Name: culturing and manipulation of o9-1 neural crest cells
Uploaded: 2018-10-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells at JoVE.com

Nicole Stancel, Ph.D., ELS, vitenskapelige publikasjoner ved Texas Heart Institute, gitt redaksjonelle støtte. Vi takker også følgende finansiering kilder: American Heart Association's National Center forsker Development Grant (14SDG19840000 å J. Wang), 2014 Lawrence forskning prisen fra Rolanette og Berdon Lawrence bein sykdom Program of Texas (til J. Wang ), og de nasjonale instituttene for helse (DE026561 og DE025873 å J. Wang, DE016320 og DE019650 til R. Archers).

1. forberedelser før O9-1 cellekultur
Merk: Basal medier som brukes til O9-1 cellekultur må har vært betinget av Sandos innavlede mus thioguanine/ouabain-resistente (STO) musen fibroblast celler. STO celler må derfor være innhentet og forberedt som beskrevet nedenfor før du starter O9-1 cellekultur.
<ol><li>
Aktive STO cellekultur
	<ol>
<li>Forberede medier for dyrking aktive STO celler ved å gjøre hele Dulbecco endret Eagle's media (DMEM) med 7% fosterets bovin seru...

<ol>
	<li>Achilleos, A., Trainor, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+stem+cells:+discovery,+properties+and+potential+for+therapy.">Neural crest stem cells: discovery, properties and potential for therapy.</a> Cell Research. 22 (2), 288-304 (2012).</li><li>Le Douarin, N. M., Dupin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotentiality+of+the+neural+crest.">Multipotentiality of the neural crest.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 13 (5), 529-536 (2003).</li><li>Santagati, F., Rijli, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cranial+neural+crest+and+the+building+of+the+vertebrate+head.">Cranial neural crest and the building of the vertebrate head.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 4 (10), 806-818 (2003).</li><li>Cordero, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cranial+neural+crest+cells+on+the+move:+their+roles+in+craniofacial+development.">Cranial neural crest cells on the move: their roles in craniofacial development.</a> American Journal of Medical Genetics. Part A. 155 (2), 270-279 (2011).</li><li>Trainor, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Craniofacial+birth+defects:+The+role+of+neural+crest+cells+in+the+etiology+and+pathogenesis+of+Treacher+Collins+syndrome+and+the+potential+for+prevention.">Craniofacial birth defects: The role of neural crest cells in the etiology and pathogenesis of Treacher Collins syndrome and the potential for prevention.</a> American Journal of Medical Genetics. Part A. 152 (12), 2984-2994 (2010).</li><li>Bronner, M. E., Simoes-Costa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neural+crest+migrating+into+the+twenty-first+century.">The neural crest migrating into the twenty-first century.</a> Current Topics in Developmental Biology. , 115-134 (2016).</li><li>Zurkirchen, L., Sommer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quo+vadis:+tracing+the+fate+of+neural+crest+cells.">Quo vadis: tracing the fate of neural crest cells.</a> Current Opinion in Neurobiology. 47, 16-23 (2017).</li><li>Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+regulatory+network+orchestrates+neural+crest+formation.">A gene regulatory network orchestrates neural crest formation.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 9 (7), 557-568 (2008).</li><li>Knecht, A. K., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+the+neural+crest:+a+multigene+process.">Induction of the neural crest: a multigene process.</a> Nature Reviews. Genetics. 3 (6), 453-461 (2002).</li><li>Steventon, B., Carmona-Fontaine, C., Mayor, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+network+during+neural+crest+induction:+from+cell+specification+to+cell+survival.">Genetic network during neural crest induction: from cell specification to cell survival.