Name: assessing cellular stress and inflammation in discrete oxytocin-secreting brain nuclei in the neonatal rat before and after first colostrum feeding
Uploaded: 2018-11-14T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Cellular Stress and Inflammation in Discrete Oxytocin-secreting Brain Nuclei in the Neonatal Rat Before and After First Colostrum Feeding at JoVE.co

Los autores agradecen a Manon Ranger y Alexandra Schulz por su asistencia en la preparación de este protocolo.

Este estudio fue aprobado por los comités de uso en la Universidad de Columbia y el Instituto psiquiátrico del estado de Nueva York y de institucional Animal Care.
1. preparación de tejido
<ol><li>Pedir tiempo ratas preñadas de vendedor.</li>
	<li>Siga ratas embarazadas tiempo observando sus abdómenes de cada vez mayores en las semanas después de su llegada y posteriormente buscando cachorros en la fecha prevista para el parto mediante la inspección de la jaula cada 2 h hasta que entr...

<ol>
	<li>Hietaniemi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiles+in+fetal+and+neonatal+rat+offspring+of+energy-restricted+dams.">Gene expression profiles in fetal and neonatal rat offspring of energy-restricted dams.</a> Journal of Nutrigenetics and Nutrigenomics. 2 (4-5), 173-183 (2009).</li><li>Okabe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogenous+glycine+receptor+expression+in+cortical+plate+neurons+and+Cajal-Retzius+cells+of+neonatal+rat+cerebral+cortex.">Homogenous glycine receptor expression in cortical plate neurons and Cajal-Retzius cells of neonatal rat cerebral cortex.</a> Neuroscience. 123 (3), 715-724 (2004).</li><li>Mailleux, P., Takazawa, K., Erneux, C., Vanderhaeghen, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+the+neurons+containing+inositol+1,4,5-trisphosphate+3-kinase+and+its+messenger+RNA+in+the+developing+rat+brain.">Distribution of the neurons containing inositol 1,4,5-trisphosphate 3-kinase and its messenger RNA in the developing rat brain.</a> Journal of Comparative Neurology. 327 (4), 618-629 (1993).</li><li>Carter, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxytocin+and+Human+Evolution.">Oxytocin and Human Evolution.</a> Current Topics in Behavioral Neuroscience. , (2017).</li><li>Sippel, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxytocin+and+Stress-related+Disorders:+Neurobiological+Mechanisms+and+Treatment+Opportunities.">Oxytocin and Stress-related Disorders: Neurobiological Mechanisms and Treatment Opportunities.</a> Chronic Stress (Thousand Oaks). 1, (2017).</li><li>Agnati, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspects+on+the+integrative+actions+of+the+brain+from+neural+networks+to+"brain-body+medicine".">Aspects on the integrative actions of the brain from neural networks to "brain-body medicine".</a> Journal of Receptors and Signal Transduction Research. 32 (4), 163-180 (2012).</li><li>Welch, M. G., Margolis, K. G., Li, Z., Gershon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxytocin+regulates+gastrointestinal+motility,+inflammation,+macromolecular+permeability,+and+mucosal+maintenance+in+mice.">Oxytocin regulates gastrointestinal motility, inflammation, macromolecular permeability, and mucosal maintenance in mice.</a> American Journal Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 307 (8), G848-G862 (2014).</li><li>Welch, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+developmental+regulation+of+oxytocin+(OT)+and+oxytocin+receptors+(OTR)+in+the+enteric+nervous+system+(ENS)+and+intestinal+epithelium.">Expression and developmental regulation of oxytocin (OT) and oxytocin receptors (OTR) in the enteric nervous system (ENS) and intestinal epithelium.</a> Journal of Comparative Neurology. 512 (2), 256-270 (2009).</li><li>Prakash, B. S., Paul, V., Kliem, H., Kulozik, U., Meyer, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+oxytocin+in+milk+of+cows+administered+oxytocin.">Determination of oxytocin in milk of cows administered oxytocin.</a> Analytica Chimica Acta. 636 (1), 111-115 (2009).</li><li>Solangi, A. R., Memon, S. Q., Mallah, A., Khuhawar, M. Y., Bhanger, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+separation+of+oxytocin,+norfloxacin+and+diclofenac+sodium+in+milk+samples+using+capillary+electrophoresis.">Quantitative separation of oxytocin, norfloxacin and diclofenac sodium in milk samples using capillary electrophoresis.</a> Biomedical Chromatography. 23 (9), 1007-1013 (2009).</li><li>Klein, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxytocin+modulates+markers+of+the+unfolded+protein+response+in+Caco2BB+gut+cells.">Oxytocin modulates markers of the unfolded protein response in Caco2BB gut cells.</a> Cell Stress and Chaperones. 19 (4), 465-477 (2014).</li><li>Klein, B. Y., Tamir, H., Hirschberg, D. L., Glickstein, S. B., Welch, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxytocin+modulates+mTORC1+pathway+in+the+gut.">Oxytocin modulates mTORC1 pathway in the gut.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 432 (3), 466-471 (2013).</li><li>Klein, B. Y., Tamir, H., Ludwig, R. J., Glickstein, S. B., Welch, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colostrum+oxytocin+modulates+cellular+stress+response,+inflammation,+and+autophagy+markers+in+newborn+rat+gut+villi.">Colostrum oxytocin modulates cellular stress response, inflammation, and autophagy markers in newborn rat gut villi.</a> Biochemical an Biophysical Research Communications. 487 (1), 47-53 (2017).</li><li>Donnet-Hughes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+role+of+the+intestinal+microbiota+of+the+mother+in+neonatal+immune+education.">Potential role of the intestinal microbiota of the mother in neonatal immune education.</a> Proceedings of the Nutritional Society. 69 (3), 407-415 (2010).</li><li>Perez, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+imprinting+of+the+neonatal+immune+system:+lessons+from+maternal+cells?.">Bacterial imprinting of the neonatal immune system: lessons from maternal cells?.</a> Pediatrics. 119 (3), e724-e732 (2007).</li><li>Takeda, S., Kuwabara, Y., Mizuno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentrations+and+origin+of+oxytocin+in+breast+milk.">Concentrations and origin of oxytocin in breast milk.</a> Endocrinolcia Japonica. 33 (6), 821-826 (1986).</li><li>Quintana, D. S., Outhred, T., Westlye, L. T., Malhi, G. S., Andreassen, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+oxytocin+administration+on+brain+activity:+a+systematic+review+and+meta-analysis+protocol.">The impact of oxytocin administration on brain activity: a systematic review and meta-analysis protocol.</a> Systematic Reviews. 5 (1), 205 (2016).</li><li>Dobbing, J., Sands, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+aspects+of+the+brain+growth+spurt.">Comparative aspects of the brain growth spurt.