Name: determination of reproductive competence by confirming pubertal onset and performing a fertility assay in mice and rats
Uploaded: 2018-10-13T15:00:00
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Agradeço os autores que contribuem para o trabalho inicial, que é a base desta publicação. Graças a Aitor Aguirre, Genevieve E. Ryan e Erica L. Schoeller para ajudar a preparar o manuscrito. Graças a Jessica Lee de Sora e queixo de Austin para assistência técnica com o manuscrito. H.M.H. foi apoiado por Eunice Kennedy Shriver National Institute de saúde infantil & desenvolvimento humano do institutos nacionais da saúde sob prêmio número R00HD084759.

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e uso Comitê da Michigan State University e conduzidos de acordo com o guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório.
1. determinar o início puberal
<ol><li>Siga as orientações institucionais para a roupa, no mínimo, é necessário usar um jaleco limpo e luvas esterilizadas. Sempre lidar com ratos usando luvas limpas.</li>
	<li>Prepare a área de trabalho, colocando uma almofada em cima da mes...

<ol>
	<li>Schneider, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+balance+and+reproduction.">Energy balance and reproduction.</a> Physiology and Behavior. 81 (2), 289-317 (2004).</li><li>Walton, J. C., Weil, Z. M., Nelson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+photoperiod+on+hormones,+behavior,+and+immune+function.">Influence of photoperiod on hormones, behavior, and immune function.</a> Frontiers Neuroendocrinology. 32 (3), 303-319 (2012).</li><li>Hoffmann, H. M., Mellon, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+population+of+hypothalamic+neurons+govern+fertility:+the+critical+role+of+VAX1+in+GnRH+neuron+development+and+fertility+maintenance.">A small population of hypothalamic neurons govern fertility: the critical role of VAX1 in GnRH neuron development and fertility maintenance.</a> Neuroscience communications. 2, (2016).</li><li>Kauffman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sexual+differentiation+and+the+Kiss1+system:+Hormonal+and+developmental+considerations.">Sexual differentiation and the Kiss1 system: Hormonal and developmental considerations.</a> Peptides. , (2009).</li><li>Bronson, F. H., Dagg, C. P., Snell, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Reproduction. , (1966).</li><li>Chehab, F. F., Mounzih, K., Lu, R., Lim, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+onset+of+reproductive+function+in+normal+female+mice+treated+with+leptin.">Early onset of reproductive function in normal female mice treated with leptin.</a> Science. , (1997).</li><li>Yoshimura, S., Yamaguchi, H., Konno, K., Ohsawa, N., Noguchi, S., Chisaka, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+of+Preputial+Separation+is+a+Useful+Tool+for+Evaluating+Endocrine+Active+Chemicals.">Observation of Preputial Separation is a Useful Tool for Evaluating Endocrine Active Chemicals.</a> J Toxicologic Pathology. 18, 141-157 (2005).</li><li>Ahima, R. S., Dushay, J., Flier, S. N., Prabakaran, D., Flier, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leptin+accelerates+the+onset+of+puberty+in+normal+female+mice.">Leptin accelerates the onset of puberty in normal female mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 99 (3), 391-395 (1997).</li><li>Bohlen, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+short-day+photoperiod+delays+the+timing+of+puberty+in+female+mice+via+changes+in+the+kisspeptin+system.">A short-day photoperiod delays the timing of puberty in female mice via changes in the kisspeptin system.</a> Frontiers in Endocrinology. 9 (FEB), 1-9 (2018).</li><li>Shahab, M., Mastronardi, C., Seminara, S. B., Crowley, W. F., Ojeda, S. R., Plant, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+hypothalamic+GPR54+signaling:+A+potential+mechanism+for+initiation+of+puberty+in+primates.">Increased hypothalamic GPR54 signaling: A potential mechanism for initiation of puberty in primates.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2005).</li><li>Hoffmann, H. M., Mellon, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+population+of+hypothalamic+neurons+govern+fertility:+the+critical+role+of+VAX1+in+GnRH+neuron+development+and+fertility+maintenance.">A small population of hypothalamic neurons govern fertility: the critical role of VAX1 in GnRH neuron development and fertility maintenance.