Name: assessing cellular stress and inflammation in discrete oxytocin-secreting brain nuclei in the neonatal rat before and after first colostrum feeding
Uploaded: 2018-11-14T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Cellular Stress and Inflammation in Discrete Oxytocin-secreting Brain Nuclei in the Neonatal Rat Before and After First Colostrum Feeding at JoVE.co

Авторы благодарят Manon Рейнджер и Александра Шульц за их помощь в подготовке настоящего Протокола.

Это исследование был одобрен институциональный уход животных и использование комитетами в Колумбийском университете и в Нью-Йорке психиатрических государственный институт.
1. Подготовка тканей
<ol><li>Приказ приурочен беременных крыс от поставщика.</li>
	<li>Следуйте приуро...

<ol>
	<li>Hietaniemi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiles+in+fetal+and+neonatal+rat+offspring+of+energy-restricted+dams.">Gene expression profiles in fetal and neonatal rat offspring of energy-restricted dams.</a> Journal of Nutrigenetics and Nutrigenomics. 2 (4-5), 173-183 (2009).</li><li>Okabe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogenous+glycine+receptor+expression+in+cortical+plate+neurons+and+Cajal-Retzius+cells+of+neonatal+rat+cerebral+cortex.">Homogenous glycine receptor expression in cortical plate neurons and Cajal-Retzius cells of neonatal rat cerebral cortex.</a> Neuroscience. 123 (3), 715-724 (2004).</li><li>Mailleux, P., Takazawa, K., Erneux, C., Vanderhaeghen, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+the+neurons+containing+inositol+1,4,5-trisphosphate+3-kinase+and+its+messenger+RNA+in+the+developing+rat+brain.">Distribution of the neurons containing inositol 1,4,5-trisphosphate 3-kinase and its messenger RNA in the developing rat brain.</a> Journal of Comparative Neurology. 327 (4), 618-629 (1993).</li><li>Carter, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxytocin+and+Human+Evolution.">Oxytocin and Human Evolution.</a> Current Topics in Behavioral Neuroscience. , (2017).</li><li>Sippel, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxytocin+and+Stress-related+Disorders:+Neurobiological+Mechanisms+and+Treatment+Opportunities.">Oxytocin and Stress-related Disorders: Neurobiological Mechanisms and Treatment Opportunities.</a> Chronic Stress (Thousand Oaks). 1, (2017).</li><li>Agnati, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspects+on+the+integrative+actions+of+the+brain+from+neural+networks+to+"brain-body+medicine".">Aspects on the integrative actions of the brain from neural networks to "brain-body medicine".</a> Journal of Receptors and Signal Transduction Research. 32 (4), 163-180 (2012).</li><li>Welch, M. G., Margolis, K. G., Li, Z., Gershon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxytocin+regulates+gastrointestinal+motility,+inflammation,+macromolecular+permeability,+and+mucosal+maintenance+in+mice.">Oxytocin regulates gastrointestinal motility, inflammation, macromolecular permeability, and mucosal maintenance in mice.</a> American Journal Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 307 (8), G848-G862 (2014).</li><li>Welch, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+developmental+regulation+of+oxytocin+(OT)+and+oxytocin+receptors+(OTR)+in+the+enteric+nervous+system+(ENS)+and+intestinal+epithelium.">Expression and developmental regulation of oxytocin (OT) and oxytocin receptors (OTR) in the enteric nervous system (ENS) and intestinal epithelium.</a> Journal of Comparative Neurology. 512 (2), 256-270 (2009).</li><li>Prakash, B. S., Paul, V., Kliem, H., Kulozik, U., Meyer, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+oxytocin+in+milk+of+cows+administered+oxytocin.">Determination of oxytocin in milk of cows administered oxytocin.</a> Analytica Chimica Acta. 636 (1), 111-115 (2009).</li><li>Solangi, A. R., Memon, S. Q., Mallah, A., Khuhawar, M. Y., Bhanger, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+separation+of+oxytocin,+norfloxacin+and+diclofenac+sodium+in+milk+samples+using+capillary+electrophoresis.">Quantitative separation of oxytocin, norfloxacin and diclofenac sodium in milk samples using capillary electrophoresis.</a> Biomedical Chromatography. 23 (9), 1007-1013 (2009).</li><li>Klein, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxytocin+modulates+markers+of+the+unfolded+protein+response+in+Caco2BB+gut+cells.">Oxytocin modulates markers of the unfolded protein response in Caco2BB gut cells.