Name: culturing and manipulation of o9-1 neural crest cells
Uploaded: 2018-10-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells at JoVE.com

ニコール Stancel、博士号を取得、ELS、テキサス心臓研究所で科学的な出版物の編集サポートを提供しました。また次の資金源に感謝: アメリカの心臓協会のナショナル センターの科学者開発補助金 (j. 王に 14SDG19840000)、Rolanette、Berdon ローレンス ・骨疾患プログラムのテキサスから 2014 ローレンス研究賞 (j. 王に)、健康 (DE026561 ・ j ・ ワン、DE016320、r. Maxson に DE019650 に DE025873) の国立機関。

1. O9 1 細胞培養前に、の準備
注: O9 1 細胞培養で使用される基底のメディアする必要がありますエアコンされているによってサンドス近交系マウスの各/ウワバイン耐性 (STO) マウスの線維芽細胞の細胞;したがって、STO 細胞は, O9 1 細胞培養を開始する前に以下のように準備する必要があります。
<ol><li>
アクティブな STO 細胞培養
	<ol>
<li>7% ウシ胎児血清 (FBS) (?...

<ol>
	<li>Achilleos, A., Trainor, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+stem+cells:+discovery,+properties+and+potential+for+therapy.">Neural crest stem cells: discovery, properties and potential for therapy.</a> Cell Research. 22 (2), 288-304 (2012).</li><li>Le Douarin, N. M., Dupin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotentiality+of+the+neural+crest.">Multipotentiality of the neural crest.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 13 (5), 529-536 (2003).</li><li>Santagati, F., Rijli, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cranial+neural+crest+and+the+building+of+the+vertebrate+head.">Cranial neural crest and the building of the vertebrate head.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 4 (10), 806-818 (2003).</li><li>Cordero, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cranial+neural+crest+cells+on+the+move:+their+roles+in+craniofacial+development.">Cranial neural crest cells on the move: their roles in craniofacial development.</a> American Journal of Medical Genetics. Part A. 155 (2), 270-279 (2011).</li><li>Trainor, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Craniofacial+birth+defects:+The+role+of+neural+crest+cells+in+the+etiology+and+pathogenesis+of+Treacher+Collins+syndrome+and+the+potential+for+prevention.">Craniofacial birth defects: The role of neural crest cells in the etiology and pathogenesis of Treacher Collins syndrome and the potential for prevention.</a> American Journal of Medical Genetics. Part A. 152 (12), 2984-2994 (2010).</li><li>Bronner, M. E., Simoes-Costa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neural+crest+migrating+into+the+twenty-first+century.">The neural crest migrating into the twenty-first century.</a> Current Topics in Developmental Biology. , 115-134 (2016).</li><li>Zurkirchen, L., Sommer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quo+vadis:+tracing+the+fate+of+neural+crest+cells.">Quo vadis: tracing the fate of neural crest cells.</a> Current Opinion in Neurobiology. 47, 16-23 (2017).</li><li>Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+regulatory+network+orchestrates+neural+crest+formation.">A gene regulatory network orchestrates neural crest formation.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 9 (7), 557-568 (2008).</li><li>Knecht, A. K., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+the+neural+crest:+a+multigene+process.">Induction of the neural crest: a multigene process.</a> Nature Reviews. Genetics. 3 (6), 453-461 (2002).</li><li>Steventon, B., Carmona-Fontaine, C., Mayor, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+network+during+neural+crest+induction:+from+cell+specification+to+cell+survival.">Genetic network during neural crest induction: from cell specification to cell survival.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 16 (6), 647-654 (2005).</li><li>Raible, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+neural+crest:+achieving+specificity+in+regulatory+pathways.">Development of the neural crest: achieving specificity in regulatory pathways.</a> Current Opinion in Cell Biology. 18 (6), 698-703 (2006).</li><li>Dupin, E., Sommer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+progenitors+and+stem+cells:+from+early+development+to+adulthood.">Neural crest progenitors and stem cells: from early development to adulthood.</a> Developmental Biology. 366 (1), 83-95 (2012).</li><li>Henion, P. D., Weston, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timing+and+pattern+of+cell+fate+restrictions+in+the+neural+crest+lineage.">Timing and pattern of cell fate restrictions in the neural crest lineage.</a> Development. 124 (21), 4351-4359 (1997).</li><li>Harris, M. L., Erickson, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+specification+in+neural+crest+cell+pathfinding.">Lineage specification in neural crest cell pathfinding.</a> Developmental Dynamics. 236 (1), 1-19 (2007).</li><li>Luo, R., Gao, J., Wehrle-Haller, B., Henion, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+identification+of+distinct+neurogenic+and+melanogenic+neural+crest+sublineages.">Molecular identification of distinct neurogenic and melanogenic neural crest sublineages.</a> Development. 130 (2), 321-330 (2003).</li><li>Betters, E., Liu, Y., Kjaeldgaard, A., Sundstrom, E., Garcia-Castro, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+early+human+neural+crest+development.">Analysis of early human neural crest development.</a> Developmental Biology. 344 (2), 578-592 (2010).</li><li>Yang, S. Y., Beavan, M., Chau, K. Y., Taanman, J. W., Schapira, A. H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+neural+crest+stem+cell-derived+dopaminergic+neuronal+model+recapitulates+biochemical+abnormalities+in+GBA1+mutation+carriers.">A human neural crest stem cell-derived dopaminergic neuronal model recapitulates biochemical abnormalities in GBA1 mutation carriers.