilnettet stressrespons i umiddelbar barseltiden før råmelk grunning og umiddelbart etter første mate er forskjellige i NTS sammenlignet med PVN og sønn. Signalering i CX, forskjellig STR, og MPO fra PVN og sønn, også. Forskjellige beskyttende funksjoner OT vist tidligere å modulere celle stress og betennelse i tarmen er sannsynligvis kjente av deler av hjernen. Samlet indikerer data at på cellenivå, under de første timene etter fødselen, hjernen reagerer på metabolske stress forbundet med næringsstoffer mangel. Dataene viser også at omfanget og retning av modulerende effektene av råmelk feed er regionen-avhengige, og at i enkelte regioner, de gjenspeiler OT effekter vises tidligere i tarmen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bradford solution</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein lysis kit</td>
			<td>Protein simple</td>
			<td>CBS403</td>
			<td>Bicine/CHAPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WES kits</td>
			<td>Protein simple</td>
			<td>WES-Mouse 12-230 master kit (PS-MK15), WES-Rabbit 12-230 master kit (PS-MK14), WES 12-230 kDa total Protein master kit (PS-TP07)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse IgG HRP conjugate</td>
			<td>Protein simple</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-phospho-eIF2a</td>
			<td>Cell Signaling technology</td>
			<td>SER51, 9721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse mAb anti-PKR</td>
			<td>Cell Signaling technology</td>
			<td>2103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-phospho-PKR</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Thr451, 07-886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit mAb anti-PKR</td>
			<td>Cell Signaling technology</td>
			<td>12297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit mAb anti-GAPDH</td>
			<td>Cell Signaling technology</td>
			<td>2118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse mAb anti-phospho-IKB</td>
			<td>Cell Signaling technology</td>
			<td>9246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse mAb anti-IKB</td>
			<td>Cell Signaling technology</td>
			<td>4814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-BiP</td>
			<td>Cell Signaling technology</td>
			<td>3183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti GCN2</td>
			<td>Cell Signaling technology</td>
			<td>3302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit mAb anti-phospho-GCN2</td>
			<td>BIORBYT</td>
			<td>T899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pregnant Sprague-Dawley rats</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Punch device</td>
			<td>WellTech Rapid Core or Harris Uni-Core</td>
			<td>0.35, 0.50, 0.75, 1.0, 1.20, 1.50</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing cellular stress and inflammation in discrete oxytocin-secreting brain nuclei in the neonatal rat before and after first colostrum feeding

Målet med denne protokollen er å isolere oxytocin-reseptor rik hjernen kjerner i neonatal hjernen før og etter første råmelk fôring. Uttrykk for proteiner som er kjent for å svare på metabolske stress ble målt i hjernen-kjerner isolerer med vestlige blotting. Dette ble gjort for å vurdere om metabolske stress-indusert næringsstoffer mangel i kroppen utløst neuronal stress. Vi har tidligere vist at næringsstoffer mangel i nyfødte utløser metabolske stress i tarmen. Videre modulerer råmelk oksytosin mobilnettet stress respons, betennelse og autophagy markører i nyfødte rotte gut villi før og etter første feed. Signalisering protein markører tilordnet endoplasmatiske retikulum stress [ER Anstandsdame bindende immunglobulin protein (BiP), eukaryote oversettelse initiering faktor 2A (eIF2a), og eIF2a kinase protein kinase R (p-PKR)], og to betennelse-signalisering proteiner [kjernefysiske faktor-κB (NF-kB) og hemmer κB (IkB)], ble målt i nyfødt hjernen kjerner [kjernen av enslig skrift (NTS), paraventricular kjernen (PVN), supra-optisk kjernen (sønn), cortex (CX), striatum kjerner (STR), og mediale preoptic kjernen (MPO)] før den første feeden (unprimed av råmelk) og etter starten av sykepleie (primet med råmelk). Uttrykk for BiP/GRP78 og p-eIF2a var upregulated i unprimed og downregulated i primet NTS vev. NF-kB ble beholdt (høy) i CX, STR og MPO cytoplasma, mens NF-kB var lavere og uendret i NTS, PVN og sønn i begge betingelsene. Den kollektive BiP og p-eIF2 funn er i samsvar med stressrespons. eIf2a var fosforylert av dsRNA avhengige kinase (p-PKR) i sønn, CX, STR og MPO. Men var i NTS (og i mindre grad i PVN), eIf2a fosforylert av en annen kinase, generalen nonderepressible-2 kinase (GCN2). Stress-modulerende mekanismer tidligere observert i nyfødte gut enterocytes synes å gjenspeiles i noen OTR-rik hjernen regioner. NTS og PVN kan bruke en annen fosforylering mekanisme (under næringsstoffer mangel) fra andre regioner og være gjenstridig å virkningen av næringsstoffer mangel. Samlet tyder disse dataene på at hjernen Svar å næringsstoffer insuffisiens stress er forskjøvet med signalene fra råmelk-fylt enterocytes.

