Name: culturing and manipulation of o9-1 neural crest cells
Uploaded: 2018-10-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells at JoVE.com

ניקול Stancel, Ph.d., ELS, הפרסומים המדעיים במכון הלב טקסס, סיפק תמיכה העריכה. אנו מודים גם את מקורות המימון הבאים: מענק פיתוח של מדען מרכז של איגוד הלב האמריקני הלאומי (14SDG19840000 כדי ג'יי וואנג), לורנס 2014 מחקר פרס Rolanette, Berdon לורנס עצם המחלה תוכנית טקסס (כדי ג'יי וואנג ), ולא את המכונים הלאומיים לבריאות (DE026561 ו- DE025873 ג'יי Wang, DE016320, DE019650 ל ר מקסון).

1. הכנה לפני תרבית תאים O9-1
הערה: הבסיס מדיה המשמשת עבור תרבית תאים O9-1 בטח יש כבר נעשים על ידי סנדוס מוכלאים עכברים thioguanine/ouabain-עמידים (STO) העכבר פיברובלסט תאים; לכן, STO תאים צריך להיות שהושג והכינו כמפורט להלן לפני שמתחילים תרבית תאים O9-1.
<ol><li>
תרבית תאים STO פעיל
	<ol>
<li>לה?...

<ol>
	<li>Achilleos, A., Trainor, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+stem+cells:+discovery,+properties+and+potential+for+therapy.">Neural crest stem cells: discovery, properties and potential for therapy.</a> Cell Research. 22 (2), 288-304 (2012).</li><li>Le Douarin, N. M., Dupin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotentiality+of+the+neural+crest.">Multipotentiality of the neural crest.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 13 (5), 529-536 (2003).</li><li>Santagati, F., Rijli, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cranial+neural+crest+and+the+building+of+the+vertebrate+head.">Cranial neural crest and the building of the vertebrate head.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 4 (10), 806-818 (2003).</li><li>Cordero, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cranial+neural+crest+cells+on+the+move:+their+roles+in+craniofacial+development.">Cranial neural crest cells on the move: their roles in craniofacial development.</a> American Journal of Medical Genetics. Part A. 155 (2), 270-279 (2011).</li><li>Trainor, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Craniofacial+birth+defects:+The+role+of+neural+crest+cells+in+the+etiology+and+pathogenesis+of+Treacher+Collins+syndrome+and+the+potential+for+prevention.">Craniofacial birth defects: The role of neural crest cells in the etiology and pathogenesis of Treacher Collins syndrome and the potential for prevention.</a> American Journal of Medical Genetics. Part A. 152 (12), 2984-2994 (2010).</li><li>Bronner, M. E., Simoes-Costa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neural+crest+migrating+into+the+twenty-first+century.">The neural crest migrating into the twenty-first century.</a> Current Topics in Developmental Biology. , 115-134 (2016).</li><li>Zurkirchen, L., Sommer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quo+vadis:+tracing+the+fate+of+neural+crest+cells.">Quo vadis: tracing the fate of neural crest cells.</a> Current Opinion in Neurobiology. 47, 16-23 (2017).</li><li>Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+regulatory+network+orchestrates+neural+crest+formation.">A gene regulatory network orchestrates neural crest formation.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 9 (7), 557-568 (2008).</li><li>Knecht, A. K., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+the+neural+crest:+a+multigene+process.">Induction of the neural crest: a multigene process.</a> Nature Reviews. Genetics. 3 (6), 453-461 (2002).</li><li>Steventon, B., Carmona-Fontaine, C., Mayor, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+network+during+neural+crest+induction:+from+cell+specification+to+cell+survival.">Genetic network during neural crest induction: from cell specification to cell survival.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 16 (6), 647-654 (2005).</li><li>Raible, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+neural+crest:+achieving+specificity+in+regulatory+pathways.">Development of the neural crest: achieving specificity in regulatory pathways.</a> Current Opinion in Cell Biology. 18 (6), 698-703 (2006).</li><li>Dupin, E., Sommer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+progenitors+and+stem+cells:+from+early+development+to+adulthood.">Neural crest progenitors and stem cells: from early development to adulthood.</a> Developmental Biology. 366 (1), 83-95 (2012).</li><li>Henion, P. D., Weston, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timing+and+pattern+of+cell+fate+restrictions+in+the+neural+crest+lineage.">Timing and pattern of cell fate restrictions in the neural crest lineage.</a> Development. 124 (21), 4351-4359 (1997).</li><li>Harris, M. L., Erickson, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+specification+in+neural+crest+cell+pathfinding.">Lineage specification in neural crest cell pathfinding.</a> Developmental Dynamics. 236 (1), 1-19 (2007).</li><li>Luo, R., Gao, J., Wehrle-Haller, B., Henion, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+identification+of+distinct+neurogenic+and+melanogenic+neural+crest+sublineages.">Molecular identification of distinct neurogenic and melanogenic neural crest sublineages.</a> Development. 130 (2), 321-330 (2003).</li><li>Betters, E., Liu, Y., Kjaeldgaard, A., Sundstrom, E., Garcia-Castro, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+early+human+neural+crest+development.">Analysis of early human neural crest development.</a> Developmental Biology. 344 (2), 578-592 (2010).</li><li>Yang, S. Y., Beavan, M., Chau, K. Y., Taanman, J. W., Schapira, A. H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+neural+crest+stem+cell-derived+dopaminergic+neuronal+model+recapitulates+biochemical+abnormalities+in+GBA1+mutation+carriers.">A human neural crest stem cell-derived dopaminergic neuronal model recapitulates biochemical abnormalities in GBA1 mutation carriers.