</a> Stem Cell Reports. 8 (3), 728-742 (2017).</li><li>Ishii, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stable+cranial+neural+crest+cell+line+from+mouse.">A stable cranial neural crest cell line from mouse.</a> Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).</li><li>Yumoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta-activated+kinase+1+(Tak1)+mediates+agonist-induced+Smad+activation+and+linker+region+phosphorylation+in+embryonic+craniofacial+neural+crest-derived+cells.">TGF-beta-activated kinase 1 (Tak1) mediates agonist-induced Smad activation and linker region phosphorylation in embryonic craniofacial neural crest-derived cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (19), 13467-13480 (2013).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yap+and+Taz+play+a+crucial+role+in+neural+crest-derived+craniofacial+development.">Yap and Taz play a crucial role in neural crest-derived craniofacial development.</a> Development. 143 (3), 504-515 (2016).</li><li>Heallen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippo+pathway+inhibits+Wnt+signaling+to+restrain+cardiomyocyte+proliferation+and+heart+size.">Hippo pathway inhibits Wnt signaling to restrain cardiomyocyte proliferation and heart size.</a> Science. 332 (6028), 458-461 (2011).</li><li>Wang, J., Martin, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippo+pathway:+An+emerging+regulator+of+craniofacial+and+dental+development.">Hippo pathway: An emerging regulator of craniofacial and dental development.</a> Journal of Dental Research. 96 (11), 1229-1237 (2017).</li><li>Pan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hippo+signaling+pathway+in+development+and+cancer.">The hippo signaling pathway in development and cancer.</a> Developmental Cell. 19 (4), 491-505 (2010).</li><li>Xiao, Y., Leach, J., Wang, J., Martin, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippo/Yap+signaling+in+cardiac+development+and+regeneration.">Hippo/Yap signaling in cardiac development and regeneration.</a> Current Treatment Options in Cardiovascular Medicine. 18 (6), 38 (2016).</li><li>Yu, F. X., Meng, Z., Plouffe, S. W., Guan, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippo+pathway+regulation+of+gastrointestinal+tissues.">Hippo pathway regulation of gastrointestinal tissues.</a> Annual Review of Physiology. 77, 201-227 (2015).</li><li>Fu, V., Plouffe, S. W., Guan, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hippo+pathway+in+organ+development,+homeostasis,+and+regeneration.">The Hippo pathway in organ development, homeostasis, and regeneration.</a> Current Opinion in Cell Biology. 49, 99-107 (2017).</li><li>Moya, I. M., Halder, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hippo+pathway+in+cellular+reprogramming+and+regeneration+of+different+organs.">The Hippo pathway in cellular reprogramming and regeneration of different organs.</a> Current Opinion in Cell Biology. 43, 62-68 (2016).</li><li>Piccolo, S., Dupont, S., Cordenonsi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+YAP/TAZ:+hippo+signaling+and+beyond.">The biology of YAP/TAZ: hippo signaling and beyond.</a> Physiological Reviews. 94 (4), 1287-1312 (2014).</li><li>Bauer, D. E., Canver, M. C., Orkin, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+genomic+deletions+in+mammalian+cell+lines+via+CRISPR/Cas9.">Generation of genomic deletions in mammalian cell lines via CRISPR/Cas9.</a> Journal of Visual Experiments : JoVE. (95), e52118 (2015).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Manderfield, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippo+signaling+is+required+for+Notch-dependent+smooth+muscle+differentiation+of+neural+crest.">Hippo signaling is required for Notch-dependent smooth muscle differentiation of neural crest.</a> Development. 142 (17), 2962-2971 (2015).</li><li>Hindley, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hippo+pathway+member+YAP+enhances+human+neural+crest+cell+fate+and+migration.">The Hippo pathway member YAP enhances human neural crest cell fate and migration.</a> Scientific Reports. 6, 23208 (2016).</li><li>Nejigane, S., Haramoto, Y., Okuno, M., Takahashi, S., Asashima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptional+coactivators+Yap+and+TAZ+are+expressed+during+early+Xenopus+development.">The transcriptional coactivators Yap and TAZ are expressed during early Xenopus development.</a> International Journal of Developmental Biology. 55 (1), 121-126 (2011).</li><li>Grefte, S., Vullinghs, S., Kuijpers-Jagtman, A. M., Torensma, R., Von den Hoff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel,+but+not+collagen+I,+maintains+the+differentiation+capacity+of+muscle+derived+cells+in+vitro.">Matrigel, but not collagen I, maintains the differentiation capacity of muscle derived cells in vitro.</a> Biomedical Materials. 7 (5), 055004 (2012).</li><li>Kang, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+matrigel+on+the+osteogenic+potential+of+canine+adipose+tissue-derived+mesenchymal+stem+cells.">Effect of matrigel on the osteogenic potential of canine adipose tissue-derived mesenchymal stem cells.</a> Journal of Veterinary Medical Science. 74 (7), 827-836 (2012).</li><li>Uemura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel+supports+survival+and+neuronal+differentiation+of+grafted+embryonic+stem+cell-derived+neural+precursor+cells.">Matrigel supports survival and neuronal differentiation of grafted embryonic stem cell-derived neural precursor cells.</a> Journal of Neuroscience Research. 88 (3), 542-551 (2010).</li></ol>

