Name: assessing cellular stress and inflammation in discrete oxytocin-secreting brain nuclei in the neonatal rat before and after first colostrum feeding
Uploaded: 2018-11-14T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Cellular Stress and Inflammation in Discrete Oxytocin-secreting Brain Nuclei in the Neonatal Rat Before and After First Colostrum Feeding at JoVE.co

Författarna tackar Manon Ranger och Alexandra Schulz för deras hjälp i utarbetandet av detta protokoll.

Denna studie godkändes av den institutionella djur vård och användning kommittéer vid Columbia University och New York State Psychiatric Institute.
1. vävnad förberedelse
<ol><li>Beställa tidsinställda dräktiga råttor från leverantör.</li>
	<li>Följ tidsinställda dräktiga råttor genom att observera deras växande abdomens veckorna efter deras ankomst och därefter letar efter valpar på förväntat leveransdatum genom att inspektera buren varje 2 h tills leverans börjar.</li...

<ol>
	<li>Hietaniemi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiles+in+fetal+and+neonatal+rat+offspring+of+energy-restricted+dams.">Gene expression profiles in fetal and neonatal rat offspring of energy-restricted dams.</a> Journal of Nutrigenetics and Nutrigenomics. 2 (4-5), 173-183 (2009).</li><li>Okabe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogenous+glycine+receptor+expression+in+cortical+plate+neurons+and+Cajal-Retzius+cells+of+neonatal+rat+cerebral+cortex.">Homogenous glycine receptor expression in cortical plate neurons and Cajal-Retzius cells of neonatal rat cerebral cortex.</a> Neuroscience. 123 (3), 715-724 (2004).</li><li>Mailleux, P., Takazawa, K., Erneux, C., Vanderhaeghen, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+the+neurons+containing+inositol+1,4,5-trisphosphate+3-kinase+and+its+messenger+RNA+in+the+developing+rat+brain.">Distribution of the neurons containing inositol 1,4,5-trisphosphate 3-kinase and its messenger RNA in the developing rat brain.</a> Journal of Comparative Neurology. 327 (4), 618-629 (1993).</li><li>Carter, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxytocin+and+Human+Evolution.">Oxytocin and Human Evolution.</a> Current Topics in Behavioral Neuroscience. , (2017).</li><li>Sippel, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxytocin+and+Stress-related+Disorders:+Neurobiological+Mechanisms+and+Treatment+Opportunities.">Oxytocin and Stress-related Disorders: Neurobiological Mechanisms and Treatment Opportunities.</a> Chronic Stress (Thousand Oaks). 1, (2017).</li><li>Agnati, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspects+on+the+integrative+actions+of+the+brain+from+neural+networks+to+"brain-body+medicine".">Aspects on the integrative actions of the brain from neural networks to "brain-body medicine".</a> Journal of Receptors and Signal Transduction Research. 32 (4), 163-180 (2012).</li><li>Welch, M. G., Margolis, K. G., Li, Z., Gershon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxytocin+regulates+gastrointestinal+motility,+inflammation,+macromolecular+permeability,+and+mucosal+maintenance+in+mice.">Oxytocin regulates gastrointestinal motility, inflammation, macromolecular permeability, and mucosal maintenance in mice.</a> American Journal Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 307 (8), G848-G862 (2014).</li><li>Welch, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+developmental+regulation+of+oxytocin+(OT)+and+oxytocin+receptors+(OTR)+in+the+enteric+nervous+system+(ENS)+and+intestinal+epithelium.">Expression and developmental regulation of oxytocin (OT) and oxytocin receptors (OTR) in the enteric nervous system (ENS) and intestinal epithelium.</a> Journal of Comparative Neurology. 512 (2), 256-270 (2009).</li><li>Prakash, B. S., Paul, V., Kliem, H., Kulozik, U., Meyer, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+oxytocin+in+milk+of+cows+administered+oxytocin.">Determination of oxytocin in milk of cows administered oxytocin.</a> Analytica Chimica Acta. 636 (1), 111-115 (2009).</li><li>Solangi, A. R., Memon, S. Q., Mallah, A., Khuhawar, M. Y., Bhanger, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+separation+of+oxytocin,+norfloxacin+and+diclofenac+sodium+in+milk+samples+using+capillary+electrophoresis.">Quantitative separation of oxytocin, norfloxacin and diclofenac sodium in milk samples using capillary electrophoresis.</a> Biomedical Chromatography. 23 (9), 1007-1013 (2009).