</a> Stem Cell Reports. 8 (3), 728-742 (2017).</li><li>Ishii, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stable+cranial+neural+crest+cell+line+from+mouse.">A stable cranial neural crest cell line from mouse.</a> Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).</li><li>Yumoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta-activated+kinase+1+(Tak1)+mediates+agonist-induced+Smad+activation+and+linker+region+phosphorylation+in+embryonic+craniofacial+neural+crest-derived+cells.">TGF-beta-activated kinase 1 (Tak1) mediates agonist-induced Smad activation and linker region phosphorylation in embryonic craniofacial neural crest-derived cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (19), 13467-13480 (2013).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yap+and+Taz+play+a+crucial+role+in+neural+crest-derived+craniofacial+development.">Yap and Taz play a crucial role in neural crest-derived craniofacial development.</a> Development. 143 (3), 504-515 (2016).</li><li>Heallen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippo+pathway+inhibits+Wnt+signaling+to+restrain+cardiomyocyte+proliferation+and+heart+size.">Hippo pathway inhibits Wnt signaling to restrain cardiomyocyte proliferation and heart size.</a> Science. 332 (6028), 458-461 (2011).</li><li>Wang, J., Martin, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippo+pathway:+An+emerging+regulator+of+craniofacial+and+dental+development.">Hippo pathway: An emerging regulator of craniofacial and dental development.</a> Journal of Dental Research. 96 (11), 1229-1237 (2017).</li><li>Pan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hippo+signaling+pathway+in+development+and+cancer.">The hippo signaling pathway in development and cancer.</a> Developmental Cell. 19 (4), 491-505 (2010).</li><li>Xiao, Y., Leach, J., Wang, J., Martin, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippo/Yap+signaling+in+cardiac+development+and+regeneration.">Hippo/Yap signaling in cardiac development and regeneration.</a> Current Treatment Options in Cardiovascular Medicine. 18 (6), 38 (2016).</li><li>Yu, F. X., Meng, Z., Plouffe, S. W., Guan, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippo+pathway+regulation+of+gastrointestinal+tissues.">Hippo pathway regulation of gastrointestinal tissues.</a> Annual Review of Physiology. 77, 201-227 (2015).</li><li>Fu, V., Plouffe, S. W., Guan, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hippo+pathway+in+organ+development,+homeostasis,+and+regeneration.">The Hippo pathway in organ development, homeostasis, and regeneration.</a> Current Opinion in Cell Biology. 49, 99-107 (2017).</li><li>Moya, I. M., Halder, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hippo+pathway+in+cellular+reprogramming+and+regeneration+of+different+organs.">The Hippo pathway in cellular reprogramming and regeneration of different organs.</a> Current Opinion in Cell Biology. 43, 62-68 (2016).</li><li>Piccolo, S., Dupont, S., Cordenonsi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+YAP/TAZ:+hippo+signaling+and+beyond.">The biology of YAP/TAZ: hippo signaling and beyond.</a> Physiological Reviews. 94 (4), 1287-1312 (2014).</li><li>Bauer, D. E., Canver, M. C., Orkin, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+genomic+deletions+in+mammalian+cell+lines+via+CRISPR/Cas9.">Generation of genomic deletions in mammalian cell lines via CRISPR/Cas9.</a> Journal of Visual Experiments : JoVE. (95), e52118 (2015).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Manderfield, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippo+signaling+is+required+for+Notch-dependent+smooth+muscle+differentiation+of+neural+crest.">Hippo signaling is required for Notch-dependent smooth muscle differentiation of neural crest.</a> Development. 142 (17), 2962-2971 (2015).</li><li>Hindley, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hippo+pathway+member+YAP+enhances+human+neural+crest+cell+fate+and+migration.">The Hippo pathway member YAP enhances human neural crest cell fate and migration.</a> Scientific Reports. 6, 23208 (2016).</li><li>Nejigane, S., Haramoto, Y., Okuno, M., Takahashi, S., Asashima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptional+coactivators+Yap+and+TAZ+are+expressed+during+early+Xenopus+development.">The transcriptional coactivators Yap and TAZ are expressed during early Xenopus development.</a> International Journal of Developmental Biology. 55 (1), 121-126 (2011).</li><li>Grefte, S., Vullinghs, S., Kuijpers-Jagtman, A. M., Torensma, R., Von den Hoff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel,+but+not+collagen+I,+maintains+the+differentiation+capacity+of+muscle+derived+cells+in+vitro.">Matrigel, but not collagen I, maintains the differentiation capacity of muscle derived cells in vitro.</a> Biomedical Materials. 7 (5), 055004 (2012).</li><li>Kang, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+matrigel+on+the+osteogenic+potential+of+canine+adipose+tissue-derived+mesenchymal+stem+cells.">Effect of matrigel on the osteogenic potential of canine adipose tissue-derived mesenchymal stem cells.</a> Journal of Veterinary Medical Science. 74 (7), 827-836 (2012).</li><li>Uemura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel+supports+survival+and+neuronal+differentiation+of+grafted+embryonic+stem+cell-derived+neural+precursor+cells.">Matrigel supports survival and neuronal differentiation of grafted embryonic stem cell-derived neural precursor cells.</a> Journal of Neuroscience Research. 88 (3), 542-551 (2010).</li></ol>

