Name: assessing cellular stress and inflammation in discrete oxytocin-secreting brain nuclei in the neonatal rat before and after first colostrum feeding
Uploaded: 2018-11-14T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Cellular Stress and Inflammation in Discrete Oxytocin-secreting Brain Nuclei in the Neonatal Rat Before and After First Colostrum Feeding at JoVE.co

Os autores agradecer Manon Ranger e Alexandra Schulz por sua assistência na elaboração deste protocolo.

Este estudo foi aprovado pelo cuidado de Animal institucional e comissões de uso na Universidade de Columbia e o Instituto de Psiquiatria de Nova York estado.
1. tecido preparação
<ol><li>Ordem cronometrado de ratos grávidos de fornecedor.</li>
	<li>Siga cronometrado de ratos grávidos observando seus abdomens crescentes nas semanas após a sua chegada e posteriormente procurando por filhotes na data prevista de entrega inspecionando a gaiola cada 2h até entrega começa.</li>
	<li>Remov...

<ol>
	<li>Hietaniemi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiles+in+fetal+and+neonatal+rat+offspring+of+energy-restricted+dams.">Gene expression profiles in fetal and neonatal rat offspring of energy-restricted dams.</a> Journal of Nutrigenetics and Nutrigenomics. 2 (4-5), 173-183 (2009).</li><li>Okabe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogenous+glycine+receptor+expression+in+cortical+plate+neurons+and+Cajal-Retzius+cells+of+neonatal+rat+cerebral+cortex.">Homogenous glycine receptor expression in cortical plate neurons and Cajal-Retzius cells of neonatal rat cerebral cortex.</a> Neuroscience. 123 (3), 715-724 (2004).</li><li>Mailleux, P., Takazawa, K., Erneux, C., Vanderhaeghen, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+the+neurons+containing+inositol+1,4,5-trisphosphate+3-kinase+and+its+messenger+RNA+in+the+developing+rat+brain.">Distribution of the neurons containing inositol 1,4,5-trisphosphate 3-kinase and its messenger RNA in the developing rat brain.</a> Journal of Comparative Neurology. 327 (4), 618-629 (1993).</li><li>Carter, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxytocin+and+Human+Evolution.">Oxytocin and Human Evolution.</a> Current Topics in Behavioral Neuroscience. , (2017).</li><li>Sippel, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxytocin+and+Stress-related+Disorders:+Neurobiological+Mechanisms+and+Treatment+Opportunities.">Oxytocin and Stress-related Disorders: Neurobiological Mechanisms and Treatment Opportunities.</a> Chronic Stress (Thousand Oaks). 1, (2017).</li><li>Agnati, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspects+on+the+integrative+actions+of+the+brain+from+neural+networks+to+"brain-body+medicine".">Aspects on the integrative actions of the brain from neural networks to "brain-body medicine".</a> Journal of Receptors and Signal Transduction Research. 32 (4), 163-180 (2012).</li><li>Welch, M. G., Margolis, K. G., Li, Z., Gershon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxytocin+regulates+gastrointestinal+motility,+inflammation,+macromolecular+permeability,+and+mucosal+maintenance+in+mice.">Oxytocin regulates gastrointestinal motility, inflammation, macromolecular permeability, and mucosal maintenance in mice.</a> American Journal Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 307 (8), G848-G862 (2014).</li><li>Welch, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+developmental+regulation+of+oxytocin+(OT)+and+oxytocin+receptors+(OTR)+in+the+enteric+nervous+system+(ENS)+and+intestinal+epithelium.">Expression and developmental regulation of oxytocin (OT) and oxytocin receptors (OTR) in the enteric nervous system (ENS) and intestinal epithelium.</a> Journal of Comparative Neurology. 512 (2), 256-270 (2009).</li><li>Prakash, B. S., Paul, V., Kliem, H., Kulozik, U., Meyer, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+oxytocin+in+milk+of+cows+administered+oxytocin.">Determination of oxytocin in milk of cows administered oxytocin.</a> Analytica Chimica Acta. 636 (1), 111-115 (2009).</li><li>Solangi, A. R., Memon, S. Q., Mallah, A., Khuhawar, M. Y., Bhanger, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+separation+of+oxytocin,+norfloxacin+and+diclofenac+sodium+in+milk+samples+using+capillary+electrophoresis.">Quantitative separation of oxytocin, norfloxacin and diclofenac sodium in milk samples using capillary electrophoresis.</a> Biomedical Chromatography. 23 (9), 1007-1013 (2009).</li><li>Klein, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxytocin+modulates+markers+of+the+unfolded+protein+response+in+Caco2BB+gut+cells.">Oxytocin modulates markers of the unfolded protein response in Caco2BB gut cells.</a> Cell Stress and Chaperones. 19 (4), 465-477 (2014).</li><li>Klein, B. Y., Tamir, H., Hirschberg, D. L., Glickstein, S. B., Welch, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxytocin+modulates+mTORC1+pathway+in+the+gut.">Oxytocin modulates mTORC1 pathway in the gut.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 432 (3), 466-471 (2013).</li><li>Klein, B. Y., Tamir, H., Ludwig, R. J., Glickstein, S. B., Welch, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colostrum+oxytocin+modulates+cellular+stress+response,+inflammation,+and+autophagy+markers+in+newborn+rat+gut+villi.">Colostrum oxytocin modulates cellular stress response, inflammation, and autophagy markers in newborn rat gut villi.</a> Biochemical an Biophysical Research Communications. 487 (1), 47-53 (2017).</li><li>Donnet-Hughes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+role+of+the+intestinal+microbiota+of+the+mother+in+neonatal+immune+education.">Potential role of the intestinal microbiota of the mother in neonatal immune education.</a> Proceedings of the Nutritional Society. 69 (3), 407-415 (2010).</li><li>Perez, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+imprinting+of+the+neonatal+immune+system:+lessons+from+maternal+cells?.">Bacterial imprinting of the neonatal immune system: lessons from maternal cells?.</a> Pediatrics. 119 (3), e724-e732 (2007).</li><li>Takeda, S., Kuwabara, Y., Mizuno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentrations+and+origin+of+oxytocin+in+breast+milk.">Concentrations and origin of oxytocin in breast milk.</a> Endocrinolcia Japonica. 33 (6), 821-826 (1986).</li><li>Quintana, D. S., Outhred, T., Westlye, L. T., Malhi, G. S., Andreassen, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+oxytocin+administration+on+brain+activity:+a+systematic+review+and+meta-analysis+protocol.">The impact of oxytocin administration on brain activity: a systematic review and meta-analysis protocol.</a> Systematic Reviews. 5 (1), 205 (2016).</li><li>Dobbing, J., Sands, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+aspects+of+the+brain+growth+spurt.">Comparative aspects of the brain growth spurt.