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 16 (6), 647-654 (2005).</li><li>Raible, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+neural+crest:+achieving+specificity+in+regulatory+pathways.">Development of the neural crest: achieving specificity in regulatory pathways.</a> Current Opinion in Cell Biology. 18 (6), 698-703 (2006).</li><li>Dupin, E., Sommer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+progenitors+and+stem+cells:+from+early+development+to+adulthood.">Neural crest progenitors and stem cells: from early development to adulthood.</a> Developmental Biology. 366 (1), 83-95 (2012).</li><li>Henion, P. D., Weston, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timing+and+pattern+of+cell+fate+restrictions+in+the+neural+crest+lineage.">Timing and pattern of cell fate restrictions in the neural crest lineage.</a> Development. 124 (21), 4351-4359 (1997).</li><li>Harris, M. L., Erickson, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+specification+in+neural+crest+cell+pathfinding.">Lineage specification in neural crest cell pathfinding.</a> Developmental Dynamics. 236 (1), 1-19 (2007).</li><li>Luo, R., Gao, J., Wehrle-Haller, B., Henion, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+identification+of+distinct+neurogenic+and+melanogenic+neural+crest+sublineages.">Molecular identification of distinct neurogenic and melanogenic neural crest sublineages.</a> Development. 130 (2), 321-330 (2003).</li><li>Betters, E., Liu, Y., Kjaeldgaard, A., Sundstrom, E., Garcia-Castro, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+early+human+neural+crest+development.">Analysis of early human neural crest development.</a> Developmental Biology. 344 (2), 578-592 (2010).</li><li>Yang, S. Y., Beavan, M., Chau, K. Y., Taanman, J. W., Schapira, A. H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+neural+crest+stem+cell-derived+dopaminergic+neuronal+model+recapitulates+biochemical+abnormalities+in+GBA1+mutation+carriers.">A human neural crest stem cell-derived dopaminergic neuronal model recapitulates biochemical abnormalities in GBA1 mutation carriers.</a> Stem Cell Reports. 8 (3), 728-742 (2017).</li><li>Ishii, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stable+cranial+neural+crest+cell+line+from+mouse.">A stable cranial neural crest cell line from mouse.</a> Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).</li><li>Yumoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta-activated+kinase+1+(Tak1)+mediates+agonist-induced+Smad+activation+and+linker+region+phosphorylation+in+embryonic+craniofacial+neural+crest-derived+cells.">TGF-beta-activated kinase 1 (Tak1) mediates agonist-induced Smad activation and linker region phosphorylation in embryonic craniofacial neural crest-derived cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (19), 13467-13480 (2013).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yap+and+Taz+play+a+crucial+role+in+neural+crest-derived+craniofacial+development.">Yap and Taz play a crucial role in neural crest-derived craniofacial development.</a> Development. 143 (3), 504-515 (2016).</li><li>Heallen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippo+pathway+inhibits+Wnt+signaling+to+restrain+cardiomyocyte+proliferation+and+heart+size.">Hippo pathway inhibits Wnt signaling to restrain cardiomyocyte proliferation and heart size.</a> Science. 332 (6028), 458-461 (2011).</li><li>Wang, J., Martin, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippo+pathway:+An+emerging+regulator+of+craniofacial+and+dental+development.">Hippo pathway: An emerging regulator of craniofacial and dental development.</a> Journal of Dental Research. 96 (11), 1229-1237 (2017).</li><li>Pan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hippo+signaling+pathway+in+development+and+cancer.">The hippo signaling pathway in development and cancer.