</a> Early Human Development. 3 (1), 79-83 (1979).</li><li>Orr, M. E., Garbarino, V. R., Salinas, A., Buffenstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extended+Postnatal+Brain+Development+in+the+Longest-Lived+Rodent:+Prolonged+Maintenance+of+Neotenous+Traits+in+the+Naked+Mole-Rat+Brain.">Extended Postnatal Brain Development in the Longest-Lived Rodent: Prolonged Maintenance of Neotenous Traits in the Naked Mole-Rat Brain.</a> Frontiers in Neuroscience. 10, 504 (2016).</li><li>Hansson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+quantitative+proteome+analysis+of+in+vivo+intestinal+development.">Time-resolved quantitative proteome analysis of in vivo intestinal development.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 10 (3), (2011).</li><li>Mochizuki, K., Yorita, S., Goda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+changes+in+the+jejunum+of+rats+during+the+transient+suckling-weaning+period.">Gene expression changes in the jejunum of rats during the transient suckling-weaning period.</a> Journal of Nutritional Science and Vitaminology (Tokyo). 55 (2), 139-148 (2009).</li><li>Rinaman, L., Banihashemi, L., Koehnle, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+life+experience+shapes+the+functional+organization+of+stress-responsive+visceral+circuits.">Early life experience shapes the functional organization of stress-responsive visceral circuits.</a> Physiology and Behavior. 104 (4), 632-640 (2011).</li><li>Johannes, G., Sarnow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cap-independent+polysomal+association+of+natural+mRNAs+encoding+c-myc,+BiP,+and+eIF4G+conferred+by+internal+ribosome+entry+sites.">Cap-independent polysomal association of natural mRNAs encoding c-myc, BiP, and eIF4G conferred by internal ribosome entry sites.</a> RNA. 4 (12), 1500-1513 (1998).</li><li>Rinaman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hindbrain+noradrenergic+A2+neurons:+diverse+roles+in+autonomic,+endocrine,+cognitive,+and+behavioral+functions.">Hindbrain noradrenergic A2 neurons: diverse roles in autonomic, endocrine, cognitive, and behavioral functions.</a> American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 300 (2), R222-R235 (2011).</li><li>Walker, C. D., Toufexis, D. J., Burlet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothalamic+and+limbic+expression+of+CRF+and+vasopressin+during+lactation:+implications+for+the+control+of+ACTH+secretion+and+stress+hyporesponsiveness.">Hypothalamic and limbic expression of CRF and vasopressin during lactation: implications for the control of ACTH secretion and stress hyporesponsiveness.</a> Progress in Brain Research. 133, 99-110 (2001).</li><li>Montiel-Castro, A. J., Gonzalez-Cervantes, R. M., Bravo-Ruiseco, G., Pacheco-Lopez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microbiota-gut-brain+axis:+neurobehavioral+correlates,+health+and+sociality.">The microbiota-gut-brain axis: neurobehavioral correlates, health and sociality.</a> Frontiers in Integrative Neuroscience. 7, 70 (2013).</li><li>Blevins, J. E., Ho, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+oxytocin+signaling+in+the+regulation+of+body+weight.">Role of oxytocin signaling in the regulation of body weight.</a> Reviews in Endocrine and Metabolic Disorders. 14 (4), 311-329 (2013).</li><li>Welch, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+administration+of+secretin+and+oxytocin+inhibits+chronic+colitis+and+associated+activation+of+forebrain+neurons.">Combined administration of secretin and oxytocin inhibits chronic colitis and associated activation of forebrain neurons.</a> Neurogastroenterology Motility. 22 (6), 654 (2010).</li><li>Berthoud, H. R., Neuhuber, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+chemical+anatomy+of+the+afferent+vagal+system.">Functional and chemical anatomy of the afferent vagal system.</a> Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical. 85 (1-3), 1-17 (2000).</li><li>Taniuchi, S., Miyake, M., Tsugawa, K., Oyadomari, M., Oyadomari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+stress+response+of+vertebrates+is+regulated+by+four+eIF2alpha+kinases.">Integrated stress response of vertebrates is regulated by four eIF2alpha kinases.</a> Scientific Reports. 6, 32886 (2016).</li><li>Altschuler, S. M., Bao, X. M., Bieger, D., Hopkins, D. A., Miselis, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscerotopic+representation+of+the+upper+alimentary+tract+in+the+rat:+sensory+ganglia+and+nuclei+of+the+solitary+and+spinal+trigeminal+tracts.">Viscerotopic representation of the upper alimentary tract in the rat: sensory ganglia and nuclei of the solitary and spinal trigeminal tracts.</a> Journal of Comparative Neurology. 283 (2), 248-268 (1989).</li><li>Shapiro, R. E., Miselis, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+central+neural+connections+of+the+area+postrema+of+the+rat.">The central neural connections of the area postrema of the rat.</a> Journal of Comparative Neurology. 234 (3), 344-364 (1985).</li><li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , (1997).</li><li>Nayak, R., Pintel, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+viruses+can+induce+phosphorylation+of+eIF2alpha+via+PKR+activation,+which+can+be+overcome+by+helper+adenovirus+type+5+virus-associated+RNA.">Adeno-associated viruses can induce phosphorylation of eIF2alpha via PKR activation, which can be overcome by helper adenovirus type 5 virus-associated RNA.</a> Journal of Virology. 81 (21), 11908-11916 (2007).</li><li>Zaborske, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+tRNA+charging+and+activation+of+the+eIF2+kinase+Gcn2p.">Genome-wide analysis of tRNA charging and activation of the eIF2 kinase Gcn2p.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (37), 25254-25267 (2009).</li><li>Hollis, J. H., Lightman, S. L., Lowry, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+systemic+and+visceral+sensory+information+by+medullary+catecholaminergic+systems+during+peripheral+inflammation.">Integration of systemic and visceral sensory information by medullary catecholaminergic systems during peripheral inflammation.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1018, 71-75 (2004).</li><li>Klein, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxytocin+opposes+effects+of+bacterial+endotoxin+on+ER-stress+signaling+in+Caco2BB+gut+cells.">Oxytocin opposes effects of bacterial endotoxin on ER-stress signaling in Caco2BB gut cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1860 (2), 402-411 (2016).</li><li>Kaltschmidt, B., Kaltschmidt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB+in+the+nervous+system.">NF-kappaB in the nervous system.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (3), a001271 (2009).</li></ol>