</a> Early Human Development. 3 (1), 79-83 (1979).</li><li>Orr, M. E., Garbarino, V. R., Salinas, A., Buffenstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extended+Postnatal+Brain+Development+in+the+Longest-Lived+Rodent:+Prolonged+Maintenance+of+Neotenous+Traits+in+the+Naked+Mole-Rat+Brain.">Extended Postnatal Brain Development in the Longest-Lived Rodent: Prolonged Maintenance of Neotenous Traits in the Naked Mole-Rat Brain.</a> Frontiers in Neuroscience. 10, 504 (2016).</li><li>Hansson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+quantitative+proteome+analysis+of+in+vivo+intestinal+development.">Time-resolved quantitative proteome analysis of in vivo intestinal development.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 10 (3), (2011).</li><li>Mochizuki, K., Yorita, S., Goda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+changes+in+the+jejunum+of+rats+during+the+transient+suckling-weaning+period.">Gene expression changes in the jejunum of rats during the transient suckling-weaning period.</a> Journal of Nutritional Science and Vitaminology (Tokyo). 55 (2), 139-148 (2009).</li><li>Rinaman, L., Banihashemi, L., Koehnle, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+life+experience+shapes+the+functional+organization+of+stress-responsive+visceral+circuits.">Early life experience shapes the functional organization of stress-responsive visceral circuits.</a> Physiology and Behavior. 104 (4), 632-640 (2011).</li><li>Johannes, G., Sarnow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cap-independent+polysomal+association+of+natural+mRNAs+encoding+c-myc,+BiP,+and+eIF4G+conferred+by+internal+ribosome+entry+sites.">Cap-independent polysomal association of natural mRNAs encoding c-myc, BiP, and eIF4G conferred by internal ribosome entry sites.</a> RNA. 4 (12), 1500-1513 (1998).</li><li>Rinaman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hindbrain+noradrenergic+A2+neurons:+diverse+roles+in+autonomic,+endocrine,+cognitive,+and+behavioral+functions.">Hindbrain noradrenergic A2 neurons: diverse roles in autonomic, endocrine, cognitive, and behavioral functions.</a> American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 300 (2), R222-R235 (2011).</li><li>Walker, C. D., Toufexis, D. J., Burlet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothalamic+and+limbic+expression+of+CRF+and+vasopressin+during+lactation:+implications+for+the+control+of+ACTH+secretion+and+stress+hyporesponsiveness.">Hypothalamic and limbic expression of CRF and vasopressin during lactation: implications for the control of ACTH secretion and stress hyporesponsiveness.</a> Progress in Brain Research. 133, 99-110 (2001).</li><li>Montiel-Castro, A. J., Gonzalez-Cervantes, R. M., Bravo-Ruiseco, G., Pacheco-Lopez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microbiota-gut-brain+axis:+neurobehavioral+correlates,+health+and+sociality.">The microbiota-gut-brain axis: neurobehavioral correlates, health and sociality.</a> Frontiers in Integrative Neuroscience. 7, 70 (2013).</li><li>Blevins, J. E., Ho, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+oxytocin+signaling+in+the+regulation+of+body+weight.">Role of oxytocin signaling in the regulation of body weight.</a> Reviews in Endocrine and Metabolic Disorders. 14 (4), 311-329 (2013).</li><li>Welch, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+administration+of+secretin+and+oxytocin+inhibits+chronic+colitis+and+associated+activation+of+forebrain+neurons.">Combined administration of secretin and oxytocin inhibits chronic colitis and associated activation of forebrain neurons.</a> Neurogastroenterology Motility. 22 (6), 654 (2010).</li><li>Berthoud, H. R., Neuhuber, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+chemical+anatomy+of+the+afferent+vagal+system.">Functional and chemical anatomy of the afferent vagal system.</a> Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical. 85 (1-3), 1-17 (2000).</li><li>Taniuchi, S., Miyake, M., Tsugawa, K., Oyadomari, M., Oyadomari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+stress+response+of+vertebrates+is+regulated+by+four+eIF2alpha+kinases.">Integrated stress response of vertebrates is regulated by four eIF2alpha kinases.</a> Scientific Reports. 6, 32886 (2016).</li><li>Altschuler, S. M., Bao, X. M., Bieger, D., Hopkins, D. A., Miselis, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscerotopic+representation+of+the+upper+alimentary+tract+in+the+rat:+sensory+ganglia+and+nuclei+of+the+solitary+and+spinal+trigeminal+tracts.">Viscerotopic representation of the upper alimentary tract in the rat: sensory ganglia and nuclei of the solitary and spinal trigeminal tracts.</a> Journal of Comparative Neurology. 283 (2), 248-268 (1989).</li><li>Shapiro, R. E., Miselis, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+central+neural+connections+of+the+area+postrema+of+the+rat.">The central neural connections of the area postrema of the rat.</a> Journal of Comparative Neurology. 234 (3), 344-364 (1985).</li><li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , (1997).</li><li>Nayak, R., Pintel, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+viruses+can+induce+phosphorylation+of+eIF2alpha+via+PKR+activation,+which+can+be+overcome+by+helper+adenovirus+type+5+virus-associated+RNA.">Adeno-associated viruses can induce phosphorylation of eIF2alpha via PKR activation, which can be overcome by helper adenovirus type 5 virus-associated RNA.</a> Journal of Virology. 81 (21), 11908-11916 (2007).</li><li>Zaborske, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+tRNA+charging+and+activation+of+the+eIF2+kinase+Gcn2p.">Genome-wide analysis of tRNA charging and activation of the eIF2 kinase Gcn2p.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (37), 25254-25267 (2009).</li><li>Hollis, J. H., Lightman, S. L., Lowry, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+systemic+and+visceral+sensory+information+by+medullary+catecholaminergic+systems+during+peripheral+inflammation.">Integration of systemic and visceral sensory information by medullary catecholaminergic systems during peripheral inflammation.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1018, 71-75 (2004).</li><li>Klein, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxytocin+opposes+effects+of+bacterial+endotoxin+on+ER-stress+signaling+in+Caco2BB+gut+cells.">Oxytocin opposes effects of bacterial endotoxin on ER-stress signaling in Caco2BB gut cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1860 (2), 402-411 (2016).</li><li>Kaltschmidt, B., Kaltschmidt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB+in+the+nervous+system.">NF-kappaB in the nervous system.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (3), a001271 (2009).</li></ol>