NCC הוא תורם רב-תכליתי, מפתח ברקמות שונות ואיברים במהלך מורפוגנזה עובריים. שורת התאים O9-1 שומרת את הפוטנציאל להתמיין סוגי תאים שונים רבים ולאחר מחקה ויוו מאפייני NCCs, שהופך אותו כלי שימושי במבחנה ללמוד ג'ין פונקציה ורגולציה מולקולרית ב- NCCs. המצב שונה של O9-1 תאים עשויים להתאים הרכס העצ?...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/58346/culturing-and-manipulation-of-o9-1-neural-crest-cells">Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells</a>. The Protocol section was updated.
Step 2.1 was updated from:
Prepare basal media for O9-1 cell culture by adding the following in DMEM (final concentrations are indicated): 15% FBS, 0.1 mM minimum essential media (MEM) nonessential amino acids, 1 mM sodium pyruvate, 55 mM beta-mercaptoethanol, 100 U/mL penicillin, 100 U/mL streptomycin, 2 mM L-glutamine, 103 units/mL leukemia inhibitory factor (LIF; added immediately before use, do not add to stock bottle), and 25 ng/mL fibroblast growth factor-basic (bFGF; added immediately before use, do not add to stock bottle).
to:
Prepare basal media for O9-1 cell culture by adding the following in DMEM (final concentrations are indicated): 15% FBS, 0.1 mM minimum essential media (MEM) nonessential amino acids, 1 mM sodium pyruvate, 55 &#181;M beta-mercaptoethanol, 100 U/mL penicillin, 100 &#181;g/mL streptomycin, 2 mM L-glutamine, 103 units/mL leukemia inhibitory factor (LIF; added immediately before use, do not add to stock bottle), and 25 ng/mL fibroblast growth factor-basic (bFGF; added immediately before use, do not add to stock bottle).
Step 5.1.1 was updated from:
To prepare osteogenic differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 0.1 mM dexamethasone, 100 ng/mL bone morphogenetic protein 2 (BMP2), 50 &#181;g/mL ascorbic acid, 10 mM b-glycerophosphate, 10% FBS, 100 U/mL penicillin, and 100 mg/mL streptomycin.
to:
To prepare osteogenic differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 0.1 &#181;M dexamethasone, 100 ng/mL bone morphogenetic protein 2 (BMP2), 50 &#181;g/mL ascorbic acid, 10 mM b-glycerophosphate, 10% FBS, 100 U/mL penicillin, and 100 &#181;g/mL streptomycin.
Step 5.2.1 was updated from:
To prepare chondrocyte differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 5% fetal calf serum (FCS), 1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 10 ng/mL transforming growth factor beta (TGF-b3), 50 mg/mL ascorbic acid, 10 ng/mL BMP2, 0.1 mM dexamethasone, and 1 mM sodium pyruvate.
to:
To prepare chondrocyte differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 5% fetal calf serum (FCS), 1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 100 U/mL penicillin, 100 &#181;g/mL streptomycin, 10 ng/mL transforming growth factor beta (TGF-b3), 50 &#181;g/mL ascorbic acid, 10 ng/mL BMP2, 0.1 &#181;M dexamethasone, and 1 mM sodium pyruvate.
Step 5.4.1 was updated from:
To prepare glial cell differentiation media, dilute the following in DMEM/F12 (final concentrations are indicated): 1x B-27 supplement, 2 mM L-glutamine, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 50 ng/mL LIF, and 1% heat-inactivated FBS.
to:
To prepare glial cell differentiation media, dilute the following in DMEM/F12 (final concentrations are indicated): 1x B-27 supplement, 2 mM L-glutamine, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL penicillin, 100 &#181;g/mL streptomycin, 50 ng/mL LIF, and 1% heat-inactivated FBS.