Una técnica de microdisección de discretos, núcleos del cerebro de OTR-ricos en el cerebro de rata neonatal se presenta en este documento. Se reconoce bien que las neuronas son altamente especializadas, incluso dentro de núcleos bien caracterizados en el cerebro. Este enfoque altamente reproducible para aislar determinados núcleos ricos en OTR permite comprobación de hipótesis robusta. Mediante Western Blot automatizados, la consistencia y reproducibilidad de los resultados mejoraron aún más. Mientras que una li...

En contraste con nuestra comprensión del desarrollo temprano del cerebro que ocurre en el transcurso de días-a-semanas después del parto, relativamente poco se sabe acerca de la miríada de cambios dinámicos que ocurren en las primeras horas de vida en ratas. Un desafío clave ha sido el pequeño tamaño del cerebro de rata neonatal y un requisito para herramientas de alta tecnología aislar regiones discretas del cerebro o las células. Estudios a menudo evaluación gene transcripción y traducción no1,2, que no da una comprensión firme de los niveles funcionales de moléculas de señalización activadas. Otros examinan la expresión usando immunohistochemistry para referencia regiones del cerebro, que no permite la cuantificación de los niveles de expresión3. Ningún estudio hasta la fecha ha estudiado la activación de la señalización de vías asociadas con calostro primera ratas de alimentación en regiones discretas del cerebro, que requiere rápido aislamiento y sacrificio y medición de la expresión de la proteína y fosforilación de la proteína mediante Western borrar. Mientras que el microdissection del cerebro se realiza en los cerebros más viejos y más grandes, no hemos identificado una referencia realizando un golpe sola célula cerebral en un cerebro de P0. Este papel presenta un protocolo para aislar regiones restringidas del cerebro neonatal utilizando una técnica de perforación relativamente baja y un procedimiento de Western blot para medir la expresión de proteínas en muestras relativamente pequeñas. Este protocolo puede ser conveniente para las preguntas de investigación que requieren la evaluación de la expresión de proteínas y modificaciones postraduccionales (por ej., fosforilación) en regiones relativamente restringidas de pequeños cerebros de cualquier especie, siempre que el usuario puede identificar visualmente la región cerebral de interés con un atlas y puntos de referencia identificables.
Esta técnica fue desarrollada para entender los cambios que ocurren en el cerebro como resultado de calostro primera las ratas neonatales de la alimentación, que es rico en oxitocina (OT). OT ha sido mucho tiempo conocido por su capacidad para estimular contracción uterina y de bajada de leche. Sin embargo, OT ahora se sabe que desempeñan una amplia gama de papeles en la regulación de muchas funciones corporales y conductas4. Por ejemplo, OT se opone a la tensión y la inflamación en relación con los comportamientos de adaptación afiliativo5, retrasa el vaciamiento gástrico y disminuye el tránsito intestinal. Se han identificado receptores de OT (OTR) en las neuronas entéricas y epitelio intestinal6,7,8. Los efectos gastrointestinales de los OT son particularmente importantes para el niño durante el período postnatal temprano. Por ejemplo, lactancia materna se asocia con la entrega de cantidades significativas de OT para el intestino neonatal9,10, y los datos muestran que el OTR es overexpressed fuertemente en vellosidades duodenales durante la leche lactantes período8.
In vitro los experimentos usando una línea celular de tripa han demostrado a nivel celular que la oxitocina modula moléculas importantes en la tensión de señalización vía11,12 y juega un papel regulador en la traducción de proteínas 12. estos estudios sugieren que los componentes de la leche, incluyendo oxitocina exógena de la madre, son importantes en la respuesta de la proteína desdoblada en recién nacidos para reducir el estrés celular13.
Estudios in vivo y ex vivo han demostrado que el calostro OT modula los marcadores de autofagia, la inflamación y la respuesta de estrés celular en villi de intestino de rata recién nacida. Enterocitos recién nacidos sufren estrés celular substancial en su lado luminal cuando el intestino está expuesto simultáneamente a microbiota de la madre en el calostro14,15 y numerosas proteínas, incluyendo las hormonas como OT9 , 10 , 16.
Los efectos de la OT en el cerebro han sido estudiados17. Sin embargo, los mecanismos de señalización de OT demostrados en el intestino durante el periodo postnatal temprano no han sido estudiados en el cerebro. En este trabajo, un método para aislar los núcleos cerebrales discretas en el tallo cerebral de rata neonatal y el hipotálamo mediante electroforesis se utiliza para las regiones del cerebro aislado de perfil. El objetivo general de este método es capturar el estado de señalización en áreas del cerebro lo más cerca posible al nacimiento, antes y después de la primera leche de cochinillo, en el tejido cerebral con el índice más bajo de glial/neuronal de la célula. El fundamento para el desarrollo de esta técnica es que permite el rápido aislamiento de las regiones del cerebro restringido, microscópico en cachorros neonatales con una colección más homogéneo de neuronas ex vivo estudios mediante un Western Blot automatizados metodología, ofreciendo resultados muy consistentes en muestras relativamente pequeñas disecadas. Un defecto de trabajo previo incluye más disección bruta (rebanadas de cerebro o todo el cerebro) y mayores de18,de animales19. El cerebro de los cachorros jóvenes es increíblemente dinámico, con olas de diferenciación glial después del nacimiento. Para estudiar cambios en el cerebro influenciados por primera alimentación de los cachorros, es necesario estudiar restringidos núcleos neuronales con disección reproducible.
Leche alimentación generalmente se analiza para su impacto inmunológico y nutricional para la salud o gene expresión (por ejemplo, en los enterocitos20,21), mientras que raramente se estudia su efecto en las áreas del cerebro durante el desarrollo del cerebro. Se analizó el efecto del tránsito de la leche en el intestino en función del cerebro en referencia a gut colecistoquinina receptores vagales relé núcleos del vástago de cerebro, pero no de caminos señalización intracelular22. Existe una vasta literatura sobre vulnerabilidad del cerebro en desarrollo de recién nacido a la desnutrición de las madres durante el embarazo23, pero no se abordan las señales de estrés y la inflamación. Importante, aprovecha el método actual de un fenómeno en recién nacidos de la rata de día cero que aísla los estímulos calostro nacido sangre del relais vagal de los estímulos viscerales. Éste es el período de hypo respuesta llamado estrés caracterizado por inmaduros núcleo del tractus solitarius (NTS)-circuito hipotalámico inmediatamente después del nacimiento24,25 que restringe el NTS, núcleo paraventricular (PVN), y núcleo supraóptico (SON) las señales a los estímulos nacidos de sangre.