</a> Cell Stress and Chaperones. 19 (4), 465-477 (2014).</li><li>Klein, B. Y., Tamir, H., Hirschberg, D. L., Glickstein, S. B., Welch, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxytocin+modulates+mTORC1+pathway+in+the+gut.">Oxytocin modulates mTORC1 pathway in the gut.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 432 (3), 466-471 (2013).</li><li>Klein, B. Y., Tamir, H., Ludwig, R. J., Glickstein, S. B., Welch, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colostrum+oxytocin+modulates+cellular+stress+response,+inflammation,+and+autophagy+markers+in+newborn+rat+gut+villi.">Colostrum oxytocin modulates cellular stress response, inflammation, and autophagy markers in newborn rat gut villi.</a> Biochemical an Biophysical Research Communications. 487 (1), 47-53 (2017).</li><li>Donnet-Hughes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+role+of+the+intestinal+microbiota+of+the+mother+in+neonatal+immune+education.">Potential role of the intestinal microbiota of the mother in neonatal immune education.</a> Proceedings of the Nutritional Society. 69 (3), 407-415 (2010).</li><li>Perez, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+imprinting+of+the+neonatal+immune+system:+lessons+from+maternal+cells?.">Bacterial imprinting of the neonatal immune system: lessons from maternal cells?.</a> Pediatrics. 119 (3), e724-e732 (2007).</li><li>Takeda, S., Kuwabara, Y., Mizuno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentrations+and+origin+of+oxytocin+in+breast+milk.">Concentrations and origin of oxytocin in breast milk.</a> Endocrinolcia Japonica. 33 (6), 821-826 (1986).</li><li>Quintana, D. S., Outhred, T., Westlye, L. T., Malhi, G. S., Andreassen, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+oxytocin+administration+on+brain+activity:+a+systematic+review+and+meta-analysis+protocol.">The impact of oxytocin administration on brain activity: a systematic review and meta-analysis protocol.</a> Systematic Reviews. 5 (1), 205 (2016).</li><li>Dobbing, J., Sands, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+aspects+of+the+brain+growth+spurt.">Comparative aspects of the brain growth spurt.</a> Early Human Development. 3 (1), 79-83 (1979).</li><li>Orr, M. E., Garbarino, V. R., Salinas, A., Buffenstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extended+Postnatal+Brain+Development+in+the+Longest-Lived+Rodent:+Prolonged+Maintenance+of+Neotenous+Traits+in+the+Naked+Mole-Rat+Brain.">Extended Postnatal Brain Development in the Longest-Lived Rodent: Prolonged Maintenance of Neotenous Traits in the Naked Mole-Rat Brain.</a> Frontiers in Neuroscience. 10, 504 (2016).</li><li>Hansson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+quantitative+proteome+analysis+of+in+vivo+intestinal+development.">Time-resolved quantitative proteome analysis of in vivo intestinal development.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 10 (3), (2011).</li><li>Mochizuki, K., Yorita, S., Goda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+changes+in+the+jejunum+of+rats+during+the+transient+suckling-weaning+period.">Gene expression changes in the jejunum of rats during the transient suckling-weaning period.</a> Journal of Nutritional Science and Vitaminology (Tokyo). 55 (2), 139-148 (2009).</li><li>Rinaman, L., Banihashemi, L., Koehnle, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+life+experience+shapes+the+functional+organization+of+stress-responsive+visceral+circuits.">Early life experience shapes the functional organization of stress-responsive visceral circuits.</a> Physiology and Behavior. 104 (4), 632-640 (2011).</li><li>Johannes, G., Sarnow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cap-independent+polysomal+association+of+natural+mRNAs+encoding+c-myc,+BiP,+and+eIF4G+conferred+by+internal+ribosome+entry+sites.">Cap-independent polysomal association of natural mRNAs encoding c-myc, BiP, and eIF4G conferred by internal ribosome entry sites.</a> RNA. 4 (12), 1500-1513 (1998).</li><li>Rinaman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hindbrain+noradrenergic+A2+neurons:+diverse+roles+in+autonomic,+endocrine,+cognitive,+and+behavioral+functions.">Hindbrain noradrenergic A2 neurons: diverse roles in autonomic, endocrine, cognitive, and behavioral functions.</a> American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 300 (2), R222-R235 (2011).