</li><li>Klein, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxytocin+modulates+markers+of+the+unfolded+protein+response+in+Caco2BB+gut+cells.">Oxytocin modulates markers of the unfolded protein response in Caco2BB gut cells.</a> Cell Stress and Chaperones. 19 (4), 465-477 (2014).</li><li>Klein, B. Y., Tamir, H., Hirschberg, D. L., Glickstein, S. B., Welch, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxytocin+modulates+mTORC1+pathway+in+the+gut.">Oxytocin modulates mTORC1 pathway in the gut.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 432 (3), 466-471 (2013).</li><li>Klein, B. Y., Tamir, H., Ludwig, R. J., Glickstein, S. B., Welch, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colostrum+oxytocin+modulates+cellular+stress+response,+inflammation,+and+autophagy+markers+in+newborn+rat+gut+villi.">Colostrum oxytocin modulates cellular stress response, inflammation, and autophagy markers in newborn rat gut villi.</a> Biochemical an Biophysical Research Communications. 487 (1), 47-53 (2017).</li><li>Donnet-Hughes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+role+of+the+intestinal+microbiota+of+the+mother+in+neonatal+immune+education.">Potential role of the intestinal microbiota of the mother in neonatal immune education.</a> Proceedings of the Nutritional Society. 69 (3), 407-415 (2010).</li><li>Perez, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+imprinting+of+the+neonatal+immune+system:+lessons+from+maternal+cells?.">Bacterial imprinting of the neonatal immune system: lessons from maternal cells?.</a> Pediatrics. 119 (3), e724-e732 (2007).</li><li>Takeda, S., Kuwabara, Y., Mizuno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentrations+and+origin+of+oxytocin+in+breast+milk.">Concentrations and origin of oxytocin in breast milk.</a> Endocrinolcia Japonica. 33 (6), 821-826 (1986).</li><li>Quintana, D. S., Outhred, T., Westlye, L. T., Malhi, G. S., Andreassen, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+oxytocin+administration+on+brain+activity:+a+systematic+review+and+meta-analysis+protocol.">The impact of oxytocin administration on brain activity: a systematic review and meta-analysis protocol.</a> Systematic Reviews. 5 (1), 205 (2016).</li><li>Dobbing, J., Sands, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+aspects+of+the+brain+growth+spurt.">Comparative aspects of the brain growth spurt.</a> Early Human Development. 3 (1), 79-83 (1979).</li><li>Orr, M. E., Garbarino, V. R., Salinas, A., Buffenstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extended+Postnatal+Brain+Development+in+the+Longest-Lived+Rodent:+Prolonged+Maintenance+of+Neotenous+Traits+in+the+Naked+Mole-Rat+Brain.">Extended Postnatal Brain Development in the Longest-Lived Rodent: Prolonged Maintenance of Neotenous Traits in the Naked Mole-Rat Brain.</a> Frontiers in Neuroscience. 10, 504 (2016).</li><li>Hansson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+quantitative+proteome+analysis+of+in+vivo+intestinal+development.">Time-resolved quantitative proteome analysis of in vivo intestinal development.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 10 (3), (2011).</li><li>Mochizuki, K., Yorita, S., Goda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+changes+in+the+jejunum+of+rats+during+the+transient+suckling-weaning+period.">Gene expression changes in the jejunum of rats during the transient suckling-weaning period.</a> Journal of Nutritional Science and Vitaminology (Tokyo). 55 (2), 139-148 (2009).</li><li>Rinaman, L., Banihashemi, L., Koehnle, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+life+experience+shapes+the+functional+organization+of+stress-responsive+visceral+circuits.">Early life experience shapes the functional organization of stress-responsive visceral circuits.</a> Physiology and Behavior. 104 (4), 632-640 (2011).</li><li>Johannes, G., Sarnow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cap-independent+polysomal+association+of+natural+mRNAs+encoding+c-myc,+BiP,+and+eIF4G+conferred+by+internal+ribosome+entry+sites.">Cap-independent polysomal association of natural mRNAs encoding c-myc, BiP, and eIF4G conferred by internal ribosome entry sites.</a> RNA. 4 (12), 1500-1513 (1998).</li><li>Rinaman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hindbrain+noradrenergic+A2+neurons:+diverse+roles+in+autonomic,+endocrine,+cognitive,+and+behavioral+functions.">Hindbrain noradrenergic A2 neurons: diverse roles in autonomic, endocrine, cognitive, and behavioral functions.</a> American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 300 (2), R222-R235 (2011).