Este método es útil para el análisis de múltiples vías de señalización y relativamente restringida a las células neuronales, siempre que el tejido cerebral se cosecha en el día-0 postnatal en ratas, además de si las madres han sido impugnadas o no por cualquier tipo de tratamiento durante el embarazo. Camadas pueden ser analizadas para los efectos del calostro versus la alimentación señalización de alimentación. Al comparar las señales entre las áreas del cerebro con pobres versus rendimiento proteína rica, este método permite en capilar determinación de proteína total de las bandas polipeptídicas paralelas a inmune-cuantificación de antígenos de la proteína de los capilares. Este método permite la comparación cuantitativa, utilizando unidades arbitrarias, de los resultados obtenidos por el mismo anticuerpo sin curvas cuantitativas estándar y de referencia para proteína total por tubo capilar. Comparar resultados obtenidos por los diferentes anticuerpos es posible sólo mediante curvas estándar cuantitativas.
Este método permite la evaluación de la señalización que ocurre entre el intestino y el cerebro y que puede afectar a la función en ambos órganos26bidireccional. La asociación entre la oxitocina e ingesta de alimentos, que ha sido extensamente estudiada en años recientes27, respalda un vínculo entre la oxitocina mayor señalización y disponibilidad de nutrientes. Estos estudios apoyan también el concepto de converse esa energía déficit está acoplado con la reducción en la señalización hipotalámica oxitocina.
Estudios anteriores del efecto de la OT en la actividad cerebral demostraron que inflamación intestinal inducida produce transcripción cFos en corteza piriforme, PVN y amígdala hipotalámica que era refractaria a la vagotomía28. Sin embargo, la infusión sistémica de OT con secretina disminuyó la respuesta cerebral de cFos a la reacción inflamatoria provocada en la tripa28. Esto sugiere que el efecto de la OT exógena se llevó a cabo por rutas diferentes relés vagales, posiblemente a través de moléculas de señalización transmitidos por la sangre por el área postrema6,29.
En este estudio, se evaluaron las vías de señalización del estrés celular previamente observadas en el intestino que en el cerebro. La hipótesis fue que los componentes de la leche pueden proteger o diferir el efecto de la inflamación en la permeabilidad del intestino a metabolitos microbianos y otros, y a su vez, los efectos en el cerebro la función. Las diferencias claramente antagónicas en IkB versus BiP señalización encontrada en las vellosidades, antes y después de cebado por calostro13, sugieren que los cerebros de los recién nacidos, aún en el proceso de desarrollo, pueden detectar estas señales de calostro-inducida del intestino.
Se midieron marcadores de proteínas señalización utilizados en los experimentos anteriores de tripa que se asocian a estrés del retículo endoplásmico. Incluyen las chaperonas de ER BiP, traducción iniciación factor eIF2a (que sirve como una respuesta de estrés integrador30), eIF2a quinasa p-PKR y dos proteínas de señalización de la inflamación (NF-kB y su inhibidor IkB).
Se eligieron seis regiones cerebrales basadas en su capacidad en adultos secretan o responder a OT. El NTS, situado en la médula superior, es el primer relais de la entrada visceral y recibe señalización directa de neuronas sensoriales vagales en el intestino31 citoquinas posiblemente nacido de sangre, toxinas y hormonas a través de la zona-postrema adyacente32. El PVN, núcleo supraóptico (hijo), núcleos del estriado (STR), corteza cerebral (CX) y núcleo preóptica medial (MPO) reciben señales desde el intestino a través del NTS.
Resultados mostraron que la respuesta celular al estrés durante el período postnatal inmediato antes del cebado de calostro e inmediatamente después de primera alimentación es diferente en NTS en comparación con el PVN y el hijo. Señalización en CX, STR y MPO diferenciaron de ése del PVN y del hijo, así. Las distintas funciones de OT se mostraron anteriormente para modular el estrés celular y la inflamación en el intestino se sintió probablemente por algunas áreas del cerebro. Colectivamente, los datos indican que a nivel celular, durante las primeras horas después del nacimiento, el cerebro responde al estrés metabólico asociado con la escasez de nutrientes. Los datos también muestran que la magnitud y dirección de los efectos moduladores de calostro de alimentación dependen de la región y que en algunas regiones, reflejan efectos de OT se muestra anteriormente en el intestino.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bradford solution</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein lysis kit</td>
			<td>Protein simple</td>
			<td>CBS403</td>
			<td>Bicine/CHAPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WES kits</td>
			<td>Protein simple</td>
			<td>WES-Mouse 12-230 master kit (PS-MK15), WES-Rabbit 12-230 master kit (PS-MK14), WES 12-230 kDa total Protein master kit (PS-TP07)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse IgG HRP conjugate</td>
			<td>Protein simple</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-phospho-eIF2a</td>
			<td>Cell Signaling technology</td>
			<td>SER51, 9721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse mAb anti-PKR</td>
			<td>Cell Signaling technology</td>
			<td>2103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-phospho-PKR</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Thr451, 07-886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit mAb anti-PKR</td>
			<td>Cell Signaling technology</td>
			<td>12297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit mAb anti-GAPDH</td>
			<td>Cell Signaling technology</td>
			<td>2118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse mAb anti-phospho-IKB</td>
			<td>Cell Signaling technology</td>
			<td>9246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse mAb anti-IKB</td>
			<td>Cell Signaling technology</td>
			<td>4814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-BiP</td>
			<td>Cell Signaling technology</td>
			<td>3183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti GCN2</td>
			<td>Cell Signaling technology</td>
			<td>3302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit mAb anti-phospho-GCN2</td>
			<td>BIORBYT</td>
			<td>T899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pregnant Sprague-Dawley rats</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Punch device</td>
			<td>WellTech Rapid Core or Harris Uni-Core</td>
			<td>0.35, 0.50, 0.75, 1.0, 1.20, 1.50</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing cellular stress and inflammation in discrete oxytocin-secreting brain nuclei in the neonatal rat before and after first colostrum feeding