</li><li>Walker, C. D., Toufexis, D. J., Burlet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothalamic+and+limbic+expression+of+CRF+and+vasopressin+during+lactation:+implications+for+the+control+of+ACTH+secretion+and+stress+hyporesponsiveness.">Hypothalamic and limbic expression of CRF and vasopressin during lactation: implications for the control of ACTH secretion and stress hyporesponsiveness.</a> Progress in Brain Research. 133, 99-110 (2001).</li><li>Montiel-Castro, A. J., Gonzalez-Cervantes, R. M., Bravo-Ruiseco, G., Pacheco-Lopez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microbiota-gut-brain+axis:+neurobehavioral+correlates,+health+and+sociality.">The microbiota-gut-brain axis: neurobehavioral correlates, health and sociality.</a> Frontiers in Integrative Neuroscience. 7, 70 (2013).</li><li>Blevins, J. E., Ho, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+oxytocin+signaling+in+the+regulation+of+body+weight.">Role of oxytocin signaling in the regulation of body weight.</a> Reviews in Endocrine and Metabolic Disorders. 14 (4), 311-329 (2013).</li><li>Welch, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+administration+of+secretin+and+oxytocin+inhibits+chronic+colitis+and+associated+activation+of+forebrain+neurons.">Combined administration of secretin and oxytocin inhibits chronic colitis and associated activation of forebrain neurons.</a> Neurogastroenterology Motility. 22 (6), 654 (2010).</li><li>Berthoud, H. R., Neuhuber, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+chemical+anatomy+of+the+afferent+vagal+system.">Functional and chemical anatomy of the afferent vagal system.</a> Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical. 85 (1-3), 1-17 (2000).</li><li>Taniuchi, S., Miyake, M., Tsugawa, K., Oyadomari, M., Oyadomari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+stress+response+of+vertebrates+is+regulated+by+four+eIF2alpha+kinases.">Integrated stress response of vertebrates is regulated by four eIF2alpha kinases.</a> Scientific Reports. 6, 32886 (2016).</li><li>Altschuler, S. M., Bao, X. M., Bieger, D., Hopkins, D. A., Miselis, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscerotopic+representation+of+the+upper+alimentary+tract+in+the+rat:+sensory+ganglia+and+nuclei+of+the+solitary+and+spinal+trigeminal+tracts.">Viscerotopic representation of the upper alimentary tract in the rat: sensory ganglia and nuclei of the solitary and spinal trigeminal tracts.</a> Journal of Comparative Neurology. 283 (2), 248-268 (1989).</li><li>Shapiro, R. E., Miselis, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+central+neural+connections+of+the+area+postrema+of+the+rat.">The central neural connections of the area postrema of the rat.</a> Journal of Comparative Neurology. 234 (3), 344-364 (1985).</li><li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , (1997).</li><li>Nayak, R., Pintel, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+viruses+can+induce+phosphorylation+of+eIF2alpha+via+PKR+activation,+which+can+be+overcome+by+helper+adenovirus+type+5+virus-associated+RNA.">Adeno-associated viruses can induce phosphorylation of eIF2alpha via PKR activation, which can be overcome by helper adenovirus type 5 virus-associated RNA.</a> Journal of Virology. 81 (21), 11908-11916 (2007).</li><li>Zaborske, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+tRNA+charging+and+activation+of+the+eIF2+kinase+Gcn2p.">Genome-wide analysis of tRNA charging and activation of the eIF2 kinase Gcn2p.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (37), 25254-25267 (2009).</li><li>Hollis, J. H., Lightman, S. L., Lowry, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+systemic+and+visceral+sensory+information+by+medullary+catecholaminergic+systems+during+peripheral+inflammation.">Integration of systemic and visceral sensory information by medullary catecholaminergic systems during peripheral inflammation.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1018, 71-75 (2004).</li><li>Klein, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxytocin+opposes+effects+of+bacterial+endotoxin+on+ER-stress+signaling+in+Caco2BB+gut+cells.">Oxytocin opposes effects of bacterial endotoxin on ER-stress signaling in Caco2BB gut cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1860 (2), 402-411 (2016).</li><li>Kaltschmidt, B., Kaltschmidt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB+in+the+nervous+system.">NF-kappaB in the nervous system.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (3), a001271 (2009).</li></ol>