</li><li>Walker, C. D., Toufexis, D. J., Burlet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothalamic+and+limbic+expression+of+CRF+and+vasopressin+during+lactation:+implications+for+the+control+of+ACTH+secretion+and+stress+hyporesponsiveness.">Hypothalamic and limbic expression of CRF and vasopressin during lactation: implications for the control of ACTH secretion and stress hyporesponsiveness.</a> Progress in Brain Research. 133, 99-110 (2001).</li><li>Montiel-Castro, A. J., Gonzalez-Cervantes, R. M., Bravo-Ruiseco, G., Pacheco-Lopez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microbiota-gut-brain+axis:+neurobehavioral+correlates,+health+and+sociality.">The microbiota-gut-brain axis: neurobehavioral correlates, health and sociality.</a> Frontiers in Integrative Neuroscience. 7, 70 (2013).</li><li>Blevins, J. E., Ho, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+oxytocin+signaling+in+the+regulation+of+body+weight.">Role of oxytocin signaling in the regulation of body weight.</a> Reviews in Endocrine and Metabolic Disorders. 14 (4), 311-329 (2013).</li><li>Welch, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+administration+of+secretin+and+oxytocin+inhibits+chronic+colitis+and+associated+activation+of+forebrain+neurons.">Combined administration of secretin and oxytocin inhibits chronic colitis and associated activation of forebrain neurons.</a> Neurogastroenterology Motility. 22 (6), 654 (2010).</li><li>Berthoud, H. R., Neuhuber, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+chemical+anatomy+of+the+afferent+vagal+system.">Functional and chemical anatomy of the afferent vagal system.</a> Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical. 85 (1-3), 1-17 (2000).</li><li>Taniuchi, S., Miyake, M., Tsugawa, K., Oyadomari, M., Oyadomari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+stress+response+of+vertebrates+is+regulated+by+four+eIF2alpha+kinases.">Integrated stress response of vertebrates is regulated by four eIF2alpha kinases.</a> Scientific Reports. 6, 32886 (2016).</li><li>Altschuler, S. M., Bao, X. M., Bieger, D., Hopkins, D. A., Miselis, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscerotopic+representation+of+the+upper+alimentary+tract+in+the+rat:+sensory+ganglia+and+nuclei+of+the+solitary+and+spinal+trigeminal+tracts.">Viscerotopic representation of the upper alimentary tract in the rat: sensory ganglia and nuclei of the solitary and spinal trigeminal tracts.</a> Journal of Comparative Neurology. 283 (2), 248-268 (1989).</li><li>Shapiro, R. E., Miselis, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+central+neural+connections+of+the+area+postrema+of+the+rat.">The central neural connections of the area postrema of the rat.</a> Journal of Comparative Neurology. 234 (3), 344-364 (1985).</li><li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , (1997).</li><li>Nayak, R., Pintel, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+viruses+can+induce+phosphorylation+of+eIF2alpha+via+PKR+activation,+which+can+be+overcome+by+helper+adenovirus+type+5+virus-associated+RNA.">Adeno-associated viruses can induce phosphorylation of eIF2alpha via PKR activation, which can be overcome by helper adenovirus type 5 virus-associated RNA.</a> Journal of Virology. 81 (21), 11908-11916 (2007).</li><li>Zaborske, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+tRNA+charging+and+activation+of+the+eIF2+kinase+Gcn2p.">Genome-wide analysis of tRNA charging and activation of the eIF2 kinase Gcn2p.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (37), 25254-25267 (2009).</li><li>Hollis, J. H., Lightman, S. L., Lowry, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+systemic+and+visceral+sensory+information+by+medullary+catecholaminergic+systems+during+peripheral+inflammation.">Integration of systemic and visceral sensory information by medullary catecholaminergic systems during peripheral inflammation.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1018, 71-75 (2004).</li><li>Klein, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxytocin+opposes+effects+of+bacterial+endotoxin+on+ER-stress+signaling+in+Caco2BB+gut+cells.">Oxytocin opposes effects of bacterial endotoxin on ER-stress signaling in Caco2BB gut cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1860 (2), 402-411 (2016).</li><li>Kaltschmidt, B., Kaltschmidt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB+in+the+nervous+system.">NF-kappaB in the nervous system.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (3), a001271 (2009).</li></ol>