El objetivo de este protocolo es aislar núcleos de ideas ricos de receptores de oxitocina en el cerebro neonatal, antes y después de la primera alimentación de calostro. La expresión de proteínas conocidas para responder al estrés metabólico se midió en aislamientos de núcleos cerebrales mediante Western blot. Esto se hizo para determinar si la insuficiencia de nutrientes inducida por el estrés metabólica en el cuerpo desencadena estrés neuronal. Previamente hemos demostrado que la insuficiencia de nutrientes en los recién nacidos provoca estrés metabólico en el intestino. Además, la oxitocina calostro modula marcadores de autofagia, la inflamación y la respuesta de estrés celular en villi de intestino de rata recién nacido antes y después de la primera alimentación. Señalización de marcadores de proteínas asociados con el estrés del retículo endoplásmico [ER acompañante inmunoglobulina proteína (BiP), traducción en eucariotes iniciación factor 2A (eIF2a) y eIF2a quinasa quinasa proteína R (p-PKR)], así como dos inflamación-señalización proteínas [factor nuclear-κB (NF-kB) y κB inhibidor (IkB)], se midieron en núcleos del cerebro del recién nacido [núcleo del tracto solitario (NTS), núcleo paraventricular (PVN), núcleo supra óptico (hijo), cortex (CX), núcleos del estriado (STR), y núcleo preóptica medial (MPO)] antes de la primera alimentación (sin imprimación por el calostro) y después del comienzo del oficio de enfermera (preparado por el calostro). Expresión de BiP/GRP78 y p-eIF2a era upregulated en unprimed y regulada en tejido preparado de NTS. NF-kB se mantuvo (alto) en el citoplasma CX, STR y MPO, mientras que NF-kB era baja y sin cambios en NTS, PVN e hijo en ambas condiciones. El colectivo BiP y p-eIF2 los resultados son consistentes con una respuesta de estrés. eIf2a se fosforila por kinasa dependiente de dsRNA (p-PKR) en el hijo, CX, STR y MPO. Sin embargo, en las noches (y en menor medida en PVN), eIf2a se fosforila por otra quinasa, control general nonderepressible-2 (GCN2). Los mecanismos de modulación de estrés observados previamente en los enterocitos del intestino del recién nacido parecen espejarse en algunas regiones del cerebro ricas en OTR. El NTS y PVN pueden utilizar un mecanismo de fosforilación diferentes (bajo deficiencia de nutrientes) de otras regiones y refractaria a los efectos de la escasez de nutrientes. Colectivamente, estos datos sugieren que las respuestas cerebrales a la tensión de la escasez de nutrientes se compensan con señalización de enterocitos calostro preparado.