</a> Developmental Cell. 19 (4), 491-505 (2010).</li><li>Xiao, Y., Leach, J., Wang, J., Martin, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippo/Yap+signaling+in+cardiac+development+and+regeneration.">Hippo/Yap signaling in cardiac development and regeneration.</a> Current Treatment Options in Cardiovascular Medicine. 18 (6), 38 (2016).</li><li>Yu, F. X., Meng, Z., Plouffe, S. W., Guan, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippo+pathway+regulation+of+gastrointestinal+tissues.">Hippo pathway regulation of gastrointestinal tissues.</a> Annual Review of Physiology. 77, 201-227 (2015).</li><li>Fu, V., Plouffe, S. W., Guan, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hippo+pathway+in+organ+development,+homeostasis,+and+regeneration.">The Hippo pathway in organ development, homeostasis, and regeneration.</a> Current Opinion in Cell Biology. 49, 99-107 (2017).</li><li>Moya, I. M., Halder, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hippo+pathway+in+cellular+reprogramming+and+regeneration+of+different+organs.">The Hippo pathway in cellular reprogramming and regeneration of different organs.</a> Current Opinion in Cell Biology. 43, 62-68 (2016).</li><li>Piccolo, S., Dupont, S., Cordenonsi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+YAP/TAZ:+hippo+signaling+and+beyond.">The biology of YAP/TAZ: hippo signaling and beyond.</a> Physiological Reviews. 94 (4), 1287-1312 (2014).</li><li>Bauer, D. E., Canver, M. C., Orkin, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+genomic+deletions+in+mammalian+cell+lines+via+CRISPR/Cas9.">Generation of genomic deletions in mammalian cell lines via CRISPR/Cas9.</a> Journal of Visual Experiments : JoVE. (95), e52118 (2015).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Manderfield, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippo+signaling+is+required+for+Notch-dependent+smooth+muscle+differentiation+of+neural+crest.">Hippo signaling is required for Notch-dependent smooth muscle differentiation of neural crest.</a> Development. 142 (17), 2962-2971 (2015).</li><li>Hindley, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hippo+pathway+member+YAP+enhances+human+neural+crest+cell+fate+and+migration.">The Hippo pathway member YAP enhances human neural crest cell fate and migration.</a> Scientific Reports. 6, 23208 (2016).</li><li>Nejigane, S., Haramoto, Y., Okuno, M., Takahashi, S., Asashima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptional+coactivators+Yap+and+TAZ+are+expressed+during+early+Xenopus+development.">The transcriptional coactivators Yap and TAZ are expressed during early Xenopus development.</a> International Journal of Developmental Biology. 55 (1), 121-126 (2011).</li><li>Grefte, S., Vullinghs, S., Kuijpers-Jagtman, A. M., Torensma, R., Von den Hoff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel,+but+not+collagen+I,+maintains+the+differentiation+capacity+of+muscle+derived+cells+in+vitro.">Matrigel, but not collagen I, maintains the differentiation capacity of muscle derived cells in vitro.</a> Biomedical Materials. 7 (5), 055004 (2012).</li><li>Kang, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+matrigel+on+the+osteogenic+potential+of+canine+adipose+tissue-derived+mesenchymal+stem+cells.">Effect of matrigel on the osteogenic potential of canine adipose tissue-derived mesenchymal stem cells.</a> Journal of Veterinary Medical Science. 74 (7), 827-836 (2012).</li><li>Uemura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel+supports+survival+and+neuronal+differentiation+of+grafted+embryonic+stem+cell-derived+neural+precursor+cells.">Matrigel supports survival and neuronal differentiation of grafted embryonic stem cell-derived neural precursor cells.</a> Journal of Neuroscience Research. 88 (3), 542-551 (2010).</li></ol>