En teknik för lokalt av diskreta, OTR-rika hjärnan kärnor i hjärnans neonatal råtta presenteras i denna uppsats. Det är väl känt att nervceller är högt specialiserade, även inom välkarakteriserad kärnor i hjärnan. Mycket reproducerbara sätt att isolera specifika OTR-rika atomkärnor kan robust hypotesprövning. Med hjälp av automatiserade Western blotting, förbättrades konsekvens och reproducerbarheten för resultaten ytterligare. En begränsning av denna teknik är fortfarande blygsam hjärnan punch va...

I motsats till vår förståelse för tidig hjärnans utveckling sker under loppet av dagar-på-veckor postpartum, är relativt lite känt om myriaden av dynamiska ändringar som inträffar under de första timmarna av liv i råttor. En viktig utmaning har varit den lilla storleken på neonatal råtta hjärnan och ett krav för högteknologiska verktyg att isolera diskret hjärnregioner eller enstaka celler. Studier bedöma ofta gen transkription och inte translation1,2, som inte ger en fast förståelse för funktionella nivåer av aktiveras signalmolekyler. Andra undersöka uttryck med immunohistokemi till referens av hjärnan, som inte tillåter för kvantifiering av expression nivåer3. Ingen studie hittills har undersökt aktivering av signalering vägar som är associerad med råtta första råmjölk foder i diskreta hjärnregioner, som kräver snabb isolering och offer och mätning av proteiner och protein fosforylering via Western blotting. Medan hjärnan lokalt utförs på äldre och större hjärnor, har vi inte identifierat en referens som utför en icke-single-cell hjärnan punch i en P0 hjärna. Detta dokument presenterar ett protokoll för att isolera begränsade regioner i neonatal hjärnan med hjälp av en relativt lågteknologiska punch-teknik och en Western blotting förfarande för att mäta proteinuttryck i relativt små prover. Detta protokoll kan vara lämplig för forskningsfrågor som kräver bedömning av proteinuttryck och post-translationella modifieringar (t.ex., fosforylering) i relativt begränsade regioner av små hjärnor av alla arter, under förutsättning att de användaren kan visuellt identifiera hjärnregionen sevärdheter med en atlas och identifierbara landmärken.
Denna teknik utvecklades för att förstå förändringar som sker i hjärnan till följd av den neonatala råttor första råmjölk foder, som är rik på oxytocin (OT). OT har länge känt för dess förmåga att stimulera mjölk låt ned och livmoderns sammandragning. OT är dock nu känt att spela ett brett utbud av roller i regleringen av många kroppsliga funktioner och beteenden4. Till exempel OT motsätter sig stress och inflammation i samband med adaptiv affiliative beteenden5, fördröjer magtömningen och saktar intestinal transitering. OT-receptorer (OTR) har identifierats i enteriska nervceller och intestinala epitelet6,7,8. Gastrointestinala effekter av OT är särskilt viktiga för barnet under den tidiga postnatala perioden. Exempelvis amning är kopplade till leveransen av betydande mängder OT till neonatal gut9,10, och data visar att OTR är kraftigt ökad utsträckning hos duodenal villi under mjölken diande perioden8.
In vitro försök med en gut cellinje har visat på cellnivå att oxytocin modulerar viktiga molekyler i den stress som signalering utbildningsavsnitt11,12 och en reglerande roll i översättning av proteiner 12. dessa studier tyder på att komponenter av mjölk, inklusive exogena oxytocin från mamman, är viktiga i ovikta protein svaret hos nyfödda att minska cellulär stress13.
In vivo och ex vivo -studier har visat att råmjölk OT modulerar cellulär stress svar, inflammation och autofagi markörer i nyfödda råtta gut villi. Nyfödd enterocyter lida betydande cellulär stress på deras luminala sida när tarmen utsätts samtidigt för bakterieflora från mamman i råmjölk14,15 och många proteiner, inklusive hormoner såsom OT9 , 10 , 16.
Effekterna av OT på hjärnan har studerat17. OT signalering mekanismerna visat i tarmen under den tidiga postnatala perioden har dock inte studerats i hjärnan. I detta papper används en metod för att isolera diskret hjärnan kärnor i neonatal råtta hjärnstammen och hypotalamus med elektrofores att profilera isolerade hjärnregioner. Det övergripande målet med denna metod är att fånga delstaten cell signalering i hjärnområden så nära som möjligt till födelse, före och efter den första mjölk som diande, i hjärnvävnad med lägsta gliaceller/neuronala index. Grunden för utvecklingen av denna teknik är att det tillåter för snabb isolering av begränsade, mikroskopiska av hjärnan hos nyfödda ungar med en mer homogen samling av nervceller för ex vivo studier med hjälp av en automatiserad Western blotting metodik, erbjuder mycket konsekvent resultat på relativt små dissekerade prover. En brist av tidigare arbete innehåller fler brutto dissektion (hjärnan skivor eller hela hjärnan) och äldre djur18,19. Hjärnan hos unga valpar är otroligt dynamiska, med vågor av gliaceller differentiering efter födseln. För att studera förändringar i hjärnan påverkas av pups' första utfodring, är det nödvändigt att studera begränsade neuronala atomkärnor med reproducerbara dissektion.
Mjölk foder är vanligtvis analyseras för dess immunologiska och näringsmässiga inverkan på hälsa eller gen uttryck (till exempel i enterocyter20,21), medan dess inverkan på hjärnområden under hjärnans utveckling studeras sällan. Effekten av mjölk transit i tarmen på hjärnans funktion analyserades med hänvisning till gut cholecystokinin receptorer vagala relä till hjärnstammen kärnor, men inte till Intracellulär signalering vägar22. Det finns en omfattande litteratur på sårbarhet för hjärnans utveckling nyfödda undernäring av mödrar under graviditeten23, men stress och inflammation signalerna behandlas inte. Ännu viktigare, utnyttjar den nuvarande metoden ett fenomen i dag noll råtta nyfödda som isolerar de blod-född råmjölk stimuli från vagala relä av viscerala stimuli. Detta är den så kallade stress hypo-lyhördhet period kännetecknas av omogna kärnan tractus solitarius (NTS)-hypotalamus krets omedelbart efter födseln24,25 som begränsar NTS, paraventricular nucleus (PVN), och supraoptic kärnan (SON) signaler till blod-född stimuli.