NCC は、さまざまな組織や臓器に汎用性と主要コントリビューターを胚形態形成中です。O9 の-1 セルの行は、その潜在的な多くの異なったセルタイプに区別するためを維持し、Ncc、遺伝子機能とながん分子制御を勉強するため生体外で役に立つツールの生体内特性を模倣します。O9 の-1 セルの別の状態は、異なる神経堤の子孫体内O9 1 細胞の培養条件によって対応がありま?...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/58346/culturing-and-manipulation-of-o9-1-neural-crest-cells">Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells</a>. The Protocol section was updated.
Step 2.1 was updated from:
Prepare basal media for O9-1 cell culture by adding the following in DMEM (final concentrations are indicated): 15% FBS, 0.1 mM minimum essential media (MEM) nonessential amino acids, 1 mM sodium pyruvate, 55 mM beta-mercaptoethanol, 100 U/mL penicillin, 100 U/mL streptomycin, 2 mM L-glutamine, 103 units/mL leukemia inhibitory factor (LIF; added immediately before use, do not add to stock bottle), and 25 ng/mL fibroblast growth factor-basic (bFGF; added immediately before use, do not add to stock bottle).
to:
Prepare basal media for O9-1 cell culture by adding the following in DMEM (final concentrations are indicated): 15% FBS, 0.1 mM minimum essential media (MEM) nonessential amino acids, 1 mM sodium pyruvate, 55 &#181;M beta-mercaptoethanol, 100 U/mL penicillin, 100 &#181;g/mL streptomycin, 2 mM L-glutamine, 103 units/mL leukemia inhibitory factor (LIF; added immediately before use, do not add to stock bottle), and 25 ng/mL fibroblast growth factor-basic (bFGF; added immediately before use, do not add to stock bottle).
Step 5.1.1 was updated from:
To prepare osteogenic differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 0.1 mM dexamethasone, 100 ng/mL bone morphogenetic protein 2 (BMP2), 50 &#181;g/mL ascorbic acid, 10 mM b-glycerophosphate, 10% FBS, 100 U/mL penicillin, and 100 mg/mL streptomycin.
to:
To prepare osteogenic differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 0.1 &#181;M dexamethasone, 100 ng/mL bone morphogenetic protein 2 (BMP2), 50 &#181;g/mL ascorbic acid, 10 mM b-glycerophosphate, 10% FBS, 100 U/mL penicillin, and 100 &#181;g/mL streptomycin.
Step 5.2.1 was updated from:
To prepare chondrocyte differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 5% fetal calf serum (FCS), 1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 10 ng/mL transforming growth factor beta (TGF-b3), 50 mg/mL ascorbic acid, 10 ng/mL BMP2, 0.1 mM dexamethasone, and 1 mM sodium pyruvate.
to:
To prepare chondrocyte differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 5% fetal calf serum (FCS), 1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 100 U/mL penicillin, 100 &#181;g/mL streptomycin, 10 ng/mL transforming growth factor beta (TGF-b3), 50 &#181;g/mL ascorbic acid, 10 ng/mL BMP2, 0.1 &#181;M dexamethasone, and 1 mM sodium pyruvate.
Step 5.4.1 was updated from:
To prepare glial cell differentiation media, dilute the following in DMEM/F12 (final concentrations are indicated): 1x B-27 supplement, 2 mM L-glutamine, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 50 ng/mL LIF, and 1% heat-inactivated FBS.
to:
To prepare glial cell differentiation media, dilute the following in DMEM/F12 (final concentrations are indicated): 1x B-27 supplement, 2 mM L-glutamine, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL penicillin, 100 &#181;g/mL streptomycin, 50 ng/mL LIF, and 1% heat-inactivated FBS.