</a> Neuroscience communications. 2, 5-9 (2016).</li><li>Navarro, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Neurokinin+B+in+the+Control+of+Female+Puberty+and+Its+Modulation+by+Metabolic+Status.">Role of Neurokinin B in the Control of Female Puberty and Its Modulation by Metabolic Status.</a> Journal of Neuroscience. 32 (7), 2388-2397 (2012).</li><li>Hoffmann, H. M., Tamrazian, A., Xie, H., P&#233;rez-Mill&#225;n, M. I., Kauffman, A. S., Mellon, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterozygous+deletion+of+ventral+anterior+homeobox+(Vax1)+causes+subfertility+in+mice.">Heterozygous deletion of ventral anterior homeobox (Vax1) causes subfertility in mice.</a> Endocrinology. 155 (10), 4043-4053 (2014).</li><li>Kauffman, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Kisspeptin+Receptor+GPR54+Is+Required+for+Sexual+Differentiation+of+the+Brain+and+Behavior.">The Kisspeptin Receptor GPR54 Is Required for Sexual Differentiation of the Brain and Behavior.</a> Journal of Neuroscience. 27 (33), 8826-8835 (2007).</li><li>Teles, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+report:+A+GPR54-activating+mutation+in+a+patient+with+central+precocious+puberty.">Brief report: A GPR54-activating mutation in a patient with central precocious puberty.</a> New England Journal of Medicine. , (2008).</li><li>Korenbrot, C. C., Huhtaniemi, I. T., Weiner, R. 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C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performing+Vaginal+Lavage,+Crystal+Violet+Staining,+and+Vaginal+Cytological+Evaluation+for+Mouse+Estrous+Cycle+Staging+Identification.">Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), 4-9 (2012).</li><li>Hedrich, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Laboratory Mouse. , (2012).</li><li>Hoffmann, H. M., Trang, C., Gong, P., Kimura, I., Pandolfi, E. C., Mellon, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+of+Vax1+from+Gonadotropin-Releasing+Hormone+(GnRH)+Neurons+Abolishes+GnRH+Expression+and+Leads+to+Hypogonadism+and+Infertility.">Deletion of Vax1 from Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) Neurons Abolishes GnRH Expression and Leads to Hypogonadism and Infertility.</a> Journal of Neuroscience. 36 (12), 3506-3518 (2016).</li><li>Sloboda, D. M., Howie, G. J., Pleasants, A., Gluckman, P. D., Vickers, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-+and+postnatal+nutritional+histories+influence+reproductive+maturation+and+ovarian+function+in+the+rat.">Pre- and postnatal nutritional histories influence reproductive maturation and ovarian function in the rat.</a> PLoS ONE. , (2009).</li><li>Manual, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breeding+Strategies+for+Maintaining+Colonies+of+Laboratory+Mice.">Breeding Strategies for Maintaining Colonies of Laboratory Mice.</a> Management. , (2007).</li><li>Kennedy, G. C., Mitra, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Body+weight+and+food+intake+as+initiating+factors+for+puberty+in+the+rat.">Body weight and food intake as initiating factors for puberty in the rat.</a> The Journal of Physiology. , (1963).</li><li>Sisk, C. L., Foster, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neural+basis+of+puberty+and+adolescence.">The neural basis of puberty and adolescence.</a> Nature Neuroscience. 7 (10), 1040-1047 (2004).</li><li>Nelson, J. F., Karelus, K., Felicio, L. S., Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+influences+on+the+timing+of+puberty+in+mice.">Genetic influences on the timing of puberty in mice.</a> Biology of reproduction. , (1990).</li><li>Nelson, J. F., Felicio, L. S., Randall, P. K., Sims, C., Finch, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+longitudinal+study+of+estrous+cyclicity+in+aging+C57BL/6J+mice:+I.+Cycle+frequency,+length+and+vaginal+cytology.">A longitudinal study of estrous cyclicity in aging C57BL/6J mice: I. Cycle frequency, length and vaginal cytology.</a> Biology of reproduction. , (1982).</li><li>Falconer, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Weight+and+age+at+puberty+in+female+and+male+mice+of+strains+selected+for+large+and+small+body+size.">Weight and age at puberty in female and male mice of strains selected for large and small body size.</a> Genetical Research. , (1984).