Техника для microdissection дискретного, OTR-богатые ядер головного мозга в мозге новорожденных крыс представлена в настоящем документе. Общепризнано, что нейроны являются узкоспециализированными, даже в хорошо изученных ядер в головном мозге. Этот высоко воспроизводимый подход к изоляции оп?...

В отличие от нашего понимания раннего развития мозга, происходят в течение дней до недели после родов, относительно мало известно о множества динамических изменений, происходящих в первые часы жизни крыс. Ключевой задачей был небольшой размер мозга новорожденных крыс и требование для высокотехнологичных инструментов изолировать дискретные мозга или одиночных клеток. Исследования часто оценки гена транскрипции и трансляции не1,2, который не дает твердое понимание функциональных уровней активированного сигнальных молекул. Другие рассмотреть выражение с использованием иммуногистохимия регионов мозга ссылку, которая не позволяет для количественной оценки выражения уровня3. Никаких исследований на сегодняшний день изучило активации сигнальные пути, связанные с крыс первого молозива, кормить в дискретных мозга, которая требует быстрой изоляции и жертву и измерение выражения протеина и фосфорилирование белков с помощью Западной blotting. В то время как мозг microdissection выполняется на старых и больших мозги, мы не выявили ссылку, выполняя одну ячейку мозга удар в мозге P0. Этот документ представляет собой протокол для изоляции ограниченных регионах неонатальной мозга, используя сравнительно низкотехнологичных удар техники и западных blotting процедура для измерения выражение протеина в относительно малых выборок. Этот протокол может быть подходящим для исследования вопросов, которые требуют оценки выражения протеина и столб-поступательные изменения (например., фосфорилирование) в относительно ограниченных районах небольших мозги любых видов, при условии, что пользователь может визуально определить области мозга, представляющих интерес с атласом и идентифицировать достопримечательности.
Этот метод был разработан для понимания изменений, происходящих в головном мозге в результате первого молозива новорожденных крыс корма, который богат окситоцина (OT). OT давно известны своей способностью стимулировать сокращения матки и пусть вниз молоко. Однако OT теперь известно играть широкий спектр ролей в регуляции многих телесных функций и поведения4. К примеру OT выступает против стресса и воспаления в сочетании с адаптивной афиллиативной поведения5, задержки опорожнения желудка и замедляет кишечного транзита. OT рецепторов (OTR) были определены в кишечных нейронов и кишечного эпителия6,,78. Желудочно-кишечного тракта OT особенно важны для младенца в начале послеродового периода. К примеру грудное вскармливание ассоциируется с доставкой значительного количества OT новорожденных кишки9,10, и данные показывают, что OTR сильно оверэкспрессировали в двенадцатиперстной кишки ворсинки в молоко, молочный период8.
В vitro эксперименты с использованием линии клеток кишки продемонстрировали на клеточном уровне, что окситоцин модулирует важных молекул в стресс, сигнальный путь11,12 и играет регулирующую роль в переводе белков 12. Эти исследования показывают, что компоненты молока, включая экзогенных окситоцина от матери, имеют важное значение в ответ развернул белка у новорожденных для снижения клеточного стресса13.
В естественных условиях и ex vivo исследования показали, что молозиво OT модулирует клеточного стресса ответ, воспаления и autophagy маркеров в Вилли кишечника новорожденных крыс. Новорожденного enterocytes страдают существенной клеточного стресса на их стороне Люминал, когда кишечник одновременно подвергается микробиоты от матери в многочисленных белков, включая гормонов, таких как OT9 и молозиво14,15 , 10 , 16.
Эффекты OT на мозг были изучены17. Однако OT сигнальных механизмов, продемонстрировал в кишечнике в начале послеродового периода не были изучены в головном мозге. В этом документе метод для изоляции дискретных мозга ядер ствола мозга новорожденных крыс и гипоталамус, с помощью электрофореза используется для профилирования изолированных мозга. Общая цель этого метода является захватить состояние ячейки сигнализации в областях как можно ближе к рождения, до и после первого молочный поросенок, в ткани мозга с наименьшим индексом глиальных/нейронов мозга. Основанием для развития этой техники является, что она позволяет для быстрого изоляции регионов ограничены, микроскопические мозга новорожденных щенков с коллекцией более однородных нейронов для ex vivo исследований с использованием автоматизированных Западный blotting методология, предлагая весьма последовательной результаты на сравнительно небольшие образцы расчлененный. Недостатком предыдущие работы включает в себя более грубых диссекции (срезы мозга или весь мозг) и старых животных18,19. Мозги молодых детенышей невероятно динамичны, показывая волны глиальных дифференциации после рождения. С целью изучения мозга изменения под влиянием первого кормления щенков, необходимо изучение ограниченного нейрональных ядер с воспроизводимые рассечение.
Молочные корма обычно анализируется иммунологических и питательного воздействия на здоровье или ген выражение (например, в enterocytes20,21), тогда как редко рассматривается его влияние на областях мозга во время развития мозга. Со ссылкой на кишечнике холецистокинина рецепторов вагусной реле ядрах ствола головного мозга, но не внутриклеточных сигнальных путей22был проанализирован эффект молока транзита в кишечнике на функции мозга. Существует обширная литература на уязвимость развивающегося мозга новорожденных недоедания матерей во время беременности23, но стресс и воспаление сигналы не рассматриваются. Важно отметить, что текущий метод использует явление в день ноль крыса новорожденных, которая изолирует кровь родился молозиво раздражителей с вагусной реле висцеральных раздражителей. Это так называемые стресс гипо оперативность период характеризуется незрелых ядре tractus solitarius (НТС)-гипоталамический цепи сразу же после рождения24,25 , ограничивающий НТС, паравентрикулярного ядра (ПВН), и supraoptic ядро (сын) сигналы на крови родился стимулы.