Uma técnica para microdissection Discrete, núcleos de cérebro OTR-ricos em cérebro de ratos neonatal é apresentado neste trabalho. É bem reconhecido que os neurônios são altamente especializados, mesmo dentro de núcleos bem caracterizados no cérebro. Esta abordagem altamente reprodutível para isolar núcleos específicos de OTR ricos permite que o teste de hipótese robusto. Usando a mancha ocidental automatizado, a consistência e a reprodutibilidade dos resultados foram melhoradas. Uma limitação dessa téc...

Em contraste com a nossa compreensão do desenvolvimento inicial do cérebro ocorrendo ao longo dos dias-de-semanas pós-parto, relativamente pouco é conhecido sobre a miríade de dinâmicas alterações que ocorrem nas primeiras horas de vida em ratos. Um desafio-chave tem sido o pequeno tamanho do cérebro de ratos neonatal e um requisito para ferramentas de alta tecnologia isolar regiões cerebrais discretas ou células únicas. Estudos frequentemente avaliam gene transcrição e tradução não1,2, que não dá uma firme compreensão dos níveis funcionais de moléculas sinalizadoras ativados. Outros examinam a expressão usando a imuno-histoquímica para regiões do cérebro de referência, que não permite a quantificação da expressão níveis3. Nenhum estudo até à data, analisou a ativação da sinalização de caminhos associados com colostro primeiro dos ratos, alimentação em regiões distintas do cérebro, que requer rápido isolamento e sacrifício e medição da expressão da proteína e da fosforilação de proteínas usando Western a mancha. Enquanto o cérebro microdissection é executada em cérebros maiores e mais velhos, não identificamos uma referência realizando um soco não-simples-célula cerebral em um cérebro de P0. Este trabalho apresenta um protocolo para isolar regiões restritas do cérebro neonatal usando uma técnica relativamente baixa tecnologia ponche e um Western blotting, com para medir a expressão da proteína em amostras relativamente pequenas. Este protocolo pode ser apropriado para perguntas de pesquisa que exigem a avaliação da expressão da proteína e modificações borne-translational (EG., fosforilação) nas regiões relativamente restritas de cérebros pequenos de qualquer espécie, desde que o usuário pode identificar visualmente a região do cérebro de interesse com um atlas e Marcos identificáveis.
Esta técnica foi desenvolvida para entender as mudanças que ocorrem no cérebro como resultado de colostro primeiro o neonatal dos ratos, alimentação, que é rica em ocitocina (OT). OT tem sido conhecido por sua capacidade de estimular a contração uterina e de descida de leite. No entanto, OT agora é conhecido por tocar uma ampla gama de funções na regulação de muitas funções corporais e comportamentos4. Por exemplo, OT se opõe a estresse e inflamação em conjunto com comportamentos de filiação adaptativa5, retarda o esvaziamento gástrico e diminui o trânsito intestinal. Receptores de OT (OTR) foram identificados em neurônios entéricos e epitélio intestinal6,7,8. Os efeitos gastrointestinais do OT são particularmente importantes para a criança durante o período pós-natal. Por exemplo, o aleitamento materno está associado com a entrega de quantidades significativas de OT para o intestino neonatal9,10, e os dados mostram que o OTR é fortemente overexpressed em vilosidades duodenais durante o leite Leitão período8.
Experimentos in vitro usando uma linhagem de células do intestino têm demonstrado a nível celular, a ocitocina modula moléculas importantes na tensão sinalização via11,12 e desempenha um papel regulador na tradução das proteínas 12. estes estudos sugerem que componentes do leite, incluindo ocitocina exógena da mãe, são importantes na resposta unfolded da proteína em recém-nascidos para reduzir o estresse celular13.
Estudos in vivo e ex vivo demonstraram que o colostro OT modula os marcadores de estresse celular autofagia, inflamação e resposta em vilosidades do intestino de rato recém-nascido. Enterócitos recém-nascido sofrem estresse celular substancial do seu lado luminal quando o intestino é exposto simultaneamente a microbiota da mãe no colostro14,15 e inúmeras proteínas, inclusive hormônios como OT9 , 10 , 16.
Os efeitos de OT no cérebro foram estudados17. No entanto, não foram estudados os mecanismos de sinalização OT demonstrados no intestino durante o período pós-natal do cérebro. Neste trabalho, um método para isolar núcleos cerebrais discretas no tronco cerebral neonatal rato e hipotálamo usando electroforese é usado para perfil de regiões isoladas do cérebro. O objectivo geral deste método é capturar o estado de sinalização em áreas do cérebro mais próximo possível ao nascimento, antes e após o primeiro leite Leitão, no tecido do cérebro com o índice mais baixo gliais/neuronal da pilha. A justificativa para o desenvolvimento desta técnica é que ela permite o isolamento rápido de regiões do cérebro microscópico, restrito em neonatais filhotes com uma coleção mais homogênea de neurônios para estudos ex vivo usando uma mancha ocidental automatizado metodologia, oferecendo resultados altamente consistentes em amostras relativamente pequenas dissecados. Uma lacuna de trabalhos anteriores inclui mais bruta dissecção (fatias de cérebro ou todo o cérebro) e mais velhos animais18,19. Os cérebros dos filhotes são incrivelmente dinâmicos, apresentando ondas de diferenciação glial após o nascimento. Para estudar alterações cerebrais influenciadas pela filhotes da primeira mamada, estudar núcleos neuronais restritos com dissecação reprodutível é necessário.
Alimentação de leite geralmente é analisada pelo seu impacto imunológico e nutricional na saúde ou gene expressão (por exemplo, em enterócitos20,21), Considerando que seu efeito sobre as áreas do cérebro durante o desenvolvimento do cérebro raramente é estudado. O efeito de trânsito leite no intestino na função cerebral foi analisado em referência ao intestino colecistocinina receptores vagais relé de núcleos do tronco cerebral, mas não a vias de sinalização intracelular22. Há uma vasta literatura sobre a vulnerabilidade do cérebro em desenvolvimento em recém-nascidos, a desnutrição das mães durante a gravidez23, mas os sinais de estresse e inflamação não são abordados. Importante, o método atual aproveita-se de um fenômeno em recém-nascidos de dia-zero rato que isola os estímulos de sangue-nascido colostro de relé vagal de estímulos viscerais. Este é o período de estresse chamados hipo-responsividade caracterizado por núcleo imaturo tractus solitarius (NTS)-circuito hipotálamo imediatamente após o nascimento24,,25 que restringe NTS, núcleo paraventricular (PVN), e núcleo supra-óptico (filho) sinaliza a estímulos de sangue-nascido.