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/58346/culturing-and-manipulation-of-o9-1-neural-crest-cells">Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells</a>. The Protocol section was updated.

Erratum: Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells

תאי הרכס העצבי (NCCs) הם תאי גזע דמוי multipotent עם יכולת מדהימה נודדות, קיום חולף במהלך התפתחות עובריים. NCCs מקורם בין האאקטודרם השטח של הצינור העצבי ולהעביר אל חלקים אחרים של העובר במהלך התפתחות1. בהתבסס על תחומים פונקציונליים שלהם, NCCs יכולים להיות מסווגים לתוך מספר סוגים שונים, כולל הגולגולת, תא המטען, vagal, עצם העצה, NCCs הלב. בנוסף, NCCs ניתן להתמיין שושלות תאים מרובים, כגון תאי שריר חלק, תאים עצם הנוירונים, להצמיח רקמות שונות2,3. הפיתוח של NCCs מאופיין על ידי סדרה מורכבת של אירועים morphogenetic, כי הם יסודי על ידי אותות מולקולריים שונים. לאור מורכבות ויסות NCCs ותרומתם מבנים רבים חשוב, dysregulation של פיתוח NCC יכול להוביל בדרך כלל מולדת למומים מולדים, באיזה חשבון כמעט 30% של כל אדם מולדות מומים מולדים. ליקויים במהלך פיתוח הרכס העצבי יכול להוביל שסוע שפתיים/החיך, פגם באף צורה, תסמונות, פגמים כגון מערכת יצוא לב פגומים או אפילו תמותת1,4,5, 6 , 7. הבנת המנגנונים המולקולריים של פיתוח NCC חשוב לפיתוח טיפולים עבור מחלות הנגרמות על ידי ליקויים בהתפתחות NCC. עם השימוש השונים במבחנה , ויוו מתקרב8,9,10,11,12,13,14 ,15, התקדמות ניכרת נעשתה במחקר NCC. In vivo, מודלים בבעלי חיים, כולל עופות, דו-חיים, דג זברה ועכברים, שימשו כדי לחקור NCCs1. יתר על כן, עוברי אדם שימשו כדי לחקור את תהליך ההעברה NCC במהלך התפתחות העובר מוקדם16. במבחנה, מודלים תא NCCs, כגון NCCs האנושי, כי מקורם החולה השומן התת עורית שימשו כדי לחקור את מחלת פרקינסון17. הקו NCC O9-1, אשר נגזר במקור מתרבויות המונית של NCCs אנדוגני מבודד E8.5 העכבר עוברי18, הוא מודל חזק תא ללמוד NCCs. חשוב, בתנאים תרבות שאינם מבדילים, תאים O9-1 NCCs גזע דמוי multipotent. עם זאת, בתנאים תרבות שונות, תאים O9-1 יכול להיות מובחן סוגי תאים מכובדים, כגון תאי שריר חלק, תאי העצם, chondrocytes וגלייה18. לאור מאפיינים אלה, תאים O9-1 שימשו בהרחבה ללימודים הקשורות NCC, כגון חקירת המנגנון המולקולרי של הפנים הגולגולתי פגמים19,20.
כאן, פרוטוקולים מפורט ניתנים לשמירה על תאי O9-1, המבדילים O9-1 תאים לתוך לסוגי תאים שונים של מניפולציה O9-1 תאים על-ידי ביצוע גנים לימודי אובדן-של-פונקציה עם עריכה הגנום CRISPR-Cas9 ו- RNA מפריעות קטן (siRNA)- מתווכת הטכנולוגיות תמונות ציפורים. בתור דוגמא מייצגת, מתואר השימוש O9-1 תאים כדי לחקור הפה , טאז אובדן-של-פונקציה. הפה טאז effectors במורד הזרם של ההיפופוטם איתות, אשר ממלא תפקיד קריטי התפשטות תאים, בידול ולאחר אפופטוזיס בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. מסלול היפו גם הוכח להיות חשוב פיתוח, הומאוסטזיס של מספר ברקמות שונות ואיברים, וכן בפתוגנזה של מחלות שונות20,21,22,23 ,24,25,26,27,28. מרכיבי הליבה של היפו איתות כוללים את הגידול משתיק קול סטרילית כמו 20 kinases Mst1/2, WW המכילות תחום סלבדור לגרדום חלבונים kinases homolog (Lats1/2) משתיק קול של גידול גדול. היפו איתות מעכב פעילות הפה, טאז ומקדם שפלותם בציטופלסמה. ללא דיכוי של היפופוטם, הפה, טאז יכול translocate לתוך גרעין האטום, לתפקד כמו תעתיק שיתוף activators. אנחנו לאחרונה הראה כי במיוחד inactivating ההיפופוטם איתות effectors הפה, טאז עכבר NCCs באמצעות Wnt1שלcre וכתוצאה Wnt1Cre2SOR נהגים עובריים lethality ב E10.5 עם חמור פגמים ואסטתיים20. אנחנו גם הופיעו מחקרים באמצעות תאים O9-1 כדי לחקור את התפקיד של הפה ו Taz ב- NCCs. כדי לחקור הפה, טאז פונקציה NCC התפשטות, בידול, הפה , טאז נוקאאוט תאים נוצר בתאים O9-1 על-ידי שימוש siRNA, הפה נוקאאוט תאים נוצרו באמצעות עריכת הגנום CRISPR-Cas9. האסטרטגיות אובדן-של-פונקציה באותו הגן ניתן ליישם יעד אחר גנים במשעולים אחרים. בנוסף, רווח-של-תפקוד לימודי, תרביות תאים מבחני ניתן להחיל גם לתאים O9-1 ללמוד ג'ין פונקציה ורגולציה. הפרוטוקולים המתוארים כאן נועדו לשמש על ידי חוקרים מדריכים culturing O9-1 תאים כדי לשמור על multipotent stemness, על הבחנה O9-1 תאים לתוך סוגי תאים אחרים בתנאים תרבות אחרת, ועל לימוד תפקוד הגן, המנגנון המולקולרי של NCCs.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Active STO feeder cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CRL-1503</td>
			<td>Also available in mitomycin C-inactivated form, catalog # ATCC 56-X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O9-1 mouse cranial neural crest cell line</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SCC049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, no glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11960-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (fetal bovine serum)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>ES-009-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin - streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine 200mM (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.25% in HBSS</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline) without calcium or magnesium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-512F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM non-essential amino acids (MEM NEAA) 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate (100mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-7522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ESGRO leukemia inhibitory factor (LIF) 106 unit/ml</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>ESG1106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human fibroblast growth factor-basic (rhFGF-basic)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>233-FB-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitomycin C</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10107409001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (dimethylsulfoxide)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MX1458-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13778-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum essential medium, alpha 1X with Earle&#39;s salts, ribonucleosides, deoxyribonucleosides, &#38; L-glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-022-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ON-TARGETplus Wwtr1 siRNA</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>L-041057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ON-TARGETplus Non-targeting Pool</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>D-001810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ON-TARGETplus Yap1 siRNA</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>L-046247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS (fetal calf serum)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS (insulin-transferrin-selenium )</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-b3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP2 (bone morphogenetic protein 2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing and manipulation of o9-1 neural crest cells