Этот метод полезен для анализа нескольких сигнальных путей и относительно ограничена нейрональных клеток, при том условии, что ткани мозга собирают в послеродовой день-0 в крыс, помимо ли матерей были оспорены или нет, любой вид лечения во время беременности. Помета могут быть проанализированы для эффектов молозиво, кормить против предварительно питание сигнализации. При сравнении сигналов между областями мозга с бедными по сравнению с богатые белком урожайности, этот метод позволяет в капиллярной определение общего белка полипептид полос в капиллярах, параллельно иммунной количественный белков антигенов. Этот метод позволяет количественные сравнения, используя условные единицы, результаты, полученные путем же антитела без стандартных количественных кривых и ссылка на общий белок в капиллярной. Сравнение результатов, полученных различными антителами возможно только с помощью количественных стандартных кривых.
Этот метод позволил для оценки двунаправленный сигнализации, происходящих между кишечника и мозга, что может повлиять на функции в обоих органов26. Ассоциация между окситоцина и приема пищи, которая была подробно изучена в последние годы27, поддерживает связь между повышенной окситоцина сигнализации и наличия питательных веществ. Эти исследования также поддерживают концепцию Конверс эту энергию, которую дефицита связаны с сокращением гипоталамуса окситоцина сигнализации.
Более ранние исследования эффекта OT на активность мозга продемонстрировал, что воспаление индуцированных кишки вызвало cFos транскрипции в гипоталамо НДС, миндалевидного и грушевидной коры, которая была огнеупорной ваготомия28. Однако системных притока OT с секретин сократилась cFos реакции мозга на спровоцировали воспалительной реакции в кишечнике28. Это предполагает, что влияние экзогенных OT было осуществлено маршруты помимо блуждающего реле, возможно через кровь сигнальных молекул, через площадь postrema6,29.
В этом исследовании были оценены клеточного стресса сигнальных путей, которые ранее наблюдали в кишечнике в головном мозге. Гипотеза, что компоненты молока может защищать или отложить влияние воспаления на кишечнике проницаемость для микробиологических и других метаболитов, и в свою очередь, воздействие на мозг функция. Четко антагонистические различия в IkB против BiP сигнализации по направлению ворсинки, до и после грунтования молозиво13, предложил, что мозги новорожденных, все еще в процессе разработки, может смысле эти сигналы молозиво индуцированной кишки.
Сигнализации белка маркеры, используемые в предыдущих экспериментах кишки, которые связаны с эндоплазматического ретикулума стресса были измерены. Они включают ER шаперонов BiP, eIF2a фактор инициации перевода (которая служит интегратор стресс в ответ30), eIF2a киназы p-PKR и два воспаления сигнализации белков (NF-kB и его ингибитора, IkB).
Были выбраны шесть областей мозга, основанные на их способности в взрослых выделяют или реагировать ОП. НТС, расположен в верхней продолговатого мозга, первое реле висцеральных ввода и получает прямой передачи сигналов от блуждающего сенсорных нейронов в кишечнике31 возможно родился крови цитокинов, токсинов и гормоны через прилегающие области postrema32. PVN, supraoptic ядро (сын), стриатума ядер (STR), коре (CX) и медиальный preoptic ядро (МПО) получают сигналы от кишки через НТС.
Результаты показали, что реакции клеточного стресса в непосредственной послеродовой период до молозиво грунтовки и сразу же после первого кормления отличается в НТС, по сравнению с PVN и сына. Сигнализации в CX, STR и MPO отличается от НДС и сына, а также. Различные защитные функции OT было показано ранее для модуляции клетки стресс и воспалительного процесса в кишечнике скорее всего воспринимается некоторых областей головного мозга. В совокупности данные указывают, что на клеточном уровне, в течение первых часов после рождения, мозг реагирует на метаболический стресс, связанный с недостаточностью питательных веществ. Данные также показывают, что масштабы и направления регулирования последствий кормить молозивом зависят от региона и что в некоторых регионах они зеркало OT эффекты, приведенный ранее в кишечнике.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bradford solution</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein lysis kit</td>
			<td>Protein simple</td>
			<td>CBS403</td>
			<td>Bicine/CHAPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WES kits</td>
			<td>Protein simple</td>
			<td>WES-Mouse 12-230 master kit (PS-MK15), WES-Rabbit 12-230 master kit (PS-MK14), WES 12-230 kDa total Protein master kit (PS-TP07)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse IgG HRP conjugate</td>
			<td>Protein simple</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-phospho-eIF2a</td>
			<td>Cell Signaling technology</td>
			<td>SER51, 9721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse mAb anti-PKR</td>
			<td>Cell Signaling technology</td>
			<td>2103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-phospho-PKR</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Thr451, 07-886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit mAb anti-PKR</td>
			<td>Cell Signaling technology</td>
			<td>12297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit mAb anti-GAPDH</td>
			<td>Cell Signaling technology</td>
			<td>2118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse mAb anti-phospho-IKB</td>
			<td>Cell Signaling technology</td>
			<td>9246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse mAb anti-IKB</td>
			<td>Cell Signaling technology</td>
			<td>4814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-BiP</td>
			<td>Cell Signaling technology</td>
			<td>3183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti GCN2</td>
			<td>Cell Signaling technology</td>
			<td>3302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit mAb anti-phospho-GCN2</td>
			<td>BIORBYT</td>
			<td>T899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pregnant Sprague-Dawley rats</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Punch device</td>
			<td>WellTech Rapid Core or Harris Uni-Core</td>
			<td>0.35, 0.50, 0.75, 1.0, 1.20, 1.50</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing cellular stress and inflammation in discrete oxytocin-secreting brain nuclei in the neonatal rat before and after first colostrum feeding