Este método é útil para a análise de múltiplas vias de sinalização e relativamente restrito de células neuronais, desde que o tecido cerebral é colhido em dia-0 pós-natal em ratos, além de se as mães têm sido desafiadas ou não por qualquer tipo de tratamento durante a gravidez. Ninhadas podem ser analisadas para os efeitos do colostro versus pré-alimentação sinalização de alimentação. Ao comparar os sinais entre áreas do cérebro com pobres versus rendimento de proteína rica, esse método permite que no capilar determinação de proteína total das bandas polipeptídeo em capilares funcionam a paralelas imune-quantificação de antígenos da proteína. Esse método permite a comparação quantitativa, utilizando unidades arbitrárias, dos resultados obtidos pelo mesmo anticorpo sem curvas padrão quantitativos e por referência a proteína total por capilar. Comparar os resultados obtidos por diferentes anticorpos é possível apenas usando curvas padrão quantitativas.
Este método permitiu a avaliação de bidirecional sinalização ocorrendo entre o intestino e o cérebro e que pode afetar a função em ambos os órgãos,26. A associação entre a ingestão de oxitocina e comida, que tem sido extensivamente estudada em anos recentes27, suporta uma ligação entre a disponibilidade de nutrientes e aumento de ocitocina sinalização. Estes estudos também suportam o conceito de inverso essa energia os défices são acoplados com reduções na sinalização hipotalâmica ocitocina.
Uns estudos mais adiantados do efeito da OT na atividade cerebral demonstraram que inflamação induzida intestino suscitou cFos transcrição no hipotálamo córtex PVN, amígdala e piriform que era refratário a vagotomia28. No entanto, a infusão sistêmica de OT com secretina diminuiu a resposta de cFos do cérebro para a reação inflamatória provocada no intestino28. Isto sugere que o efeito de OT exógena foi realizado por rotas excepto relés vagais, possivelmente através de moléculas sinalizadoras transmitidas pelo sangue, realizadas através da área postrema6,29.
Neste estudo, as vias de sinalização celular stress que tenham observado anteriormente no intestino foram avaliadas no cérebro. A hipótese era de que componentes do leite podem proteger ou adiar o efeito da inflamação na permeabilidade do intestino para metabólitos microbianos e outros, e por sua vez, os efeitos sobre o funcionamento do cérebro. As diferenças claras antagônicas de IkB contra BiP sinalização encontrada nas vilosidades, antes e depois da escorva pelo colostro13, sugeriram que os cérebros de recém-nascidos, ainda no processo de desenvolvimento, podem sentir esses sinais do intestino induzida pelo colostro.
Marcadores de proteína sinalização utilizados em experiências anteriores do intestino que estão associadas com o estresse de retículo endoplasmático foram medidos. Eles incluem o acompanhante ER BiP, eIF2a de fator de iniciação de tradução (que serve como uma resposta de estresse do integrador30), eIF2a quinase p-PKR e duas proteínas de sinalização de inflamação (NF-kB e seu inibidor, IkB).
Foram escolhidas seis regiões do cérebro com base na sua capacidade em adultos secretam ou responder a OT. O NTS, localizado a medula superior, é o primeiro relé da entrada visceral e recebe sinalização direta de neurônios sensoriais vagais no intestino31 e possivelmente sangue-nascido citocinas, toxinas e hormônios através da área adjacente-postrema32. O PVN, núcleo supra-óptico (filho), núcleos striatum (STR), córtex cerebral (CX) e núcleo preóptica medial (MPO) recebem sinalização do intestino através da NTS.
Os resultados mostraram que a resposta ao estresse celular durante o período pós-natal imediato antes da escorva de colostro e imediatamente após a primeira mamada é diferente no NTS comparado ao PVN e filho. Sinalização em CX, STR e MPO diferiam do PVN e filho, também. As distintas funções protectoras das OT mostrado anteriormente para modular o estresse celular e inflamação no intestino são provavelmente sentiu por algumas áreas do cérebro. Coletivamente, os dados indicam que a nível celular, durante as primeiras horas após o nascimento, o cérebro responde ao estresse metabólico associado com insuficiência de nutrientes. Os dados também mostram que a extensão e a direção dos efeitos modulando o colostro alimentar dependem da região e que em algumas regiões, espelho efeitos OT mostrados anteriormente no intestino.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bradford solution</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein lysis kit</td>
			<td>Protein simple</td>
			<td>CBS403</td>
			<td>Bicine/CHAPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WES kits</td>
			<td>Protein simple</td>
			<td>WES-Mouse 12-230 master kit (PS-MK15), WES-Rabbit 12-230 master kit (PS-MK14), WES 12-230 kDa total Protein master kit (PS-TP07)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse IgG HRP conjugate</td>
			<td>Protein simple</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-phospho-eIF2a</td>
			<td>Cell Signaling technology</td>
			<td>SER51, 9721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse mAb anti-PKR</td>
			<td>Cell Signaling technology</td>
			<td>2103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-phospho-PKR</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Thr451, 07-886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit mAb anti-PKR</td>
			<td>Cell Signaling technology</td>
			<td>12297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit mAb anti-GAPDH</td>
			<td>Cell Signaling technology</td>
			<td>2118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse mAb anti-phospho-IKB</td>
			<td>Cell Signaling technology</td>
			<td>9246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse mAb anti-IKB</td>
			<td>Cell Signaling technology</td>
			<td>4814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-BiP</td>
			<td>Cell Signaling technology</td>
			<td>3183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti GCN2</td>
			<td>Cell Signaling technology</td>
			<td>3302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit mAb anti-phospho-GCN2</td>
			<td>BIORBYT</td>
			<td>T899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pregnant Sprague-Dawley rats</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Punch device</td>
			<td>WellTech Rapid Core or Harris Uni-Core</td>
			<td>0.35, 0.50, 0.75, 1.0, 1.20, 1.50</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing cellular stress and inflammation in discrete oxytocin-secreting brain nuclei in the neonatal rat before and after first colostrum feeding