NCC er en allsidig og viktigste bidragsyter til forskjellige vev og organer i løpet embryonale morphogenesis. O9-1 celle linjen opprettholder sitt potensial til å skille ut mange forskjellige celletyper og etterligner i vivo egenskapene til NCCs, gjør det en nyttig i vitro verktøy for å studere gen funksjon og molekylære regulering i NCCs. De ulike statusene O9-1 celler kan svarer til ulike neural crest avkom i vivo, avhengig av kultur forholdene celleområde O9-1. O9-1 celler kan opprett...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/58346/culturing-and-manipulation-of-o9-1-neural-crest-cells">Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells</a>. The Protocol section was updated.
Step 2.1 was updated from:
Prepare basal media for O9-1 cell culture by adding the following in DMEM (final concentrations are indicated): 15% FBS, 0.1 mM minimum essential media (MEM) nonessential amino acids, 1 mM sodium pyruvate, 55 mM beta-mercaptoethanol, 100 U/mL penicillin, 100 U/mL streptomycin, 2 mM L-glutamine, 103 units/mL leukemia inhibitory factor (LIF; added immediately before use, do not add to stock bottle), and 25 ng/mL fibroblast growth factor-basic (bFGF; added immediately before use, do not add to stock bottle).
to:
Prepare basal media for O9-1 cell culture by adding the following in DMEM (final concentrations are indicated): 15% FBS, 0.1 mM minimum essential media (MEM) nonessential amino acids, 1 mM sodium pyruvate, 55 &#181;M beta-mercaptoethanol, 100 U/mL penicillin, 100 &#181;g/mL streptomycin, 2 mM L-glutamine, 103 units/mL leukemia inhibitory factor (LIF; added immediately before use, do not add to stock bottle), and 25 ng/mL fibroblast growth factor-basic (bFGF; added immediately before use, do not add to stock bottle).
Step 5.1.1 was updated from:
To prepare osteogenic differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 0.1 mM dexamethasone, 100 ng/mL bone morphogenetic protein 2 (BMP2), 50 &#181;g/mL ascorbic acid, 10 mM b-glycerophosphate, 10% FBS, 100 U/mL penicillin, and 100 mg/mL streptomycin.
to:
To prepare osteogenic differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 0.1 &#181;M dexamethasone, 100 ng/mL bone morphogenetic protein 2 (BMP2), 50 &#181;g/mL ascorbic acid, 10 mM b-glycerophosphate, 10% FBS, 100 U/mL penicillin, and 100 &#181;g/mL streptomycin.
Step 5.2.1 was updated from:
To prepare chondrocyte differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 5% fetal calf serum (FCS), 1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 10 ng/mL transforming growth factor beta (TGF-b3), 50 mg/mL ascorbic acid, 10 ng/mL BMP2, 0.1 mM dexamethasone, and 1 mM sodium pyruvate.
to:
To prepare chondrocyte differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 5% fetal calf serum (FCS), 1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 100 U/mL penicillin, 100 &#181;g/mL streptomycin, 10 ng/mL transforming growth factor beta (TGF-b3), 50 &#181;g/mL ascorbic acid, 10 ng/mL BMP2, 0.1 &#181;M dexamethasone, and 1 mM sodium pyruvate.
Step 5.4.1 was updated from:
To prepare glial cell differentiation media, dilute the following in DMEM/F12 (final concentrations are indicated): 1x B-27 supplement, 2 mM L-glutamine, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 50 ng/mL LIF, and 1% heat-inactivated FBS.
to:
To prepare glial cell differentiation media, dilute the following in DMEM/F12 (final concentrations are indicated): 1x B-27 supplement, 2 mM L-glutamine, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL penicillin, 100 &#181;g/mL streptomycin, 50 ng/mL LIF, and 1% heat-inactivated FBS.