</li><li>Rodriguez, I., Araki, K., Khatib, K., Martinou, J. C., Vassalli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+vaginal+opening+is+an+apoptosis-dependent+process+which+can+be+prevented+by+the+overexpression+of+Bcl2.">Mouse vaginal opening is an apoptosis-dependent process which can be prevented by the overexpression of Bcl2.</a> Developmental Biology. , (1997).</li><li>Lomniczi, A., Wright, H., Ojeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+of+female+puberty.">Epigenetic regulation of female puberty.</a> Frontiers in Neuroendocrinology. 36, 90-107 (2015).</li><li>Selmanoff, M. K., Goldman, B. D., Ginsburg, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+changes+in+serum+luteinizing+hormone,+follicle+stimulating+hormone+and+androgen+levels+in+males+of+two+inbred+mouse+strains.">Developmental changes in serum luteinizing hormone, follicle stimulating hormone and androgen levels in males of two inbred mouse strains.</a> Endocrinology. 100 (1), 122-127 (1977).</li><li>Larder, R., Clark, D. D., Miller, N. L. G., Mellon, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothalamic+Dysregulation+and+Infertility+in+Mice+Lacking+the+Homeodomain+Protein+Six6.">Hypothalamic Dysregulation and Infertility in Mice Lacking the Homeodomain Protein Six6.</a> Journal of Neuroscience. 31 (2), 426-438 (2011).</li><li>Knight, C. H., Maltz, E., Docherty, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Milk+yield+and+composition+in+mice:+Effects+of+litter+size+and+lactation+number.">Milk yield and composition in mice: Effects of litter size and lactation number.</a> Comparative Biochemistry and Physiology -- Part A: Physiology. 84 (1), 127-133 (1986).</li><li>Chahoud, I., Paumgartten, F. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+litter+size+on+the+postnatal+growth+of+rat+pups:+is+there+a+rationale+for+litter-size+standardization+in+toxicity+studies.">Influence of litter size on the postnatal growth of rat pups: is there a rationale for litter-size standardization in toxicity studies.</a> Environmental research. 109 (8), 1021-1027 (2009).</li><li>Pandolfi, E. C., Hoffmann, H. M., Schoeller, E. L., Gorman, M. R., Mellon, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haploinsufficiency+of+SIX3+Abolishes+Male+Reproductive+Behavior+Through+Disrupted+Olfactory+Development,+and+Impairs+Female+Fertility+Through+Disrupted+GnRH+Neuron+Migration.">Haploinsufficiency of SIX3 Abolishes Male Reproductive Behavior Through Disrupted Olfactory Development, and Impairs Female Fertility Through Disrupted GnRH Neuron Migration.</a> Molecular Neurobiology. , (2018).</li></ol>

O bem-estar geral dos ratos é fundamental para um ensaio de fertilidade bem sucedida21. Ao realizar um ensaio de fertilidade, é importante verificar fisicamente não nos ratos todos os dias pois isso pode causar estresse. Mais Evite mudanças frequentes de gaiola, como estas também são estressantes. Idealmente as alterações gaiola serão feitas não mais do que 1 - 2 vezes por semana. Exposição à luz durante a fase de escura impacta negativamente reprodutores em roedores noturnos. Não li...

A transição da puberdade é necessário para atingir a maturidade sexual e reprodutiva competência. A transição da puberdade e a manutenção da fertilidade na idade adulta é regulada pelo eixo reprodutivo, também denominado o eixo hipotálamo-hipófise-gonadal (Figura 1). O calendário de início puberal e manutenção da fertilidade é fortemente regulamentados por fatores internos, bem como ambientais para aumentar as chances de sobrevivência da prole e os pais de1,2. Este protocolo fornece uma abordagem não-invasivo para determinar o início puberal em camundongos e ratos para confirmar a maturidade sexual antes da criação de um estudo de fertilidade para avaliar a competência reprodutiva.
Um estudo de fertilidade é executado em animais sexualmente maduros e pode ser iniciado depois que os animais passaram pela puberdade. Antes início puberal, o eixo reprodutivo é quiescente, e o principal motor da maturação sexual, hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH), é liberado para a hipófise em quantidades insuficientes para iniciar a puberdade (Figura 1). Início puberal é um processo complexo que resulta em maior liberação de GnRH na eminência da mediana. GnRH promove o hormônio luteinizante (LH) e folículo-estimulante de secreção de hormônio (FSH) da hipófise, dois hormônios essenciais para a maturação gonadal e função reprodutiva (Figura 1)3,4,5 .