O objetivo do presente protocolo é isolar núcleos de cérebro ricas de receptores de ocitocina no cérebro neonatal antes e depois da primeira mamada do colostro. A expressão de proteínas conhecidas para responder ao estresse metabólico foi medida em cérebro-núcleos isolados usando a mancha ocidental. Isso foi feito para avaliar se induzida por estresse metabólica insuficiência nutriente no corpo provocado estresse neuronal. Demonstramos anteriormente que a insuficiência de nutrientes em recém-nascidos provoca estresse metabólico no intestino. Além disso, a ocitocina colostro modula marcadores de estresse celular autofagia, inflamação e resposta em vilosidades do intestino de rato recém-nascido antes e depois da primeira alimentação. Sinalização de marcadores de proteínas associadas com o estresse de retículo endoplasmático [ER acompanhante imunoglobulina proteína (BiP), 2A de fator de iniciação eucariótico tradução (eIF2a) e quinase da proteína quinase eIF2a R (p-PKR)], bem como dois sinalização de inflamação proteínas [fator nuclear-κB (NF-kB) e inibidor κB (IkB)], foram medidos em núcleos do cérebro recém-nascido [núcleo do trato solitário (NTS), núcleo paraventricular (PVN), núcleo supraóptico (filho), córtex (CX), núcleos striatum (STR), e núcleo preóptica medial (MPO)] antes do primeiro feed (unprimed pelo colostro) e após o início da enfermagem (preparado pelo colostro). Expressão de BiP/GRP78 e p-eIF2a foram upregulated em unprimed e ativador em tecido NTS condicionado. NF-kB foi mantida (alta) no citoplasma CX, STR e MPO, Considerando que o NF-kB foi inferior e inalterado no NTS, PVN e filho em ambas as condições. O BiP coletiva e p-eIF2 achados são consistentes com uma resposta ao estresse. eIf2a foi fosforilada pela quinase dependente do dsRNA (p-PKR) no filho, CX, STR e MPO. No entanto, no NTS (e em menor medida no PVN), eIf2a foi fosforilada pela outra quinase, quinase de controle geral nonderepressible-2 (GCN2). Os mecanismos de estresse-modulando anteriormente observados em enterócitos do intestino recém-nascido parecem ser espelhado em algumas regiões do cérebro ricas OTR. A NTS e PVN podem utilizar um mecanismo de fosforilação diferente (sob deficiência nutricional) de outras regiões e ser refratário ao impacto da insuficiência de nutrientes. Coletivamente, estes dados sugerem que respostas do cérebro ao estresse de insuficiência de nutrientes são compensadas por sinalização de colostro-aprontadas enterócitos.