Denna metod är användbar för analys av flera signalvägar och begränsade relativt till neuronala celler, förutsatt att hjärnvävnaden skördas vid postnatal dag-0 hos råttor, förutom om mödrar har ifrågasatts eller inte genom någon form av behandling under graviditet. Kullar kan analyseras effekterna av råmjölk foder jämfört med före utfodring signalering. När man jämför signaler mellan hjärnområden med fattiga mot rika protein avkastning, kan denna metod i-kapillär bestämning av totalt protein av kapillärer som löper parallellt med immun-kvantitering av proteinantigener polypeptid band. Denna metod möjliggör kvantitativa jämförelsen, med godtyckliga enheter, av resultat som erhållits av samma antikropp utan standard kvantitativa kurvor och med hänvisning till totalt protein per kapillär. Jämför resultaten av olika antikroppar är möjligt endast med hjälp av kvantitativa standard kurvor.
Denna metod tillåtet för bedömning av dubbelriktad signalering mellan tarmen och hjärnan och som kan påverka funktionen i båda organ26. Associationen mellan oxytocin och mat intag, som har studerats i senaste åren27, stöder ett samband mellan ökad oxytocin signalering och näringsämnen tillgänglighet. Dessa studier stöder också begreppet converse att energi underskott kopplas ihop med minskningar i hypotalamus oxytocin signalering.
Tidigare studier av effekten av OT på hjärnans aktivitet visade att inducerade tarm inflammation framkallas cFos transkription i hypotalamus PVN, amygdala och piriform cortex som var refraktära mot vagotomy28. Systemiska infusion av OT med sekretin minskade dock att hjärnan cFos bemöta den provocerade inflammatorisk reaktionen i tarmen28. Detta tyder på att effekten av exogena OT genomfördes av vägar än vagala reläer, eventuellt via blodburna signalmolekyler transporteras genom området postrema6,29.
I denna studie bedömdes de signalvägar som cellulär stress som har tidigare observerats i tarmen i hjärnan. Hypotesen var att mjölk komponenter kan skydda eller skjuta upp effekten av inflammation på gut permeabilitet mikrobiell och andra metaboliter, och i sin tur effekter på hjärnans funktion. De tydliga antagonistiska skillnaderna i IkB kontra BiP signalering Funna i villi, före och efter priming av råmjölk13, föreslog att hjärnan hos nyfödda, fortfarande håller på att utveckla, kan känna dessa råmjölk-inducerad gut signaler.
Signalering protein markörer som används i tidigare gut experiment som är associerade med endoplasmatiska nätverket stress mättes. De inkluderar ER förkläde BiP, översättning inledande faktor eIF2a (som fungerar som en stress reaktion integrator30), eIF2a kinase p-PKR, och två inflammation-signalering proteiner (NF-kB och dess hämmare, IkB).
Sex regioner i hjärnan utifrån deras förmåga hos vuxna att utsöndra eller svara på OT valdes. NTS, ligger på övre medulla, den första relän av visceral input och tar emot direkt signalering från vagala sensoriska nervceller i tarmen31 och eventuellt blod-född cytokiner, gifter och hormoner via den angränsande område-postrema32. PVN, supraoptic kärnan (SON), striatum atomkärnor (STR), cerebral cortex (CX) och mediala preoptic kärnan (MPO) får signalering från tarmen via NTS.
Resultaten visade att den cellulära stressreaktionen under omedelbara postnatala perioden före råmjölk priming och omedelbart efter första utfodring är olika i NTS jämfört med PVN och SON. Signalering i CX, STR och MPO skilde sig från PVN och SON, liksom. De distinkta skyddande funktionerna av OT visat tidigare att modulera cell stress och inflammation i tarmen är sannolikt kände av vissa områden i hjärnan. Data visar sammantaget att på cellnivå, under de första timmarna efter födseln, hjärnan svarar på metabola stress i samband med näringsämnen insufficiens. Data visar också att omfattning och riktning av råmjölk foder modulerande effekter är region-beroende och att i vissa regioner, de speglar OT effekter visas tidigare i tarmen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bradford solution</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein lysis kit</td>
			<td>Protein simple</td>
			<td>CBS403</td>
			<td>Bicine/CHAPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WES kits</td>
			<td>Protein simple</td>
			<td>WES-Mouse 12-230 master kit (PS-MK15), WES-Rabbit 12-230 master kit (PS-MK14), WES 12-230 kDa total Protein master kit (PS-TP07)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse IgG HRP conjugate</td>
			<td>Protein simple</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-phospho-eIF2a</td>
			<td>Cell Signaling technology</td>
			<td>SER51, 9721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse mAb anti-PKR</td>
			<td>Cell Signaling technology</td>
			<td>2103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-phospho-PKR</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Thr451, 07-886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit mAb anti-PKR</td>
			<td>Cell Signaling technology</td>
			<td>12297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit mAb anti-GAPDH</td>
			<td>Cell Signaling technology</td>
			<td>2118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse mAb anti-phospho-IKB</td>
			<td>Cell Signaling technology</td>
			<td>9246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse mAb anti-IKB</td>
			<td>Cell Signaling technology</td>
			<td>4814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-BiP</td>
			<td>Cell Signaling technology</td>
			<td>3183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti GCN2</td>
			<td>Cell Signaling technology</td>
			<td>3302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit mAb anti-phospho-GCN2</td>
			<td>BIORBYT</td>
			<td>T899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pregnant Sprague-Dawley rats</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Punch device</td>
			<td>WellTech Rapid Core or Harris Uni-Core</td>
			<td>0.35, 0.50, 0.75, 1.0, 1.20, 1.50</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing cellular stress and inflammation in discrete oxytocin-secreting brain nuclei in the neonatal rat before and after first colostrum feeding