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/58346/culturing-and-manipulation-of-o9-1-neural-crest-cells">Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells</a>. The Protocol section was updated.

Erratum: Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells

神経堤細胞 (Ncc) は、渡り鳥の驚くべき能力の萌芽期の開発の間に一時的な存在と多能性幹細胞です。Ncc は、表面の外胚葉と神経管の間発信や1萌芽期の開発の間に胚の他の部分への移行します。その機能領域に基づいて、いくつかの頭蓋を含む、さまざまな種類、トランク、迷走神経、仙骨の, と心臓 Ncc に Ncc を分類できます。さらに、Ncc は平滑筋細胞、骨細胞、神経細胞などの複数の細胞系統に分化し、様々 な組織2,3を生じさせるできます。Ncc の開発は、複雑な一連のさまざまな分子シグナルによって、微調整されてます形成イベントが特徴です。Ncc の複雑な規制と多数の構造への重要な貢献を与え、NCC 開発の破綻一般的に先天異常、すべてひと先天性先天性欠損症の約 30% を占めているにつながることができます。神経堤の開発中に異常口唇口蓋、欠陥につながることができます鼻形成、症候群、欠陥欠陥心臓流出路なども乳児死亡率1,4,5,6,7. NCC 開発の分子機構の解明は NCC 開発中の欠陥に起因する疾患の治療法開発のために重要です。様々 な生体外でそして生体内の使用に近づく8,9,10、11,12,13,14 ,15、かなり進展した NCC 研究。生体内で鶏、両生類、ゼブラフィッシュ、マウスなどの動物モデルは、Ncc1を調査する使用されています。さらに、早い人間の胚の開発16に NCC 移行の過程を研究する人間の胚が使用されています。生体外でセルのモデルながん患者の皮下脂肪に由来する人間の Ncc などパーキンソン病17を調査に使用されています。E8.5 マウス胚18から分離した内因性の Ncc の大衆文化から派生した当初、O9 1 NCC の行は勉強してながん。 重要なは、非分化培養条件下での強力な細胞モデル、O9 1 セル多能性幹のようながん。しかし、種類の識別細胞、平滑筋細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、グリア細胞18などに、さまざまな文化状況で O9 1 セルを区別できます。これらのプロパティを指定すると、セル O9 1 使用されている広く頭蓋顔面欠損19,20の分子メカニズム解明などの NCC 関連の研究。
O9 の-1 細胞を維持し、異なったセルタイプに O9 1 細胞を分化、CRISPR Cas9 ゲノム編集と小さい干渉の RNA (siRNA) 遺伝子の機能喪失の研究を実行することによって O9 1 セルを操作するため詳細なプロトコルを提供するここでは、-ノックダウン技術を媒介します。代表的な例としてヤップおよびTazの機能喪失を研究する O9 1 セルの使用が説明されます。ヤップと Taz は、シグナル伝達経路は、細胞の増殖・分化・ アポトーシスの重要な役割を果たしているカバの下流のエフェクターです。カバの経路は、開発といくつかの異なる組織や臓器の恒常性だけでなくさまざまな病気20,21,22,23 の病因に重要であることも示されています。 ,24,25,26,,2728。カバがシグナル伝達のコア コンポーネントには、腫瘍サプレッサー滅菌 20 のようなキナーゼ Mst1/2、WW ドメイン含有サルバドール足場タンパク質、大きい腫瘍のサプレッサーの相同物 (Lats1/2) キナーゼが含まれます。カバ シグナリング ヤップおよび Taz の活性を阻害して、細胞質の劣化を促進します。カバから抑圧せずヤップおよび Taz が核に若しし、転写共活性化因子として機能します。最近示した具体的Wnt1creを使用してヤップおよび Taz のエフェクタ マウス Ncc をシグナリング カバを不活化して重度の E10.5 で胚致死の結果Wnt1Cre2SORドライバー顎顔面欠損20。ヤップと Ncc の Taz の役割を調べるため O9 1 細胞を用いた研究も行ってきました。NCC の増殖と分化、ヤップ・タズノックダウン ヤップおよび Taz 関数を勉強するセル O9 1 細胞で siRNA を使用して生成された、ヤップノックアウト細胞だった CRISPR Cas9 ゲノム編集を使用して生成されます。その他の経路の異なるターゲット遺伝子遺伝子の機能喪失と同じ戦略を適用できます。さらに、ゲインの機能研究とトランスフェクション アッセイも適用できます O9 1 細胞遺伝子の機能と制御の研究をします。ここで説明されているプロトコルは、O9 の-多能性幹細胞性を維持するために細胞を培養するため、異なる培養条件下での他の種類の細胞に分化 O9 1 細胞および遺伝子の機能を研究するために研究者によってガイドとして使用してNcc の分子機構。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Active STO feeder cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CRL-1503</td>