As bandas representativas da imunorreatividade em relação à proteína total mostram que existem núcleos de cérebro com muito baixa proteína colhido. Isso requer o uso da técnica automatizada de Western blot, que é altamente sensível em comparação com o borrão ocidental canônico. Esta abordagem pode ser executada com fortyfold menos proteína por capilar em comparação com o por-lane em borrões ocidentais.
Efeitos dif...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Cellular Stress and Inflammation in Discrete Oxytocin-secreting Brain Nuclei in the Neonatal Rat Before and After First Colostrum Feeding at JoVE.co

Assessing Cellular Stress and Inflammation in Discrete Oxytocin-secreting Brain Nuclei in the Neonatal Rat Before and After First Colostrum Feeding

Avaliação de estresse celular e inflamação em discreta secretoras de ocitocina núcleos de cérebro em ratos Neonatal antes e depois da primeira mamada do colostro

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar núcleos de cérebro em cérebro de ratos neonatal, em conjunto com a primeira mamada do colostro. Esta técnica permite o estudo do stress de insuficiência de nutrientes no cérebro como modulada por sinalização do enterócito.

The goal of this protocol is to isolate oxytocin-receptor rich brain nuclei in the neonatal brain before and after first colostrum feeding. The expression ...

Este método pode ajudar a responder perguntas-chave no campo de desenvolvimento pós-natal sobre a forma como a amamentação do leite influencia a sinalização de estresse no cérebro. Esta técnica pode ser usada para capturar áreas cerebrais específicas durante o primeiro período natural de fome e compará-las com respectivas áreas logo após a primeira alimentação natural do colostro. Entender como mamar influencia a fisiologia do comportamento e da emoção permite o uso de um antagonista a vários receptores durante a análise do tecido cerebral ex-vivo.Para obter os socos dos núcleos, remova os filhotes de rato pela cauda com uma mão enluvada. Depois de colher o cérebro, coloque rapidamente todo o órgão em um molde cerebral de metacrilato de polimetil à temperatura ambiente e use imediatamente uma nova lâmina de barbear para fazer fatias de 500 micrômetros de espessura do tecido. Coloque as fatias rostral para caudal em uma placa de Petri como elas são obtidas para manter a orientação correta das seções.Quando todo o cérebro for seccionado, adicione rapidamente fluido espinhal cerebral artificial sem glicose ao prato e incuba as fatias por 60 minutos a 28 a 30 graus Celsius com agitação constante em um agitador orbital. Use um atlas cerebral e marcos anatômicos em cada tecido para identificar os núcleos cerebrais a serem perfurados e colocar a fatia com os núcleos de interesse em uma nova placa de Petri sob um microscópio dissecando. Uma vez visualizado, use uma ferramenta de coring para perfurar rapidamente quatro a seis núcleos diferentes e imergir rapidamente cada núcleo perfurado em 0,06 mL de tampão de extração de proteína gelada no tubo de microcrífugo apropriadamente rotulado contendo inibidores de protes e inibidores de fosfatase por 60 minutos.No final da incubação, centrifugar os núcleos extraídos em uma mini centrífuga resfriada, e usar uma micro-pipeta para transferir cuidadosamente 0,055 mL de supernacer de cada tubo para o tubo de microcrédito de 1,5 mL pré-resfriado apropriado no gelo. Antes do armazenamento negativo de 20 graus Celsius, transfira 0,012 mL de supernadante de cada tubo de estoque de proteínas para o tubo pré-resfriado apropriado de 0,5 mL no gelo para a primeira preparação da amostra. Para preparar as amostras para a medição da proteína in-capilar, adicione 0,003 mL de reagente de mistura mestre de um kit de lise proteica a cada uma das amostras nos tubos rotulados de 0,5 mL.Em seguida, adicione 0,004 mL de reagente de mistura mestre a uma solução de escada de peso molecular biotinína em 0,016 mL de água desionizada, e desnaturar as amostras de extrato de escada e proteína em um bloco de calor de 95 graus Celsius, armazenando todos os tubos a quatro graus Celsius após cinco minutos. Para análise de proteína de sinal, adicionar 0,01 mL de solução de peróxido de luminol recém-preparada aos poços E-1 a E-25 de uma nova placa ocidental automatizada, 0,01 mL de anticorpo anti-rato secundário aos poços D-2 a D-25, e