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/58346/culturing-and-manipulation-of-o9-1-neural-crest-cells">Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells</a>. The Protocol section was updated.

Erratum: Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells

Neural crest celler (NCCs) er multipotent stilk-lignende celler med en bemerkelsesverdig vandrende evne og forbigående eksistens under embryonale utviklingen. NCCs oppstår mellom overflaten ektoderm og medfødte og migrere til andre deler av fosteret i embryoutvikling1. Basert på sine funksjonelle domener, kan NCCs deles inn i flere typer, inkludert skallen, trunk, vagal, sakral, og cardiac NCCs. I tillegg kan NCCs skille ut flere celle linjene, som glatt muskelceller, beinet cellene og neurons, og gi opphav til ulike vev2,3. Utviklingen av NCCs er preget av en kompleks serie av Morfogenetiske hendelser som er finjustert med ulike molekylær signaler. Gitt komplekse regulering av NCCs og deres viktige bidrag til flere bygninger, kan feilregulering NCC utvikling ofte føre til congenital fødselsskader, som står for nesten 30% av alle menneskelige congenital fødselsskader. Abnormiteter under neural crest utviklingen kan føre til leppe leppe/ganen, feil nesen formasjon, syndromer, mangler defekt hjerte ut skrift eller selv spedbarnsdødeligheten1,4,5, 6 , 7. forstå molekylære mekanismer for NCC utvikling er viktig for å utvikle behandlinger for sykdommer forårsaket av feil i NCC utvikling. Med bruk av ulike i vitro og vivo tilnærminger8,9,10,11,12,13,14 ,15, betydelig fremgang har blitt gjort i NCC forskning. I vivo, dyr modeller, inkludert kyllinger, amfibier, sebrafisk og mus, har blitt brukt til å undersøke NCCs1. Videre har menneskelige embryo brukt til å studere prosessen for NCC tidlig menneskelige embryo utvikling16. In vitro, celle modeller for NCCs, som menneskelige NCCs som stammer fra pasienten subkutant fett, har blitt brukt til å undersøke Parkinsons17. O9-1 NCC linjen, som opprinnelig stammet fra masse kulturer av endogene NCCs isolert E8.5 musen embryo18, er en kraftig celle modell for å studere NCCs. viktigst, under ikke-differensierende oppdrettsforholdene, O9-1 celler Multipotent stilk-lignende NCCs. Men under varierende kultur forhold, kan O9-1 celler differensieres til unike celletyper, for eksempel glatt muskelceller, osteoblasts, chondrocytes og gliacellene18. O9-1 celler gitt disse egenskapene, og har blitt bredt brukt for NCC-relaterte studier, som undersøker molekylær mekanismen av skallen-ansikts defekter19,20.
Her, detaljert protokoller gis for opprettholde O9-1 cellene skille O9-1 celler i forskjellige celletyper og manipulere O9-1 celler ved å utføre genet tap-av-funksjon studier med CRISPR-Cas9 genomet redigering og lite forstyrrende RNA (siRNA)- mediert knockdown teknologier. Som et representativt eksempel er bruk av O9-1 celler å studere Yap og Taz tap-av-funksjon beskrevet. Yap og Taz er de nedstrøms effektor flodhesten signalveien, som spiller en avgjørende rolle i celle spredning, differensiering og apoptose. Hippo veien har også vist seg å være viktig i utviklingen og homeostase av flere ulike vev og organer og patogenesen av ulike sykdommer20,21,22,23 ,,24,,25,,26,,27,,28. Kjernekomponentene Hippo signalnettverk inkluderer tumor suppressor sterilt 20-lignende kinaser Mst1/2, WW domenet inneholder Salvador stillaset protein og store tumor suppressor homolog (Lats1/2) kinaser. Hippo signalering hemmer Yap og Taz og fremmer deres fornedrelse i cytoplasma. Uten undertrykkelse fra Hippo, kan Yap og Taz translocate i kjerner og fungere som transcriptional co aktivator. Vi nylig viste at spesielt inaktivere Hippo signalering effektor Yap og Taz musen NCCs ved hjelp av det Wnt1grobunn og Wnt1Cre2SOR drivere resulterte i embryonale dødelighet på E10.5 med alvorlig craniofacial feil20. Vi har også gjennomført studier med O9-1 celler for å undersøke rollen Yap og Taz i NCCs. For å studere Yap og Taz funksjon i NCC spredning og differensiering, Yap og Taz knockdown celler ble generert i O9-1 celler ved hjelp av siRNA og Yap knockout celler ble generert ved hjelp av CRISPR-Cas9 genomet redigering. De samme genet tap-av-funksjon strategiene kan brukes på ulike gener i andre veier. Gevinst-av-funksjon studier og transfection analyser kan i tillegg også brukes til O9-1 celler gen funksjon og regulering. Protokollene beskrevet her er ment å brukes av etterforskerne som støttelinjer for dyrking O9-1 celler for å opprettholde multipotent stemness, for å skille O9-1 celler i andre celletyper under annen kultur forhold og for å studere gen funksjon og molekylære mekanismer av NCCs.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Active STO feeder cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CRL-1503</td>
			<td>Also available in mitomycin C-inactivated form, catalog # ATCC 56-X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O9-1 mouse cranial neural crest cell line</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SCC049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, no glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11960-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (fetal bovine serum)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>ES-009-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin - streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine 200mM (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.25% in HBSS</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline) without calcium or magnesium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-512F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM non-essential amino acids (MEM NEAA) 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate (100mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-7522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ESGRO leukemia inhibitory factor (LIF) 106 unit/ml</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>ESG1106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human fibroblast growth factor-basic (rhFGF-basic)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>233-FB-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitomycin C</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10107409001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (dimethylsulfoxide)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MX1458-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13778-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum essential medium, alpha 1X with Earle&#39;s salts, ribonucleosides, deoxyribonucleosides, &#38; L-glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-022-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ON-TARGETplus Wwtr1 siRNA</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>L-041057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ON-TARGETplus Non-targeting Pool</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>D-001810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ON-TARGETplus Yap1 siRNA</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>L-046247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS (fetal calf serum)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS (insulin-transferrin-selenium )</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-b3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP2 (bone morphogenetic protein 2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing and manipulation of o9-1 neural crest cells