Målet med detta protokoll är att isolera oxytocin-receptor rika hjärnan kärnor i neonatal hjärnan före och efter första råmjölk utfodring. Uttrycket av proteiner känt att bemöta metabol stress mättes i hjärnan-kärnor isolat med hjälp av Western blotting. Detta gjordes för att bedöma om metabola stressinducerade näringsämnen insufficiens i kroppen utlöste neuronala stress. Vi har tidigare visat att näringsämnen insufficiens hos nyfödda framkallar metabol stress i tarmen. Dessutom modulerar råmjölk oxytocin cellulär stress svar, inflammation och autofagi markörer i nyfödda råtta gut villi före och efter första matningen. Signalering protein markörer associerade med endoplasmatiska nätverket stress [ER förkläde bindande immunglobulin protein (BiP), eukaryota översättning inledande faktor 2A (eIF2a), och eIF2a kinase proteinkinas R (p-PKR)], samt två inflammation-signalering proteiner [nuclear factor-κB (NF-kB) och hämmare κB (IkB)], mättes i nyfödda hjärnan kärnor [kärnan i den ensliga tarmkanalen (NTS), paraventricular nucleus (PVN), supra-optic nucleus (SON), cortex (CX), striatum atomkärnor (STR), och mediala preoptic kärnan (MPO)] innan de första foder (ovaccinerade av råmjölk) och efter starten av omvårdnad (Primas av råmjölk). Uttryck för BiP/GRP78 och p-eIF2a var uppreglerad i ovaccinerade och nedreglerade i primade NTS vävnad. NF-kB behölls (hög) i CX, STR och MPO cytoplasman, medan NF-kB var lägre och oförändrad i NTS, PVN och SON i båda villkoren. Den kollektiva BiP och p-eIF2 resultaten överensstämmer med en stressreaktion. eIf2a var fosforyleras av dsRNA beroende kinase (p-PKR) i SON, CX, STR och MPO. Dock var i NTS (och i mindre utsträckning i PVN), eIf2a fosforyleras av ett annat kinase, allmän kontroll nonderepressible-2 tyrosinkinashämmare (GCN2). Stress-modulerande mekanismerna tidigare observerade hos nyfödda gut enterocyter verkar speglas i vissa regioner med OTR-rika i hjärnan. De NTS och PVN kan utnyttja en annan fosforylering mekanism (under näringsbrist) från andra regioner och vara refraktära mot effekterna av näringsämnen insufficiens. Sammantaget tyder denna data på att hjärnan Svaren till näringsämnen insufficiens stress uppvägs av signalering från råmjölk-primade enterocyter.