Цель настоящего Протокола заключается в изоляции окситоцина рецепторов ядер богатые мозга в мозге новорожденных до и после первого кормления молозивом. Экспрессию белков, известно реагировать метаболического стресса была измерена в мозг ядер изолятов, используя Западный blotting. Это было сделано для оценки ли метаболический стресс индуцированного питательной недостаточности в организме срабатывает нейрональных стресс. Ранее мы показали, что питательной недостаточности у новорожденных вызывает метаболический стресс в кишечнике. Кроме того молозиво окситоцин модулирует клеточного стресса ответ, воспаления и autophagy маркеров в кишечнике Вилли новорожденных крыс до и после первого канала. Сигнализации белковых маркеров, связанные со стрессом эндоплазматического ретикулума [ER сопровождающий иммуноглобулина белок (BiP), 2а фактор инициации эукариотических перевод (eIF2a) и eIF2a киназы протеина R (p-PKR)], а также два воспаление сигнализации белков [ядерный фактор κB (NF-kB) и ингибитор κB (IkB)], были измерены в ядрах головного мозга новорожденного [ядро одиночного тракта (НТС), паравентрикулярного ядра (ПВН), выше оптические ядро (сын), коры (CX), стриатума ядер (STR), и медиальный preoptic ядро (МПО)] до первого канала (безгрунтовых, молозиво) и после начала кормления (грунтовать молозиво). Выражение BiP/GRP78 и p-eIF2a были upregulated в безгрунтовых и downregulated в загрунтовать НТС ткани. NF-kB сохраняется (высокий) в цитоплазме CX, STR и MPO, тогда как NF-kB был ниже и неизменным в НТС, PVN и сын в обоих условий. Коллективные Бип и p-eIF2 выводы согласуются с реакции на стресс. eIf2a был фосфорилированных dsRNA зависимые киназы (p-PKR) в сына, CX, STR и MPO. Однако в НТС (и в меньшей степени в ПВН), eIf2a был фосфорилированных на другой киназы, общего управления nonderepressible-2 киназы (GCN2). Стресс модулирующих механизмов, ранее наблюдали в кишечник новорожденного enterocytes, по-видимому, отражаться в некоторых регионах мозга OTR-богатые люди. НТС и ПВН могут использовать разные фосфорилирование механизм (под дефицит питательных веществ) из других регионов и огнеупорных воздействия питательной недостаточности. Вместе эти данные свидетельствует о том, что ответы мозга на стресс питательной недостаточности компенсируются сигнализации от молозиво загрунтовать enterocytes.