תאי הרכס העצבי (NCCs) מעביר multipotent תאי גזע יכולים להתמיין לסוגי תאים שונים, להצמיח מרובים רקמות ואיברים. שורת התאים O9-1 נגזרת אנדוגני העכבר NCCs עובריים ושומר על multipotency שלה. עם זאת, בתנאים תרבות מסוימת, O9-1 התאים יכולים להתמיין לסוגי תאים שונים, ניתן להשתמש במגוון רחב של יישומי מחקר. לאחרונה, עם השילוב של העכבר מחקרים ולימודים תא O9-1, אנחנו הראו כי ההיפופוטם איתות לשביל effectors הפה, טאז תפקיד חשוב בהתפתחות ואסטתיים נגזר הרכס העצבי. למרות תהליך culturing עבור תאים O9-1 הוא מסובך יותר בשימוש עבור שורות תאים אחרים, שורת התאים O9-1 הוא מודל חזק על חקירת NCCs חוץ גופית בתוך. כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור culturing הקו תא O9-1 כדי לשמור על stemness שלה, כמו גם פרוטוקולים עבור המבדילים O9-1 תאים לתוך לסוגי תאים שונים, כגון תאי שריר חלק, תאי העצם. בנוסף, פרוטוקולים מתוארים לביצוע מחקרים אובדן-של-פונקציה ג'ין בתאים O9-1 על-ידי שימוש CRISPR-Cas9 והמומנט קטן מפריעות נוקאאוט בתיווך RNA.

המטרה של הניסויים שלנו תמונות ציפורים, נוקאאוט היה לחקור את ההשפעות של הפה , טאז אובדן-של-פונקציה בתאים O9-1. לפני הניסויים תמונות ציפורים, הסתרה, אנחנו חייבים לוודא המכינות עבור מדיה הבזליים ותאים תרבות O9-1 כפי שתואר לעיל (לדוגמה, קרום המרתף לצרכים במטריקס כדי לכסו...

Watch this Scientific Journal Video about Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells at JoVE.com

Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells

O9-1 הוא קו תא multipotent העכבר הרכס העצבי. כאן נתאר מפורט שלב אחר שלב פרוטוקולים culturing O9-1 תאים, המבדילים O9-1 תאים תאים מסוים סוגים של מניפולציה גנטית O9-1 תאים על-ידי שימוש בתיווך siRNA נוקאאוט או עריכה של הגנום CRISPR-Cas9.

Culturing ומניפולציה של תאי הרכס העצבי O9-1

Neural crest cells (NCCs) are migrating multipotent stem cells that can differentiate into different cell types and give rise to multiple tissues and ...