			<td>Also available in mitomycin C-inactivated form, catalog # ATCC 56-X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O9-1 mouse cranial neural crest cell line</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SCC049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, no glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11960-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (fetal bovine serum)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>ES-009-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin - streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine 200mM (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.25% in HBSS</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline) without calcium or magnesium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-512F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM non-essential amino acids (MEM NEAA) 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate (100mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-7522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ESGRO leukemia inhibitory factor (LIF) 106 unit/ml</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>ESG1106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human fibroblast growth factor-basic (rhFGF-basic)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>233-FB-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitomycin C</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10107409001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (dimethylsulfoxide)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MX1458-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13778-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum essential medium, alpha 1X with Earle&#39;s salts, ribonucleosides, deoxyribonucleosides, &#38; L-glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-022-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ON-TARGETplus Wwtr1 siRNA</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>L-041057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ON-TARGETplus Non-targeting Pool</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>D-001810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ON-TARGETplus Yap1 siRNA</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>L-046247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS (fetal calf serum)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS (insulin-transferrin-selenium )</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-b3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP2 (bone morphogenetic protein 2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing and manipulation of o9-1 neural crest cells

神経堤細胞 (Ncc) は異なったセルタイプに区別でき、複数の組織や臓器に上昇を与える多能性幹細胞に移行しています。O9 の-1 セルの行は、内因性から派生したマウスの胚の Ncc とその率を維持します。ただし、特定のカルチャ条件下で O9 1 細胞は異なる種類の細胞に分化することができます、研究用途の広い範囲で利用します。最近では、マウスでの研究と O9 1 細胞研究の組み合わせであることを示したシグナリング経路エフェクタ ヤップおよび Taz 顎顔面神経堤由来で重要な役割を果たすカバ。O9 の-細胞培養プロセスは他の細胞よりも複雑ですが、O9 1 細胞ラインは Ncc体外を調査するため強力なモデルです。ここでは、異なる種類の細胞、平滑筋細胞、骨芽細胞などに分化 O9 1 細胞のプロトコルと同様に、その、幹細胞性を維持するために O9 1 細胞株を培養するためのプロトコルを提案する.また、CRISPR Cas9 削除と小さい干渉の RNA を介したノックダウンによる O9 1 細胞の遺伝子の機能喪失の研究を実行するためのプロトコルを説明します。