Las bandas representativas del immunoreactivity en relación con proteínas totales muestran núcleos cerebrales con muy baja proteína cosechado. Esto requiere el uso de la técnica de Western blot automatizados, que es muy sensible comparado con el canónico Western blot. Este enfoque puede funcionar con menos proteína fortyfold por capilar en comparación con el por carril en manchas blancas /negras occidentales.
Efectos difere...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Cellular Stress and Inflammation in Discrete Oxytocin-secreting Brain Nuclei in the Neonatal Rat Before and After First Colostrum Feeding at JoVE.co

Assessing Cellular Stress and Inflammation in Discrete Oxytocin-secreting Brain Nuclei in the Neonatal Rat Before and After First Colostrum Feeding

Evaluación de estrés celular y la inflamación en discretos núcleos de cerebro secretoras de oxitocina en la rata Neonatal antes y después de la primera alimentación de calostro

Aquí, presentamos un protocolo para aislar los núcleos cerebrales en el cerebro de rata neonatal en conjunto con la primera alimentación de calostro. Esta técnica permite el estudio del estrés de la escasez de nutrientes en el cerebro como modulado por señales del enterocyte.

The goal of this protocol is to isolate oxytocin-receptor rich brain nuclei in the neonatal brain before and after first colostrum feeding. The expression ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de desarrollo postnatal sobre la forma en que la leche materna influye en la señalización de estrés en el cerebro. Esta técnica se puede utilizar para capturar áreas cerebrales específicas durante el primer período de inanición natural y para compararlas con las áreas respectivas poco después de la primera alimentación natural del calostro. Entender cómo la lección influye en la fisiología del comportamiento y la emoción permite el uso de un antagonista a varios receptores durante el análisis del tejido cerebral ex-vivo.Para obtener los golpes de núcleo, retire los cachorros de rata por la cola con una mano enguancha. Después de cosechar el cerebro, coloque rápidamente todo el órgano en un molde cerebral de polimetilmetacrilato a temperatura ambiente e inmediatamente use una nueva cuchilla de afeitar para hacer rodajas de 500 micrómetros de espesor del tejido. Poner las rodajas rostrales a caudal en un plato de Petri a medida que se obtienen para mantener la orientación correcta de las secciones.Cuando todo el cerebro haya sido seccionado, agregue rápidamente líquido cefalorraquídeo artificial sin glucosa al plato e incubar las rodajas durante 60 minutos a 28 a 30 grados celsius con agitación constante en un agitador orbital. Utilice un atlas cerebral y puntos de referencia anatómicos en cada tejido para identificar los núcleos cerebrales que se van a perforar y colocar la rebanada con los núcleos de interés en una nueva placa Petri bajo un microscopio diseccionador. Una vez visualizado, utilice una herramienta de perforación para perforar rápidamente de cuatro a seis núcleos diferentes y sumergir rápidamente cada núcleo perforado en 0,06 ml de tampón de extracción de proteína helada en el tubo de micro centrífuga debidamente etiquetado que contiene inhibidores del proteo y fosfatasa durante 60 minutos.Al final de la incubación, centrifuga los núcleos extraídos en una mini-centrífuga enfriada, y utilice una micro-pipeta para transferir cuidadosamente 0.055 mL de sobrenadante de cada tubo en el tubo de micro-centrífuga pre-enfriado apropiado de 1.5 ml sobre hielo. Antes del almacenamiento negativo de 20 grados centígrados, transfiera 0,012 ml de sobrenadante de cada tubo de stock proteico al tubo preenfriado de 0,5 ml sobre hielo adecuado para la primera preparación de la muestra. Para preparar las muestras para la medición de proteínas capilares, añada 0,003 ml de reactivo de mezcla maestra de un kit de lysis proteica a cada una de las muestras en los tubos etiquetados con 0,5 ml.A continuación, añada 0,004 ml de reactivo de mezcla maestra a una solución de escalera de peso molecular biotinilado en 0,016 ml de agua desionizada, y desnaturalizar las muestras de la escalera y el extracto de proteína en un bloque de calor de 95 grados Celsius, almacenando todos los tubos a cuatro grados centígrados después de cinco minutos. Para el análisis de proteínas de señal, agregue 0,01 ml de solución de peróxido de luminol recién preparada a los pozos E-1 a E-25 de una nueva placa occidental automatizada, 0,01 ml de anticuerpo antiratón secundario a los pozos D-2 a D-25, y agregue 0,01 ml de peroxidasa de rábano picante estreptavidina del kit a D-1. Añadir 