adicionar 0,01 mL de peroxidase de rabanete streptavidin do kit para bem D-1. Adicione 0,01 mL de anticorpo primário recém-preparado nos poços C-2 a C-25, e 0,01 mL de anticorpo diluiente duas soluções para os poços C-1 e B-1 a B-25.Deixe os poços F de linha vazios e encha os cinco compartimentos das três linhas abaixo da linha F com 0,45 mL de tampão de lavagem. Em seguida, gire brevemente as amostras refrigeradas por 30 segundos e adicione 0,03 mL de cada amostra a cada poço da linha A, começando com A-2. Em seguida, adicione 0,005 mL da escada de peso molecular biotinilada até bem A-1 e cubra a placa para centrifugação.Enquanto a placa é centrifugada, abra um novo arquivo de execução no software associado ocidental automatizado e inicie um ensaio de tamanho molecular. Na página de ensaio, insira os nomes da amostra em cada capilar, bem como os nomes dos anticorpos primários e secundários. No final da centrifugação, coloque a placa no instrumento ocidental automatizado e retire a tampa da caixa do cartucho capilar.Após a centrifugação, não se esqueça de inspecionar bolhas de ar, pois bolhas de ar no capilar podem bloquear a corrente eletroforética e falhar toda a rodada. Insira o cartucho na posição designada dentro do instrumento e feche a porta. Clique em iniciar.Quando solicitado com o tipo de ensaio, digite o nome do experimento na caixa de texto apropriada e clique em ok. Quando solicitado pela data de execução ativada e pelo número de identificação no arquivo de execução, anote o momento em que a execução termina. No final da corrida, descarte o cartucho capilar no descarte de nitidez e a placa no descarte de materiais de risco biológico.Após a separação da eletroforese, verifique os arquivos de execução para picos de reatividade imunológica de antígenos em 40 a 43 kilodaltons que representam o fator de iniciação da tradução eucariótica fosforilado 2A. Onde faltam picos de peso molecular deste tamanho, clique com o botão direito do mouse abaixo da curva e selecione adicionar peso molecular ao pico para garantir que os tamanhos e quantidades arbitrárias abaixo da curva sejam registrados. Dentro das amostras de tecido unprimeds, os níveis de proteína de amino globulina nos núcleos da pista solitária são significativamente maiores em comparação com todas as outras regiões.A escorraça do tecido intestinal com colostro diminui os níveis de proteína de amino globulina nos núcleos da pista solitária e não tem efeito sobre núcleos paraventriculares e núcleos super-ópticos. Por outro lado, o escoramento aumenta os níveis de proteína de amino globulina de ligação dentro do córtex, núcleos de estriação e núcleos preópticos medial em relação ao tecido não primogêntico, implicando que os níveis de proteína de amino globulina nos vários núcleos cerebrais testados respondem de forma diferente ao estripamento intestinal e ainda não há qualquer conversa cruzada demonstrada entre os vários núcleos testados. Fator de iniciação da tradução eucariótica 2A e fator de iniciação de tradução eucariótica fosforilado fator 2A são elevados na condição não primogêntica em relação a outros núcleos.Após o priming, os níveis de iniciação de tradução eucariótica 2A e fator de iniciação de tradução eucariótica fosforilado 2A são reduzidos em relação aos núcleos da faixa solitária em comparação com o tecido não primogênito. Em todos os outros núcleos testados, o priming aumenta os níveis de iniciação de tradução eucariótica 2A e fator de iniciação de tradução eucariótica 2A em relação ao tecido não primogênito. No entanto, os níveis de receptor de proteína fosfoilada quinase são baixos em amostras não primed em relação a amostras preparadas em núcleos da faixa solitária, sugerindo fortemente que outra quinase está envolvida na fosforilação do fator de iniciação de tradução eucariótica 2A.Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores do campo do desenvolvimento pós-natal explorarem as vias de sinalização envolvidas no crescimento e diferenciação tecidual e se são influenciadas ou independentes da amamentação. Não se esqueça que trabalhar com agentes de redução voláteis como, por exemplo, dithiothreitol, pode ser perigoso, e precauções como a preparação na capa química devem ser sempre tomadas na preparação deste procedimento.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Seven Steps to Stellate Cells