Neural crest celler (NCCs) overfører multipotent stamceller kan differensiere i ulike celletyper og gi opphav til flere vev og organer. O9-1 celle linjen er avledet fra den endogene mus embryonale NCCs og opprettholder sin multipotency. Imidlertid bestemte kultur tilfeller O9-1 celler kan differensiere i ulike celletyper og benyttes i en rekke forskningsformål. Nylig med en kombinasjon av mus studier og O9-1 celle studier, har vi vist at Hippo signalering veien effektor Yap og Taz spille viktige roller i neural crest-avledet craniofacial utvikling. Selv om culturing prosessen O9-1 celler er mer komplisert enn som brukes for andre cellelinjer, er O9-1 celle linjen en effektiv modell for å undersøke NCCs i vitro. Her presenterer vi en protokoll for dyrking O9-1 celle linjen for å opprettholde sin stemness, i tillegg til protokoller for skille O9-1 celler i ulike celletyper, for eksempel glatt muskelceller og osteoblasts. I tillegg beskrives protokoller for å utføre genet tap av funksjon studier i O9-1 celler ved hjelp av CRISPR-Cas9 sletting og lite forstyrrende RNA-mediert knockdown.

Målet med vår knockdown og knockout eksperimenter var å studere virkningene av Yap og Taz tap-av-funksjon i O9-1 celler. Før knockdown og knockout eksperimentene har vi sørge for at forberede basale media og kultur O9-1 cellene som beskrevet ovenfor (for eksempel kjelleren membranen matrise må dekke hele platen som vist i figur 1og O9-1 celler gjenopprettet fra flytende nitrogen som vist i figur 2). Vi utf...

Watch this Scientific Journal Video about Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells at JoVE.com

Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells

O9-1 er en multipotent musen neural crest cellen linje. Her beskriver vi detaljerte trinnvise protokoller for dyrking O9-1 cellene skille O9-1 celler i spesifikke celletyper og genetisk manipulering O9-1 celler ved hjelp av siRNA-mediert knockdown eller CRISPR-Cas9 genomet redigering.

Dyrking og manipulering av O9-1 Neural Crest celler

Neural crest cells (NCCs) are migrating multipotent stem cells that can differentiate into different cell types and give rise to multiple tissues and ...