Immunoreaktivitet i förhållande till totalt protein representativa band visar att det finns hjärnan atomkärnor med mycket låg skördade protein. Detta kräver användning av automatiserade Western blot tekniken, som är mycket känsliga jämfört den kanoniska Western blot. Detta tillvägagångssätt kan köras med fortyfold mindre protein per kapillär jämfört med den per-lanen i Western blotting.
Differentiella effekter av...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Cellular Stress and Inflammation in Discrete Oxytocin-secreting Brain Nuclei in the Neonatal Rat Before and After First Colostrum Feeding at JoVE.co

Assessing Cellular Stress and Inflammation in Discrete Oxytocin-secreting Brain Nuclei in the Neonatal Rat Before and After First Colostrum Feeding

Bedömningen av cellulär Stress och Inflammation i diskreta Oxytocin-utsöndrar hjärnan kärnor i Neonatal råtta, före och efter första råmjölk utfodring

Här presenterar vi ett protokoll för att isolera hjärnan kärnor i neonatal råtta hjärnan i samband med första råmjölk utfodring. Denna teknik tillåter studier av näringsämnen insufficiens stress i hjärnan som moduleras av enterocyter signalering.

The goal of this protocol is to isolate oxytocin-receptor rich brain nuclei in the neonatal brain before and after first colostrum feeding. The expression ...

Denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga frågor i postnatal utveckling området om hur mjölk agande påverkar stress signalering i hjärnan. Denna teknik kan användas för att fånga specifika områden i hjärnan under den första naturliga svältperioden och för att jämföra dem med respektive områden strax efter den första naturliga råmjölk foder. Förstå hur a suckling påverkar fysiologi beteende och känslor möjliggör användning av en antagonist till olika receptorer under ex-vivo hjärnvävnad analys.För att få kärnorna stansar, ta bort råttans ungar av svansen med en handske. Efter skörd hjärnan, snabbt placera hela organet i en polymetyl metakrylat hjärnan mögel vid rumstemperatur och omedelbart använda ett nytt rakblad för att göra 500 mikrometer tjocka skivor av vävnaden. Lägg skivorna rostral till caudal i en Petri-skålen som de erhålls för att upprätthålla rätt inriktning av sektionerna.När hela hjärnan har delats upp, tillsätt snabbt konstgjord cerebral spinalvätska utan glukos till skålen och inkubera skivorna i 60 minuter vid 28 till 30 grader Celsius med konstant omrörning på en orbital shaker. Använd en hjärna atlas och anatomiska landmärken på varje vävnad för att identifiera hjärnan kärnor som skall stansas och placera skiva med kärnor av intresse i en ny Petriskål under en dissekera mikroskop. När visualiseras, använd ett koringverktyg för att snabbt stämpla ut fyra till sex olika kärnor och snabbt fördjupa varje stansad kärna i 0,06 mL iskallt protein extraktion buffert i lämpligt märkta mikro-centrifuge röret som innehåller proteushämmare och fosfatashämmare i 60 minuter.I slutet av inkubationen centrifugerar de extraherade kärnorna i en kyld mini-centrifug, och använd en mikropipett för att noggrant överföra 0,055 mL supernatant från varje rör till lämpligt förkylt 1,5 mL mikro-centrifugrör på is. Före negativ 20 grader Celsius lagring, överför 0,012 mL supernatant från varje proteinlagerrör till lämpligt 0,5 mL färdigkylt rör på is för första provberedningen. För att förbereda proverna för in-kapillär proteinmätning, tillsätt 0,003 mL master mix reagens från ett protein lyssats till vart och ett av proverna i de 0,5 mL märkta rören.Därefter lägger du till 0,004 mL master mix-reagens till en biotinylerad steglösning med molekylvikt i 0,016 mL av avjoniserat vatten, och denaturerar stegen och proteinextraktprover i ett 95 grader Celsius värmeblock, som lagrar alla rören vid fyra grader Celsius efter fem minuter. För signalproteinanalys, tillsätt 0,01 mL nyberedda luminolperoxidlösning till brunnar E-1 till E-25 av en ny automatiserad Western plate, 0,01 mL sekundär anti-mus antikropp till brunnar D-2 till D-25, och tillsätt 0,01 mL sttaradikaperoxidas från kitet till väl D-1. Lägg till 0,01 mL nyberedda primära antikroppar i brunnar C-2 till C-25, och 0,01 mL av antikropp spädningsvätska två lösning till brunnar C-1 och B-1 till B-25.Lämna rad F-brunnarna tomma och fyll de fem facken på de tre raderna under F-raden med 0,45 mL tvättbuffert. Därefter snurrar du kortfattat de kylda proverna i 30 sekunder och lägger till 0,03 mL av varje prov till varje brunn i rad A, med början på A-2. Lägg sedan till 0,005 mL av den biotinylerade stege med molekylvikt till väl A-1 och täck över plattan för centrifugeringen.Medan plattan är centrifugerad, öppna en ny kör fil i den automatiserade västerländska associerade programvara och initiera en molekylär storlek analys. I analysen sidan, ange provet namnen i varje kapillär samt namnen på den primära och sekundära antikroppar. Placera plattan i det automatiserade västerländska instrumentet i slutet av centrifugeringen och skala överdraget från kapillärkassetten.Efter centrifugeringen, glöm inte att inspektera för luftbubblor, eftersom luftbubblor i kapillären kan blockera den elektroforetiska strömmen och misslyckas hela rundan. Sätt in patronen i det avsedda läget inom instrumentet och stäng luckan. Klicka på start.När du uppmanas med typen av analysen, ange namnet på experimentet i lämplig textruta och klicka på okej. När du uppmanas av det aktiverade kördatumet och ID-numret på körfilen, anteckna den tid då körningen avslutas. I slutet av körningen, kassera kapillär patronen i vassen förfogande och plattan i biohazardous material förfogande.Efter elektroforesseparationen, kontrollera kör filer för immun reaktivitet toppar av antigener på 40 till 43 kilodalton som står för fosforylerade eukaryot översättning inledande faktor 2A. Där molekylviktstoppar av denna storlek saknas, högerklicka under kurvan och välj lägg till molekylvikt till topp för att säkerställa att storlekar och godtyckliga storheter under kurvan registreras. Inom unprimeds vävnadsprover, bindande aminoglobulin proteinnivåer i kärnorna i den ensamma spåret är betydligt högre jämfört med alla andra regioner.Priming av tarmen vävnad med råmjölk minskar bindande aminoglobulin proteinnivåer i kärnorna i den ensamma spåret och har ingen effekt på paraventricular kärnor och super-optic atomkärnor. Omvänt, priming ökar bindande aminoglobulin proteinnivåer inom cortex, striation kärnor, och mediala preoptic atomkärnor i förhållande till den unprimed vävnaden, vilket innebär att bindande aminoglobulin proteinnivåer i de olika testade hjärnan kärnor svara olika på gut priming och det finns ännu inte någon visat överhörning mellan de olika atomkärnor testas. Eukaryotic översättning inledande faktor 2A och fosforylerat eukaryota översättning inledande faktor 2A nivåer är förhöjda i det unprimed villkoret i förhållande till andra kärnor.Efter priming, nivåer av både eukaryotic översättning inledande faktor 2A och fosforylerat eukaryotic översättning inledande faktor 2A minskas i förhållande till atomkärnor av den ensamma spåret jämfört med unprimed vävnad. I alla andra testade kärnor, priming ökar nivåerna av eukaryota översättning inledande faktor 2A och fosforylerade eukaryota översättning inledande faktor 2A i förhållande till unprimed vävnad. Nivåerna av fosforylerat proteinkinasreceptorn är dock låga i opprimade prover i förhållande till grunda prover i kärnor i det ensamma spåret, vilket starkt tyder på att en annan kinas är involverad i fosforylering av eukaryotisk översättning initiering faktor 2A.Efter dess utveckling banade denna teknik vägen för forskare inom postnatal utveckling att utforska de signalvägar som är involverade i vävnadstillväxt och differentiering och om de påverkas av eller oberoende av agande. Glöm inte att arbeta med flyktiga reduktionsmedel som till exempel, dithiothreitol, kan vara farligt, och försiktighetsåtgärder såsom beredning i den kemiska huven bör alltid vidtas när du förbereder detta förfarande.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Seven Steps to Stellate Cells