Sete Passos para Stellate Células

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Imunologia e Infecção

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

Trichuris Muris Infecção: Um Modelo de imunidade do tipo 2 e inflamação no intestino

Trichuris muris is a natural pathogen of mice and is biologically and antigenically similar to species of Trichuris that 
infect humans and livestock1. ...

Assessing Somatic Hypermutation in Ramos B Cells after Overexpression or Knockdown of Specific Genes

Avaliação de mutação somática em células B Ramos, após superexpressão ou Knockdown de genes específicos

B cells start their life with low affinity antibodies generated by V(D)J recombination.  However, upon detecting a pathogen, the variable (V) region of an ...

Primary Microglia Isolation from Mixed Glial Cell Cultures of Neonatal Rat Brain Tissue

Isolamento Microglia primária a partir de cultura mista de células gliais de tecido de cérebro de rato neonatal

Microglia account for approximately 12% of the  total cellular population in the mammalian brain. While neurons and astrocytes are considered  the major ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia cultura do Sistema Nervoso Central Neonatal e Adulto

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Modelo não-invasiva da neuropatogênicos<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Infecção no Rato Neonatal

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolamento de Salmonella typhimurium-contendo Phagosomes de macrófagos

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

Avaliar a resposta imune celular de mosca da fruta, Drosophila melanogaster, usando um ensaio de fagocitose em Vivo

In all animals, innate immunity provides an immediate and robust defense against a broad spectrum of pathogens. Humoral and cellular immune responses are ...

Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA

Transfecção altamente eficiente de macrófagos primários com mRNA Transcrito in vitro

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern ...

Blocking Lymph Flow by Suturing Afferent Lymphatic Vessels in Mice

Bloqueando o fluxo linfático suturing afferent vasos linfáticos em camundongos

Lymphatic vessels are critical in maintaining tissue fluid balance and optimizing immune protection by transporting antigens, cytokines, and cells to ...