O9-1 cellelinjen er et svært nyttig verktøy for å studere neural crest celler in vitro. Den har et stort potensial for bruk i et bredt spekter av søknad i ulike bruk av forskning. O9-1-celler har åpenbare fordeler, for eksempel enkel tilgang, og raskt å skaffe tilstrekkelige celletall for eksperimenter, noe som gjør det til en kraftig metode gratis å in vitro studier av neural crest celler.For å begynne, forberede basal media for O9-1 cellekultur, i henhold til tekstprotokollen. Deretter filtrerer du basalmediet, og vikler det i folie for å beskytte det mot lyset. Etter dette samler du inn bedede basale medier fra en aktivert STO-celler i henhold til tekstprotokollen.Først tine en aliquot av kjeller membran matrise på is i to timer. Deretter fortynner kjelleren membran matrise med filtrert sterilisert DMEM med 10% FBS til en endelig konsentrasjon på 0,5mg/ml. Coat platen med kjelleren membran matrise ved romtemperatur i en time.Deretter aspirerer kjellermembranmatrisen mens du vipper platen. Tørk platene ved 30 grader Celsius i 30 minutter. Når du legger kjellermembranmatrisen til platen, må du sørge for at løsningen dekket brønnen jevnt for å opprettholde celleegenskapene og unngå unødvendig variasjon mellom eksperimenter.Gjenopprett O9-1-celler ved å plassere et kryo-hetteglass i et 37 graders Celsius vannbad. Virvle hetteglasset langsomt til oppløsningen blir helt til væske. Etter dette overfører du celleoppløsningen fra kryo-hetteglasset til et 15 ml sentrifugerør.Legg til fem volumer dmem med 10% FBS til røret for å suspendere cellene på nytt. Sentrifuge cellene i tre minutter ved 180 Gs.Deretter aspirerer de overnaturlige, og tar vare på å ikke forstyrre pelleten. Deretter, re-suspendere pellet i betinget basal media supplert med LIF og BFGF.Seed cellene i en seks brønnplate, og agiter platen for å så cellene jevnt. Når du rører platen, gjør det horisontalt og vertikalt, da virvlende platen vil føre til at cellene konsentrerer seg mot midten. Og la disse cellene feste og vokse i en standard cellekultur inkubator over natten.Kontroller at cellene er festet før du endrer mediet. Når O9-1 cellene når 80% samløpet, tine kjelleren membran matrise og forberede en kjeller membran matrise belagt plate som beskrevet tidligere. Deretter legger basal media supplert med LIF og BFGF til membranmatrisen.Skyll brønnene forsiktig med 2 ml DPBS to ganger. Deretter dissosier cellene med 1 ml 0,05% trypsin EDTA ved 37 grader Celsius i tre minutter. Nøytraliser trypsinen med like mye DMEM med 10% FBS ved gjentatte ganger å pipes væsken over hele overflaten av brønnen.Deretter overfører du celleløsningen til et sentrifugerør. Og sentrifuge i tre minutter ved 180 Gs.Aspirer supernatent uten å forstyrre pellet av celler. Deretter, resuspend cellen pellet ved forsiktig pippetting betinget basal media supplert med LIF og BFGF.Seed cellene til den belagte platen som tidligere beskrevet. Deretter lar cellene feste og vokse i en standard cellekultur inkubator. Først forberede 2X frysing media i henhold til tekstprotokollen.Deretter filtrerer du på mediet. Skyll veggene på platen med DPBS to ganger, pipettering forsiktig for å unngå å miste celler. Deretter dissosiere cellene med 0,05% trypsin EDTA ved 37 grader Celsius i tre minutter.Nøytraliser trypsinen med like mye 10% FBS og DMEM. Overfør innholdet i platen til et sentrifugerør, og sentrifuge i tre minutter ved 180 Gs.Deretter aspirerer den overnaturlige og legger til 2 ml PBS for å gjenopplive pelleten. Sentrifuger celleløsningen igjen og aspirer den overnatur.Juster mengden basalmedier i røret etter behov, og legg til like mye 2x frysemedier. Deretter overfører du cellene til de merkede kryobrendene. Plasser kryohettebrene inne i en polystyrenboks med et lokk for å oppnå en langsom kjølehastighet ved 80 grader Celsius i minst 24 timer.For å utføre SIRNA knockdown i O9-1 celler, gjenopprette og så cellene. Fortynn liposomer i et passende volum serumfritt medium. Deretter fortynner SIRNA i serumfritt medium i henhold til tekstprotokollen.Etter dette legger du til den fortynnede SIRNA til de fortynnede liposomer, i henhold til produsentens instruksjoner. Bland løsningen ved pipettering, og inkuber i fem minutter ved romtemperatur. Deretter legger du til et passende volum av SIRNA lipidkompleks til cellene.Deretter inkubere cellene i 24 timer i en standard cellekultur inkubator. O9-1-celler kan differensiere til forskjellige celletyper under spesifikke differensieringskulturforhold. For å skille O9-1-celler til osteoplaster, lag osteogen differensieringsmedier i henhold til tekstprotokollen.Til slutt, oppdage osteoplast markør osteocalcin i differensierte osteoplaster ved immuno farging. For å skille O9-1 celler i glatte muskelceller, kultur dem under differensiering media i henhold til tekstprotokollen, og vurdere differensiering av glatt-muskel actin immuno farging. I denne protokollen ble både knock out og knock down eksperiment for å studere Yap tap av funksjon i O9-1 celler utført.Under glatt muskel celle differensiering forhold, de fleste vill type O9-1 celler ga opphav til glatt muskel handlingi positive glatte muskelceller. Yap null celler men generelt ikke klarte å skille seg inn SMA positive glatte muskelceller. Dette indikerer at Yap spiller en kritisk rolle i differensieringen av nevrale crest celler i glatte muskelceller.Mens du prøver denne prosedyren, er det viktig å huske å håndtere O9-1 cellelinjen forsiktig og forsiktig under hele prosessen. Pass på å fortynne og bruke basalmembranmatrisen riktig, og bruk 0,05% trypsin for celledissosiasjon. Ikke glem at under forberedelsen til O9-1 cellekultur, arbeide med mitomycin c kan være ekstremt farlig, og forholdsregler som iført en lab frakk og hansker bør alltid tas mens du utfører denne prosedyren.