0,01 ml de anticuerpo primario recién preparado en los pozos C-2 a C-25, y 0,01 ml de diluyente de anticuerpos dos solución a los pozos C-1 y B-1 a B-25.Deje los pozos de la fila F vacíos y llene los cinco compartimentos de las tres filas debajo de la fila F con 0,45 ml de búfer de lavado. A continuación, gire brevemente las muestras refrigeradas durante 30 segundos y agregue 0,03 ml de cada muestra a cada pozo de la fila A, comenzando con A-2. A continuación, agregue 0,005 ml de la escalera de peso molecular biotinilado a A-1 y cubra la placa para la centrifugación.Mientras la placa está centrifugada, abra un nuevo archivo de ejecución en el software automatizado asociado occidental e inicie un ensayo de tamaño molecular. En la página del ensayo, introduzca los nombres de la muestra en cada capilar, así como los nombres de los anticuerpos primarios y secundarios. Al final de la centrifugación, coloque la placa en el instrumento occidental automatizado y pele la cubierta de la caja del cartucho capilar.Después de la centrifugación, no se olvide de inspeccionar si hay burbujas de aire, ya que las burbujas de aire en el capilar pueden bloquear la corriente electroforética y fallar toda la ronda. Inserte el cartucho en la posición designada dentro del instrumento y cierre la puerta. Haga clic en Inicio.Cuando se le solicite el tipo de ensayo, escriba el nombre del experimento en el cuadro de texto adecuado y haga clic en Aceptar. Cuando se le solicite la fecha de ejecución activada y el número de ID en el archivo de ejecución, anote la hora en que finaliza la ejecución. Al final de la carrera, deseche el cartucho capilar en la eliminación de objetos punzantes y la placa en la eliminación de materiales biopeligrosos.Después de la separación de la electroforesis, compruebe los archivos de ejecución en busca de picos de reactividad inmune de antígenos a 40 a 43 kilodaltones que se refieren al factor de iniciación de traducción eucariota fosforilada 2A. Cuando faltan picos de peso molecular de este tamaño, haga clic con el botón derecho debajo de la curva y seleccione agregar peso molecular al pico para asegurarse de que se registran los tamaños y las cantidades arbitrarias por debajo de la curva. Dentro de las muestras de tejido sin cebar, los niveles de proteína de aminoglobulina de unión en los núcleos de la vía solitaria son significativamente más altos en comparación con todas las otras regiones.El priming del tejido intestinal con calostro disminuye los niveles de proteína de aminoglobulina de unión en los núcleos de la vía solitaria y no tiene ningún efecto sobre los núcleos paraventriculares y los núcleos superópticos. Por el contrario, el cebado aumenta los niveles de proteína de aminoglobulina de unión dentro de la corteza, los núcleos deestura y los núcleos preópticos mediales en relación con el tejido sin cebar, lo que implica que los niveles de proteína de aminoglobulina de unión en los diversos núcleos cerebrales probados responden de manera diferente al cebado intestinal y todavía no hay ninguna conversación cruzada demostrada entre los diversos núcleos probados. Los niveles de iniciación de la traducción eucariota 2A y factor 2A de iniciación de la traducción eucariota fosforilados se elevan en la condición sin cebar en relación con otros núcleos.Después del cebado, los niveles del factor de iniciación de la traducción eucariota 2A y del factor de iniciación de la traducción eucariota fosforilada 2A se reducen en relación con los núcleos de la vía solitaria en comparación con el tejido no cebado. En todos los demás núcleos probados, el cebado aumenta los niveles del factor de iniciación de la traducción eucariota 2A y del factor 2A de iniciación de la traducción eucariota fosforilada en relación con el tejido no cebado. Sin embargo, los niveles del receptor de proteína quinasa fosforilada son bajos en muestras sin cebar en relación con muestras cebadas en núcleos de la vía solitaria, lo que sugiere fuertemente que otra quinasa está involucrada en la fosforilación del factor 2A de iniciación de la traducción eucariota.Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del desarrollo postnatal exploraran las vías de señalización implicadas en el crecimiento y diferenciación de los tejidos y si están influenciadas o independientes de la succión. No olvide que trabajar con agentes reductores volátiles como, por ejemplo, ditiothreitol, puede ser peligroso, y precauciones como la preparación en la campana química siempre deben tomarse al preparar este procedimiento.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Seven Steps to Stellate Cells