Sju steg till stellate celler

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

Trichuris Muris Infektion: En modell av typ 2 Immunitet och inflammation i tarmen

Trichuris muris is a natural pathogen of mice and is biologically and antigenically similar to species of Trichuris that 
infect humans and livestock1. ...

Assessing Somatic Hypermutation in Ramos B Cells after Overexpression or Knockdown of Specific Genes

Bedöma Somatisk Hypermutation i Ramos B-celler efter överuttryck eller Knockdown av specifika gener

B cells start their life with low affinity antibodies generated by V(D)J recombination.  However, upon detecting a pathogen, the variable (V) region of an ...

Primary Microglia Isolation from Mixed Glial Cell Cultures of Neonatal Rat Brain Tissue

Primär Mikroglia Isolering från Blandade gliaceller Kulturer av nyfödda råttor Brain Tissue

Microglia account for approximately 12% of the  total cellular population in the mammalian brain. While neurons and astrocytes are considered  the major ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Odling Mikroglia från neonatal och vuxna centrala nervsystemet

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Icke-invasiv Modell av Neuropathogenic<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Infektion i neonatal Rat

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolering av Salmonella typhimurium-innehållande Phagosomes från makrofager

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

Bedömningen av cellulära immunsvaret hos bananflugan, Drosophila melanogaster, använder ett fagocytos i Vivo test

In all animals, innate immunity provides an immediate and robust defense against a broad spectrum of pathogens. Humoral and cellular immune responses are ...

Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA

Högeffektiv transfektion av primära makrofager med in vitro-transkriberad mRNA

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern ...

Blocking Lymph Flow by Suturing Afferent Lymphatic Vessels in Mice

Blockering Lymfflödet genom suturering afferenta lymfkärl hos möss

Lymphatic vessels are critical in maintaining tissue fluid balance and optimizing immune protection by transporting antigens, cytokines, and cells to ...