Representant bånd immunoreactivity i forhold til totalt protein viser at det er hjernen kjerner med svært lav høstet protein. Dette krever bruk av automatiserte Western blot teknikken, som er svært sensitive forhold til kanoniske Western blot. Denne tilnærmingen kan kjøres med fortyfold mindre protein per kapillær sammenlignet per kjørefelt i vestlige blots.
Differensial effekter av råmelk grunning på BiP nivåer i hjerne...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Cellular Stress and Inflammation in Discrete Oxytocin-secreting Brain Nuclei in the Neonatal Rat Before and After First Colostrum Feeding at JoVE.co

Assessing Cellular Stress and Inflammation in Discrete Oxytocin-secreting Brain Nuclei in the Neonatal Rat Before and After First Colostrum Feeding

Vurdere mobilnettet Stress og betennelser i diskret Oxytocin-sekresjon hjernen kjerner i Neonatal rotte før og etter første Colostrum fôring

Her presenterer vi en protokoll for å isolere hjernen kjerner i neonatal rotte hjernen i forbindelse med første råmelk fôring. Denne teknikken tillater studiet av næringsstoffer insuffisiens stress i hjernen som modulert av enterocyte signalering.

The goal of this protocol is to isolate oxytocin-receptor rich brain nuclei in the neonatal brain before and after first colostrum feeding. The expression ...

Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål i postnatal utviklingsfeltet om hvordan melk suckling påvirker stress signalering i hjernen. Denne teknikken kan brukes til å fange bestemte hjerneområder i løpet av den første naturlige sultperioden og å sammenligne dem med respektive områder kort tid etter den første naturlige colostrum feed. Forstå hvordan suckling påvirker fysiologien av atferd og følelser gjør det mulig å bruke en antagonist til ulike reseptorer under ex-vivo hjernevev analyse.For å få kjerneslagene, fjern rottevalpene med halen med en hanskehånd. Etter høsting av hjernen, legg raskt hele orgelet i en polymetylmetakrylathjerneform ved romtemperatur og bruk umiddelbart et nytt barberblad for å lage 500 mikrometer tykke skiver av vevet. Legg skivene rostral til caudal i en petriskål som de er oppnådd for å opprettholde riktig orientering av seksjonene.Når hele hjernen er seksjonert, legg raskt kunstig cerebral spinalvæske uten glukose til parabolen og inkuber skivene i 60 minutter ved 28 til 30 grader Celsius med konstant omrøring på en orbital shaker. Bruk et hjerneatlas og anatomiske landemerker på hvert vev for å identifisere hjernekjernene som skal slås og plassere skiven med kjernene av interesse for en ny petriskål under et disseksjonsmikroskop. Når visualisert, bruk et koringsverktøy for raskt å slå ut fire til seks forskjellige kjerner og raskt senke hver punched kjerne i 0,06 ml iskald proteinekstraksjonsbuffer i det riktig merkede mikrosentrifugerrøret som inneholder proteushemmere og fosfatasehemmere i 60 minutter.På slutten av inkubasjonen sentrifugerer de ekstraherte kjernene i en avkjølt mini-sentrifuge, og bruk en mikropipette til å forsiktig overføre 0,055 ml supernatant fra hvert rør til riktig forhåndskjølt 1,5 ml mikrosentrigerrør på is. Før negativ 20 grader Celsius lagring, overføre 0,012 ml supernatant fra hvert protein lager rør til riktig 0,5 ml pre-avkjølt rør på is for første prøve forberedelse. For å forberede prøvene for in-kapillær proteinmåling, tilsett 0,003 ml master mix reagens fra et proteinlysesett til hver av prøvene i de 0,5 ml merkede rørene.Deretter legger du til 0,004 ml master mix reagens til en biotinylert molekylær vektstigeløsning i 0,016 ml avionisert vann, og fornekter stigen og proteinekstraktprøvene i en 95 grader Celsius varmeblokk, og lagrer alle rørene på fire grader Celsius etter fem minutter. For signalproteinanalyse, tilsett 0,01 ml nylaget luminolperoksidløsning til brønner E-1 til E-25 av en ny automatisert vestlig plate, 0,01 ml sekundært antimusantistoff til brønner D-2 til D-25, og tilsett 0,01 ml streptavidin pepperrotperoksidase fra settet til godt D-1. Tilsett 0,01 ml nylaget primærantistoff i brønnene C-2 til C-25, og 0,01 ml antistoff fortynningsvæske to oppløsning til brønnene C-1 og B-1 til B-25.La rad F-brønnene stå tomme og fyll de fem rommene på de tre radene under F-raden med 0,45 ml vaskebuffer. Deretter spinner du kort de nedkjølte prøvene i 30 sekunder og legger til 0,03 ml av hver prøve i hver brønn på rad A, og starter med A-2. Deretter legger du til 0,005 ml av den biotinylererte molekylvektsstigen til brønn A-1 og dekker platen for sentrifugering.Mens platen er sentrifugert, åpne en ny kjøre fil i automatisert vestlig tilknyttet programvare og starte en molekylær størrelse analyse. Skriv inn eksempelnavnene i hver kapillær på analysesiden, samt navnene på de primære og sekundære antistoffene. På slutten av sentrifugeringen plasserer du platen i det automatiserte vestlige instrumentet og skreller dekselet fra kapillærkassetten.Etter sentrifugering, ikke glem å inspisere for luftbobler, fordi luftbobler i kapillæren kan blokkere den elektroforediske strømmen og mislykkes hele runden. Sett patronen inn i den angitte posisjonen i instrumentet og lukk døren. Klikk start.Når du blir bedt om det med analysetypen, skriver du inn navnet på eksperimentet i den aktuelle tekstboksen og klikker på ok. Når du blir bedt om det aktiverte kjøredatoen og ID-nummeret på kjør-filen, noterer du deg tidspunktet da kjøringen avsluttes. På slutten av løpet, kast kapillærkassetten i skarpe avhending og platen i avhending av biologisk farlige materialer.Etter separasjonen av elektroforese, kontroller kjørefilene for immunreaktivitetstopper av antigener ved 40 til 43 kilodaltonn som står for fosforylert eukaryotisk oversettelsesinitieringsfaktor 2A. Der molekylvektstopper av denne størrelsen mangler, høyreklikker du under kurven og velger legg til molekylvekt til topps for å sikre at størrelsene og vilkårlige mengdene under kurven registreres. Innenfor de uprivisjoner vevsprøver, bindende amino globulin proteinnivåer i kjernene av den ensomme spor er betydelig høyere sammenlignet med alle de andre regionene.Priming av tarmvevet med kolostrum reduserer bindende aminoglobulinproteinnivåer i kjernene i det ensomme sporet og har ingen effekt på paraventrikulær kjerner og superoptiske kjerner. Omvendt øker priming bindende aminoglobulinproteinnivåer i cortex, striation kjerner, og mediale preoptiske kjerner i forhold til det ukormede vevet, noe som innebærer at bindende aminoglobulinproteinnivåer i de ulike testede hjernekjernene reagerer annerledes på tarmpriming, og det er ennå ingen demonstrert krysstale mellom de ulike kjernene som er testet. Eukaryotisk oversettelsesinitieringsfaktor 2A og fosforylert eukaryotisk oversettelsesinitieringsfaktor 2A-nivåer er forhøyet i den uprimerte tilstanden i forhold til andre kjerner.Etter grunning reduseres nivåene av både eukaryotisk oversettelsesinitieringsfaktor 2A og fosforylert eukaryotisk oversettelsesinitieringsfaktor 2A i forhold til kjerner i det ensomme sporet sammenlignet med upr. vev. I alle andre testede kjerner øker grunning nivåene av eukaryotisk oversettelsesinitieringsfaktor 2A og fosforylert eukaryotisk oversettelsesinitieringsfaktor 2A i forhold til uprimektet vev. Imidlertid er nivåene av fosforylert protein kinasereseptor lav i uprimerte prøver i forhold til primede prøver i kjerner av det ensomme sporet, noe som tyder sterkt på at en annen kinase er involvert i fosforylering av eukaryotisk oversettelsesinitieringsfaktor 2A.Etter utviklingen banet denne teknikken vei for forskere innen postnatal utvikling for å utforske signalveiene som er involvert i vevsvekst og differensiering, og om de er påvirket av eller uavhengig av suckling. Ikke glem at arbeid med flyktige reduksjonsmidler som for eksempel dithiothreitol, kan være farlig, og forholdsregler som forberedelse i den kjemiske hetten bør alltid tas når du forbereder denne prosedyren.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