Siete pasos para células estrelladas

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Investigación

Inmunología e Infección

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

Trichuris muris infección: un modelo de tipo 2 inmunidad y la inflamación en el intestino

Trichuris muris is a natural pathogen of mice and is biologically and antigenically similar to species of Trichuris that 
infect humans and livestock1. ...

Assessing Somatic Hypermutation in Ramos B Cells after Overexpression or Knockdown of Specific Genes

La evaluación de la hipermutación somática en Ramos células B después de sobreexpresión o derribo de genes específicos

B cells start their life with low affinity antibodies generated by V(D)J recombination.  However, upon detecting a pathogen, the variable (V) region of an ...

Primary Microglia Isolation from Mixed Glial Cell Cultures of Neonatal Rat Brain Tissue

El aislamiento de la microglía Primaria cultivos mixtos de células gliales del tejido neonatal cerebro de rata

Microglia account for approximately 12% of the  total cellular population in the mammalian brain. While neurons and astrocytes are considered  the major ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia cultivo del Sistema Nervioso Central Neonatal y Adultos

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Modelo no invasiva de neuropatogénico<em&gt; Escherichia coli</em&gt; La infección en Neonatología Rata

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

La inducción de la inflamación intestinal murino por transferencia adoptiva de Efector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Alta</sup&gt; T células en ratones inmunodeficientes

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

La evaluación de la función retiniana Microglial fagocítica<em&gt; En Vivo</em&gt; El uso de un ensayo basado en citometría de flujo

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Immunofluorescence Analysis of Stress Granule Formation After Bacterial Challenge of Mammalian Cells

Análisis de inmunofluorescencia de la formación de gránulos de estrés tras el desafío bacteriano de las células de mamíferos

Fluorescent imaging of cellular components is an effective tool to investigate host-pathogen interactions. Pathogens can affect many different features of ...