Представитель полос иммунореактивности относительно общего белка показывают, что мозг ядер с очень низким заготовленной белка. Это требует использования автоматизированных иммуноблоттинга техника, которая очень чувствительна по сравнению с канонической западную ?...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Cellular Stress and Inflammation in Discrete Oxytocin-secreting Brain Nuclei in the Neonatal Rat Before and After First Colostrum Feeding at JoVE.co

Assessing Cellular Stress and Inflammation in Discrete Oxytocin-secreting Brain Nuclei in the Neonatal Rat Before and After First Colostrum Feeding

Оценка клеточного стресса и воспаления в дискретных окситоцина секретирующих ядрах головного мозга новорожденных крыс до и после первого кормления молозивом

Здесь мы представляем протокол изолировать ядер головного мозга в мозге новорожденных крыс в сочетании с первого кормления молозивом. Эта техника позволяет исследование питательной недостаточности стресса в головном мозге, модулированные энтероцитах сигнализации.

The goal of this protocol is to isolate oxytocin-receptor rich brain nuclei in the neonatal brain before and after first colostrum feeding. The expression ...

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области послеродового развития о том, как сосание молока влияет на стресс сигнализации в головном мозге. Этот метод может быть использован для захвата конкретных областей мозга в течение первого периода естественного голодания и сравнить их с соответствующими областями вскоре после первого естественного молозива корма. Понимание того, как сосание влияет на физиологию поведения и эмоций, позволяет использовать антагониста для различных рецепторов во время анализа тканей мозга ex-vivo.Чтобы получить ядра ударов, удалить крыс щенков за хвост с перчаткой стороны. После сбора мозга, быстро поместите весь орган в полиметил метакрилат головной формы при комнатной температуре и сразу же использовать новый лезвие бритвы, чтобы сделать 500 микрометров толщиной ломтики ткани. Положите ломтики рострал в caudal в чашку Петри, как они получены для поддержания правильной ориентации разделов.Когда весь мозг был секционен, быстро добавить искусственную спинномозговую жидкость без глюкозы в блюдо и инкубировать ломтики в течение 60 минут при 28 до 30 градусов по Цельсию с постоянным перемешиванием на орбитальном шейкере. Используйте атлас мозга и анатомические ориентиры на каждой ткани, чтобы определить ядра мозга, которые будут пробиты, и поместить кусочек с ядрами, представляющими интерес, в новую чашку Петри под рассеченным микроскопом. После визуализации используйте инструмент coring, чтобы быстро пробить четыре-шесть различных ядер и быстро погрузить каждое пробитое ядро в 0,06 мл буфера извлечения холодного белка льда в соответствующе помеченной микро-центрифуге трубки, содержащей ингибиторы протея и ингибиторы фосфатазы в течение 60 минут.В конце инкубации центрифугайте извлеченные ядра в охлажденой мини-центрифуге и используйте микро-пипетку, чтобы тщательно перенести 0,055 мл супернатанта из каждой трубки в соответствующую предварительно охлаждено 1,5 мл микро-центрифуги трубки на льду. Перед отрицательным 20 градусов по Цельсию хранения, передача 0,012 мл супернатанта из каждой трубки запас белка в соответствующие 0,5 мл предварительно охлажденой трубки на льду для подготовки первого образца. Чтобы подготовить образцы для измерения белка в капилляре, добавьте 0,003 мл реагента мастер-микса из набора белкового лиза к каждому из образцов в 0,5 мл помеченных трубок.Далее добавьте 0,004 мл реагента мастер-микса в биотинилированный молекулярный раствор лестницы веса в 0,016 мл деионизированной воды, а также денатурацию лестницы и образца экстракта белка в тепловом блоке 95 градусов по Цельсию, сохраняя все трубки при четырех градусах Цельсия через пять минут. Для анализа сигнального белка добавьте 0,01 мл свежеприготовленного раствора перекиси люминола в скважины Е-1 к Е-25 новой автоматизированной западной пластины, 0,01 мл вторичного антимошешного антитела к скважинам D-2 к D-25 и добавьте 0,01 мл стрептавидина хрена пероксидазы из комплекта в скважину D-1. Добавьте 0,01 мл свежеприготовленного первичного антитела в скважины С-2 к С-25 и 0,01 мл раствора антител, разбомбив два раствора скважин С-1 и В-1 до В-25.Оставьте ряд F колодцев пустыми и заполните пять отсеков из трех рядов ниже F строки с 0,45 мл буфера мытья. Затем кратко вращайте охлажденные образцы в течение 30 секунд и добавляйте 0,03 мл каждого образца к каждому колодец строки А, начиная с A-2. Затем добавьте 0,005 мл биотинилированной молекулярной весовой лестницы в колодец А-1 и накройте пластину центрифугой.В то время как пластина центрифугирована, откройте новый файл запуска в автоматизированном западном связанном программном обеспечении и инициировать анализ молекулярного размера. На странице анализа введите имена образцов в каждый капилляр, а также названия первичных и вторичных антител. В конце центрифугации поместите пластину в автоматизированный западный инструмент и очистите крышку от капиллярного картриджа.После центрифугации, не забудьте проверить на пузырьки воздуха, потому что пузырьки воздуха в капилляре может блокировать электрофоретический ток и не весь раунд. Вставьте картридж в назначенное положение внутри прибора и закройте дверь. Нажмите кнопку "Начать".При запросе с типом анализа, введите название эксперимента в соответствующем текстовом поле и нажмите хорошо. По запросу активированной даты запуска и идентификационного номера в файле запуска сделайте заметку о времени окончания запуска. В конце пробега выбросьте капиллярный картридж в распоряжение острыми и пластины в распоряжение биоопасных материалов.После разделения электрофореза проверьте файлы бега на наличие пиков иммунной реактивности антигенов на уровне от 40 до 43 килодальтонов, которые означает фосфорилированный эукариотический фактор инициации перевода 2A. Там, где молекулярные пики веса такого размера отсутствуют, нажмите прямо ниже кривой и выберите добавить молекулярный вес к пику, чтобы гарантировать, что размеры и произвольные количества ниже кривой регистрируются. В образцах ткани unprimeds, связывающие уровни белка аминокислоты глобулина в ядрах одиночного трека значительно выше по сравнению со всеми другими регионами.Примыкать ткани кишечника молозивом снижает связывающие уровни белка аминоглобулина в ядрах одиночного пути и не влияет на паравентрикулярные ядра и супероптические ядра. И наоборот, грунтовка увеличивает связывающие уровни белка аминоглобулина в коре головного мозга, ядрах стриации и медиальных предоптических ядрах по отношению к непремеченной ткани, подразумевая, что связывающие уровни белка аминокислотного глобулина в различных проверенных ядрах мозга по-разному реагируют на грунтовку кишечника, и пока нет никакого продемонстрированого перекрестного разговора между различными проверенными ядрами. Эукариотический коэффициент инициации перевода 2A и фосфорилированный эукариотический коэффициент инициации перевода 2A повышены в нестандартном состоянии по сравнению с другими ядрами.После грунтовки, уровни как эукариотического фактора инициации перевода 2A, так и фосфорилированного эукариотического фактора инициации перевода 2A снижаются по сравнению с ядрами одиночного трека по сравнению с непременной тканью. Во всех других проверенных ядрах грунтовка повышает уровень эукариотического фактора инициации перевода 2A и фосфорилированного эукариотического фактора инициации перевода 2А по отношению к непременной ткани. Тем не менее, уровни рецептора фосфорилированной протеиновой киназы низки в непременных образцах по сравнению с загрунтованные образцы в ядрах одиночного трека, что убедительно свидетельствует о том, что другой киназы участвует в фосфорилировании эукариотического фактора инициации перевода 2A.После своего развития, этот метод проложил путь для исследователей в области послеродового развития для изучения сигнальных путей, участвующих в росте тканей и дифференциации и являются ли они под влиянием или независимо от сосания. Не забывайте, что работа с летучими снижая агентов, как, например, дитиотрейтол, может быть опасным, и меры предосторожности, такие как подготовка в химическом капюшоне всегда должны быть приняты при подготовке этой процедуры.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Seven Steps to Stellate Cells