ノックダウンとノックアウト実験の目的は、ヤップおよびTazの機能喪失 O9 1 細胞の効果を研究することだった。ノックダウンとノックアウト実験前に我々 確かめなければならない基底メディアと文化 O9 の-1 セル (例では、図 1、および回復 O9 1 細胞のように、全体の板をカバーする基底膜マトリックス ニーズのため上記のように準...

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Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells

O9 1 は多能性マウス神経堤細胞株です。ここで O9 1 細胞を培養、特定の細胞型へ O9 1 細胞と分化および遺伝子 siRNA によるノックダウンや CRISPR Cas9 ゲノム編集による O9 1 セルを操作するための詳細なステップバイ ステップ プロトコルについて述べる。

養殖と O9 1 神経堤細胞の操作

Neural crest cells (NCCs) are migrating multipotent stem cells that can differentiate into different cell types and give rise to multiple tissues and ...

O9-1細胞株は、インビトロで神経堤細胞を研究するための非常に有用なツールです。それは研究の様々な使用の応用の広い範囲で使用するための大きな可能性を秘めている。O9-1細胞は、簡単にアクセスできるなどの明らかな利点を持ち、実験に十分な数の細胞を迅速に取得し、神経堤細胞のインビトロ研究に優れた強力な方法となっています。まず、テキストプロトコルに従ってO9-1細胞培養用の基底培地を準備します。次に、基底培地を濾過し、それをホイルで包んで光から保護します。この後、テキストプロトコルに従って、活性化されたSTOセルから条件付き基礎培地を収集します。まず、氷上の基質膜マトリックスのアリコートを2時間解凍する。その後、10%FBSで濾過されたDMEMで基膜マトリックスを希釈し、0.5mg/mlの最終濃度にします。プレートに基膜マトリックスを室温で1時間コーティングします。次いで、プレートを傾けながら基部膜マトリックスを吸引する。30°Cで30分間乾かします。プレートに基膜マトリックスを追加する場合は、細胞特性を維持し、実験の間に不必要な変動を避けるために、溶液が均一にウェルを覆っていることを確認してください。37°Cの水浴にクライオバイアルを置くことによってO9-1細胞を回復する。溶液が完全に液体に変わるまで、バイアルをゆっくりと旋回します。この後、細胞溶液をクライオバイアルから15ml遠心管に移します。10%FBS の DMEM を 5 巻追加して、セルを再中断します。180 Gsで3分間細胞を遠心分離し、次にスーパーナテントを吸引し、ペレットを乱さないよう注意する。次に、LIFおよびBFGFを補充した条件付き基底培地中のペレットを再懸濁する。6つのウェルプレートに細胞を播種し、プレートを攪拌して細胞を均等に播種します。プレートを攪拌するとき、プレートを渦巻くと細胞が中心に向かって集中するので、水平および垂直にそうしてください。そして、これらの細胞が一晩標準的な細胞培養インキュベーターに付着し、成長することを可能にする。メディアを変更する前に、セルが接続されていることを確認してください。O9-1細胞が80%合流に達すると、基質膜マトリックスを解凍し、先に述べたように基部膜マトリックス被覆板を調製する。次に、膜マトリックスにLIFとBFGFを添加した基底培地を添加します。2mlのDPBSでウェルを2回やさしくすすります。その後、セルを摂氏37度で0.05%トリプシンEDTAの1mlで3分間解化する。ウェルの表面全体に液体を繰り返しピペット化して、同量のDMEMを10%FBSで中和します。次いで、細胞溶液を遠心分離管に移す。そして、180 Gs.Aspirateで3分間遠心分離機細胞のペレットを乱すことなくスーパーナテントを吸引する。次に、LIFおよびBFGFを補ったコンディション基底培地を穏やかにピペットすることにより細胞ペレットを再懸濁する。前述のように、コーティングされたプレートに細胞を播種します。次いで、細胞を標準的な細胞培養インキュベーターに結合および増殖させる。まず、テキストプロトコルに従って2倍の凍結媒体を準備する。その後、培地を濾過滅させる。プレートの壁をDPBSで2回リンスし、細胞を失わないように穏やかにピペットします。次に、37°Cで0.05%トリプシンEDTAで細胞を3分間解離します。10%FBSとDMEMの同じ量でトリプシンを中和します。プレートの内容物を遠心分離管に移し、遠心分離機を180Gsで3分間移動し、次にスーパーナテントを吸引し、PBS2mlを加え、ペレットを再懸濁させる。細胞溶液をもう一度遠心分離し、スーパーナテントを吸引する。必要に応じてチューブ内の基底メディアの量を調整し、同量の2倍の凍結媒体を追加します。次に、ラベル付きクライオバイアルにセルを移します。蓋付きのポリスチレンボックスの中にクライオバイアルを入れて、少なくとも24時間摂氏80度でゆっくりと冷却します。O9-1細胞でSIRNAノックダウンを実行するには、細胞を回収して播種します。適量の無血清培地でリポソームを希釈する。