Research

JoVE Journal

Genetics

Flow-sorting and Exome Sequencing of the Reed-Sternberg Cells of Classical Hodgkin Lymphoma

Flow-sortering og Exome Sequencing av Reed-Sternberg-cellene av klassisk Hodgkin-lymfom

The Hodgkin Reed-Sternberg cells of classical Hodgkin lymphoma are sparsely distributed within a background of inflammatory lymphocytes and typically ...

The Visual Colorimetric Detection of Multi-nucleotide Polymorphisms on a Pneumatic Droplet Manipulation Platform

Visual Colorimetric Påvisning av Multi-nukleotid polymorfismer på en pneumatisk Droplet Manipulasjon Platform

A simple and visual method to detect multi-nucleotide polymorphism (MNP) was performed on a pneumatic droplet manipulation platform on an open surface. ...

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetisk manipulering av Plant Patogen<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Å studere Fungal Biology and Plant mikrobe interaksjoner

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

Immunostaining for DNA modifikasjoner: beregningsorientert analyse av AC Confocal bilder

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Fosteret Microinjection og transplantasjon teknikk for Nasonia vitripennis genomet manipulasjon

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Svært effektiv Gene avbrudd i Murine og menneskelig blodkreft stamfar celler av CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Manipulering av Ploidy i Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Forberedelse og genet modifikasjon Nonhuman primas blodkreft stilk og Progenitor celler

Hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) transplantation has been a cornerstone therapy for leukemia and other cancers for nearly half a century, ...

Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish

Manipulering av gen funksjon i meksikansk Cavefish

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

In vivo anvendelsen av fjernkontroll systemet for manipulering av endogene genuttrykk

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...