Семь шагов к звездчатых клеток

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

Trichuris Muris Инфекция: Модель Тип 2 иммунитет и воспаление в кишечнике

Trichuris muris is a natural pathogen of mice and is biologically and antigenically similar to species of Trichuris that 
infect humans and livestock1. ...

Assessing Somatic Hypermutation in Ramos B Cells after Overexpression or Knockdown of Specific Genes

Оценка соматических Hypermutation в Рамос-клеток после Сверхэкспрессия или Нокдаун специфических генов

B cells start their life with low affinity antibodies generated by V(D)J recombination.  However, upon detecting a pathogen, the variable (V) region of an ...

Primary Microglia Isolation from Mixed Glial Cell Cultures of Neonatal Rat Brain Tissue

Первичная изоляция Микроглия из смешанного глиальных клеточных культур из тканей новорожденных мозга крысы

Microglia account for approximately 12% of the  total cellular population in the mammalian brain. While neurons and astrocytes are considered  the major ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Культивирование Микроглии от новорожденных и взрослых центральной нервной системы

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Неинвазивного Модель Neuropathogenic<em&gt; Кишечная палочка</em&gt; Инфекция в новорожденной крысы

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Индукционная мышиных воспаление кишечника с помощью приемных передачи эффекторных CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Высокая</sup&gt; Т-клеток в иммунодефицитных мышей

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Оценка сетчатке микроглии фагоцитарной функции<em&gt; В Vivo</em&gt; С использованием анализа проточной цитометрии на основе

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Immunofluorescence Analysis of Stress Granule Formation After Bacterial Challenge of Mammalian Cells

Иммунофлуоресцентный анализ образования гранулята после бактериальной выделения клеток млекопитающих

Fluorescent imaging of cellular components is an effective tool to investigate host-pathogen interactions. Pathogens can affect many different features of ...