次に、テキストプロトコルに従って無血清培地中のSIRNAを希釈する。この後、メーカーの指示に従って、希釈したリポソームに希釈したSIRNAを追加します。溶液をピペットで混ぜ、室温で5分間インキュベートする。次に、細胞に適切な量のSIRNA脂質複合体を加える。次に、標準的な細胞培養インキュベーターで24時間培養する。O9-1細胞は、特定の分化培養条件下で異なる細胞タイプに分化することができる。O9-1細胞を破骨形成細胞に分化するために、テキストプロトコルに従って骨形成分化培地を調製する。最後に、免疫染色により、分化した破骨形成細胞の破骨形成マーカーを検出する。O9-1細胞を平滑筋細胞に分化するために、テキストプロトコルに従って分化培地下で培養し、平滑筋アクチン免疫染色による分化を評価した。このプロトコルでは、O9-1細胞におけるヤップ機能喪失を研究するためのノックアウトとノックダウン実験の両方が行われた。平滑筋細胞分化条件下で, ほとんどの野生型 O9-1 細胞は平滑筋アクチン正平滑筋細胞を生み出しました。.しかし、Yapヌル細胞は一般的にSMA陽性平滑筋細胞に分化できなかった。これは、Yapが平滑筋細胞への神経堤細胞の分化において重要な役割を果たしていることを示す。この手順を試みる際には、O9-1 細胞ラインを慎重に処理する必要があります。細胞解離には、基底膜マトリックスを適切に希釈して使用し、0.05%トリプシンを使用してください。O9-1細胞培養の準備中に、マイトマイシンcを使用することは非常に危険であり、ラボコートや手袋を着用するなどの予防措置は、常にこの手順を実行する際に取られるべきであることを忘れないでください。

Research

JoVE Journal

Genetics

Flow-sorting and Exome Sequencing of the Reed-Sternberg Cells of Classical Hodgkin Lymphoma

古典的なホジキンリンパ腫のリードステルベルグ細胞のフローソーティングとExome配列決定

The Hodgkin Reed-Sternberg cells of classical Hodgkin lymphoma are sparsely distributed within a background of inflammatory lymphocytes and typically ...

遺伝学

The Visual Colorimetric Detection of Multi-nucleotide Polymorphisms on a Pneumatic Droplet Manipulation Platform

空気圧液滴操作プラットフォームのマルチ塩基多型の視覚比色検出

A simple and visual method to detect multi-nucleotide polymorphism (MNP) was performed on a pneumatic droplet manipulation platform on an open surface. ...

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植物病原体の遺伝子操作<em&gt;ウスチラゴmaydis</em&gt;真菌生物と植物微生物相互作用を研究します

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Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

DNA 変更染色: 共焦点画像の数値解析

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

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胚のインジェクションと移植キョウソヤドリコバチゲノム操作手法

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

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Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

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カエノラブディティス ・ エレガンスにおける倍数性の操作

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

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Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish

メキシコの血脈遺伝子機能の操作

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In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

体内の内因性遺伝子操作のリモート制御システムのアプリケーション

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...