קו התא O9-1 הוא כלי שימושי מאוד לחקר תאי סמל עצבי במבחנה. יש לו פוטנציאל גדול לשימוש במגוון רחב של יישומים בשימוש במגוון רחב של מחקר. לתאי O9-1 יש יתרונות ברורים, כגון גישה קלה, והשגת מספרי תאים מספקים לניסויים במהירות, מה שהופך אותו לשיטה רבת עוצמה המשלים למחקרים במבחנה של תאי סמל עצבי.כדי להתחיל, הכן מדיה בזלית עבור תרבות תא O9-1, על פי פרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, לסנן את המדיה הבסיסית, ולעטוף אותו בנייר כסף כדי להגן עליו מפני האור. לאחר מכן, אסוף מדיה בזלית מותנה מתאים STO פעילים בהתאם לפרוטוקול הטקסט.ראשית, להפשיר aliquot של מטריצת קרום מרתף על קרח במשך שעתיים. לאחר מכן, לדלל את מטריצת קרום המרתף עם DMEM מעוקר מסונן עם 10%FBS לריכוז סופי של 0.5mg/ml. מצפים את הצלחת עם מטריצת קרום המרתף בטמפרטורת החדר במשך שעה.לאחר מכן, שאף את מטריצת קרום המרתף תוך הטיית הצלחת. יבש את הצלחות ב 30 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. בעת הוספת מטריצת קרום המרתף לצלחת, ודא שהפתרון כיסה את הבאר באופן שווה כדי לשמור על מאפייני התא ולהימנע משינויים מיותרים בין הניסויים.לשחזר O9-1 תאים על ידי הצבת cryo-בקבוקון לתוך 37 מעלות צלזיוס מים אמבטיה. לאט מערבלים את הבקבוקון עד שהתסכול הופך לחלוטין לנוזל. לאחר מכן, להעביר את פתרון התא מן cryo-בקבוקון לצינור צנטריפוגה 15 מ"ל.הוסף חמישה אמצעי אחסון של DMEM עם 10%FBS לצינור כדי להשעות מחדש את התאים. צנטריפוגה התאים במשך שלוש דקות ב 180 Gs.Then, שאף את העל טבעי, דואג לא להפריע גלולה. לאחר מכן, להשעות מחדש את גלולה במדיה הבסיסית מותנה בתוספת LIF ו BFGF.זרע את התאים בצלחת שש באר, ולהסעיר את הצלחת כדי לזרוע את התאים באופן שווה. כאשר מתסיסים את הצלחת, לעשות זאת אופקית ואנכית, כמו מערבולת הצלחת יגרום לתאים להתרכז לכיוון המרכז. ולאפשר לתאים האלה לצרף ולגדול באינקובטור סטנדרטי לתרבות התאים בן לילה.ודא שהתאים מחוברים לפני שינוי המדיה. כאשר תאי O9-1 מגיעים ל-80%, הפשיר את מטריצת קרום המרתף והכן צלחת מצופה מטריצת קרום מרתף כמתואר קודם לכן. לאחר מכן הוסיפו מדיה בסיסית בתוספת LIF ו- BFGF למטריצת הממברנה.יש לשטוף בעדינות את בארות עם 2 מ"ל של DPBS פעמיים. לאחר מכן, נתק את התאים עם 1 מ"ל של 0.05% טריפסין EDTA ב 37 מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות. לנטרל את טריפסין עם כמות שווה של DMEM עם 10%FBS על ידי צינורות שוב ושוב את הנוזל על פני כל פני השטח של באר.לאחר מכן, להעביר את פתרון התא לצינור צנטריפוגה. וצנטריפוגה במשך שלוש דקות ב 180 Gs.Aspirate העל טבעי מבלי להפריע גלולה של תאים. לאחר מכן, לחץ מחדש על גלולת התא על-ידי פיפטציה עדינה של מדיה בזלית מותנה בתוספת LIF ו- BFGF.