Trichuris muris is a natural pathogen of mice and is biologically and antigenically similar to species of Trichuris that 
infect humans and livestock1. ...

Assessing Somatic Hypermutation in Ramos B Cells after Overexpression or Knockdown of Specific Genes

Vurdering av Somatiske Hypermutation i Ramos B celler etter Overuttrykte eller knockdown av spesifikke gener

B cells start their life with low affinity antibodies generated by V(D)J recombination.  However, upon detecting a pathogen, the variable (V) region of an ...

Primary Microglia Isolation from Mixed Glial Cell Cultures of Neonatal Rat Brain Tissue

Primær microglia Isolasjon fra Blandede glial cellekulturer fra Neonatal Rat hjernevev

Microglia account for approximately 12% of the  total cellular population in the mammalian brain. While neurons and astrocytes are considered  the major ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Dyrking Microglia fra Neonatal og voksne sentralnervesystemet

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Non-invasiv Model of Neuropathogenic<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Infeksjon i Neonatal Rat

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induksjon av murine tarmbetennelse etter adoptiv overføring av Effector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Høy</sup&gt; T-celler i immundefekte mus

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Vurdere Netthinne microglial fagocyttfunksjon<em&gt; I Vivo</em&gt; Ved hjelp av en flowcytometrisystemer basert analyse

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Immunofluorescence Analysis of Stress Granule Formation After Bacterial Challenge of Mammalian Cells

Immunofluorescensanalyse av stress-granulatdannelse etter bakteriell utfordring av mammalceller

Fluorescent imaging of cellular components is an effective tool to investigate host-pathogen interactions. Pathogens can affect many different features of ...