זרעים את התאים לצלחת מצופה כפי שתואר קודם לכן. לאחר מכן, לאפשר לתאים לצרף ולגדול באינקובטור תרבות תאים סטנדרטית. ראשית, הכן את המדיה המקפיאה פי 2 בהתאם לפרוטוקול הטקסט.לאחר מכן, סנן את המדיה. לשטוף את הקירות של הצלחת עם DPBS פעמיים, צינורות בעדינות, כדי למנוע אובדן תאים. לאחר מכן נתק את התאים עם 0.05% טריפסין EDTA ב 37 מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות.נטרל את טריפסין עם כמות שווה של 10%FBS ו- DMEM. מעבירים את תכולת הצלחת לצינור צנטריפוגה, וצנטריפוגה במשך שלוש דקות ב 180 Gs.Then, שאפו את העל-טבעי והוסיפו 2 מ"ל של PBS כדי למצות מחדש את גלולה. צנטריפוגה פתרון התא שוב ושואפים את העל טבעי.התאם את כמות המדיה הבסיסית בצינור לפי הצורך והוסף כמות שווה של מדיה להקפאה של פי 2. לאחר מכן, העבר את התאים לבקבוקוני ההקפאה המסומנות. מניחים את בקבוקוני ההקפאה בתוך קופסת פוליסטירן עם מכסה כדי להשיג קצב קירור איטי של 80 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות לפחות.כדי לבצע נפילה SIRNA בתאי O9-1, לשחזר ולזרע את התאים. לדלל ליפוזומים בנפח מתאים של מדיה ללא סרום. לאחר מכן, לדלל את SIRNA במדיה ללא סרום על פי פרוטוקול הטקסט.לאחר מכן, מוסיפים את SIRNA מדולל ליפוזומים מדולל, על פי הוראות היצרן. מערבבים את הפתרון על ידי צינורות, ודגירה במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, להוסיף נפח מתאים של תסביך השומנים SIRNA לתאים.לאחר מכן, להחרים את התאים במשך 24 שעות באינקובטור תרבות תאים סטנדרטי. תאי O9-1 יכולים להתבדל לסוגי תאים שונים בתנאי תרבות הבחנה ספציפיים. כדי להבדיל בין תאים O9-1 לתאים osteoplasts, להכין מדיה בידול אוסטאוגני על פי פרוטוקול הטקסט.לבסוף, לזהות את סמן osteoplast אוסטאוקלצין osteoplasts מובחן על ידי כתמים חיסוניים. כדי להבדיל בין תאי O9-1 לתאי שריר חלקים, תרבו אותם תחת מדיית הבחנה על פי פרוטוקול הטקסט, והעריכו את ההבחנה על ידי הכתמת אימונו של אקטין שריר חלק. בפרוטוקול זה, הן לדפוק ולהפיל ניסוי כדי לחקור את אובדן תפקוד Yap בתאי O9-1 בוצעו.תחת תנאי התדלדלות חלקה של תאי השריר, רוב תאי O9-1 מסוג הבר הוליד שריר חלק actin תאי שריר חלקים חיוביים. תאים ריקים Yap עם זאת בדרך כלל לא הצליחו להבדיל לתוך תאי שריר חלקים חיוביים SMA. זה מצביע על כך יאפ ממלא תפקיד קריטי בידול של תאי סמל עצבי לתוך תאי שריר חלקים.בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לטפל בקו התא O9-1 בעדינות ובזהירות במהלך התהליך כולו. הקפד לדלל ולהשתמש כראוי במטריצת הממברנה הבסיסית, ולהשתמש ב- 0.05%trypsin לניתוב תאים. אל תשכח כי במהלך ההכנה לתרבות התא O9-1, עבודה עם mitomycin c יכול להיות מסוכן מאוד, אמצעי זהירות כגון לבישת חלוק מעבדה וכפפות תמיד צריך להילקח בעת ביצוע הליך זה.

Research

JoVE Journal

Genetics

Flow-sorting and Exome Sequencing of the Reed-Sternberg Cells of Classical Hodgkin Lymphoma

זרימה מיון ו Exome רצף של תאים ריד סטרנברג של לימפומה קלאסית הודג&#39;קין

The Hodgkin Reed-Sternberg cells of classical Hodgkin lymphoma are sparsely distributed within a background of inflammatory lymphocytes and typically ...

The Visual Colorimetric Detection of Multi-nucleotide Polymorphisms on a Pneumatic Droplet Manipulation Platform

החזותי איתור מדד-צבע של פולימורפיזם רב-נוקלאוטיד על פלטפורמת מניפולציה אגל פניאומטיים

A simple and visual method to detect multi-nucleotide polymorphism (MNP) was performed on a pneumatic droplet manipulation platform on an open surface. ...

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

מניפולציה גנטית של פתוגן הצמח<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; ללמוד ביולוגיה פטרייתי אינטראקציות חיידק צמח

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

Immunostaining עבור שינויים DNA: ניתוח חישובית של תמונות קונפוקלי

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

העובר Microinjection, טכניקת ההשתלה מניפולציה הגנום Nasonia vitripennis

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

שיבוש גנטי יעילים ביותר מאתר ואנושי Hematopoietic ובתאים מאת CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

מניפולציה של פלואידיות ב Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

התאמת גנים של גזע Hematopoietic פרימוס Nonhuman, ובתאים והכנה

Hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) transplantation has been a cornerstone therapy for leukemia and other cancers for nearly half a century, ...

Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish

מניפולציה של פונקציית ג'ין Cavefish מקסיקני

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

In vivo היישום של מערכת שליטה מרחוק עבור הביטוי מניפולציה של ג'ין אנדוגני

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...