Insultos ao eixo reprodutivo resultam em redução da fertilidade e podem também início puberal adiantamento ou atraso. Condições conhecidas para influenciar o momento do início puberal e competência reprodutiva incluem a exposição a endócrinos produtos químicos6,7,1,do peso de corpo aumentou/diminuiu8, mudanças na comprimento de dia2,9 e mutações genéticas10,11,12,13,14,15.
O início da maturidade sexual é um passo crítico que precisa ser concluído antes da criação de um ensaio de fertilidade. As vantagens de determinar o início puberal através de separação prepucial, abertura vaginal e o primeiro estro, são as características não-invasivo desses procedimentos, que não requerem a coleta de sangue ou sacrifício do animal16, 17.
Após início puberal é determinado, corretamente, configurando um estudo de fertilidade irá fornecer informações importantes sobre a integridade do eixo reprodutivo e geralmente tem a segunda vantagem de gerar animais experimentais para estudos adicionais (refinamento) 18. a instalação de estudo de fertilidade descrita neste protocolo pode detectar pequenos e grandes déficits em competência reprodutiva em machos e fêmeas. Principais parâmetros avaliados incluem 1) tempo para a primeira ninhada, 2) número de ninhadas gerado em um determinado tamanho de tempo e maca 3). Finalmente, as recomendações para o tipo de acompanhamento de estudos, que pode ser realizado para identificar a causa de deficiência de fertilidade estão incluídas.
O protocolo descrito refere-se aos ratos e os dados representativos refletem o trabalho realizado em ratos transgénicos. No entanto, todos os protocolos incluídos são igualmente válidos em ratos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1092">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Sterile Cotton Balls</td>
			<td style="width:167px;">Fisher</td>
			<td style="width:280px;">22456885</td>
			<td style="width:429px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Surface protector</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1420637</td>
			<td style="width:429px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Light meter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21800-014</td>
			<td style="width:429px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Methylene blue&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9140</td>
			<td style="width:429px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microscope Slides</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>29-101</td>
			<td style="width:429px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Optimouse rack with cages</td>
			<td>AnimalCare systems</td>
			<td>C89100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Water Bottle Basket&#160;</td>
			<td>AnimalCare systems</td>
			<td>C61011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Filtered Cage Tops</td>
			<td>AnimalCare systems</td>
			<td>C78210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Optimice Standard Feeder</td>
			<td>AnimalCare systems</td>
			<td>C40100SG</td>
			<td style="width:429px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cage Card Holder</td>
			<td>AnimalCare systems</td>
			<td>C43251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cage Cards</td>
			<td>AnimalCare systems</td>
			<td>M52010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bottle Assambley</td>
			<td>AnimalCare systems</td>
			<td>C79122P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bed R&#39;Nest Nesting</td>
			<td style="width:167px;">The Andersons</td>
			<td style="width:280px;">BRN4WSR</td>
			<td style="width:429px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">1/8&#34; Corn Cob bedding&#160;</td>
			<td style="width:167px;">The Andersons</td>
			<td style="width:280px;">8B</td>
			<td style="width:429px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Standard mouse chow</td>
			<td>Teklad</td>
			<td style="width:280px;">7904 (7004)</td>
			<td style="width:429px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Scale</td>
			<td>VWR</td>
			<td style="width:280px;">10205-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Polypropylene Beaker</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-955-111F</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of reproductive competence by confirming pubertal onset and performing a fertility assay in mice and rats

Avaliação da competência reprodutiva é fundamental para a compreensão do impacto de um tratamento ou manipulação genética do eixo reprodutivo, também denominado o eixo hipotálamo-hipófise-gonadal. O eixo reprodutivo é um integrador de chave de entrada interna e ambiental adapta a fertilidade de condições favoráveis para a reprodução. Antes de embarcar em um estudo de fertilidade em ratos e ratos, a maturidade sexual é avaliada para excluir a possibilidade de que os fenótipos reprodutivos observados são causados por atraso ou ausência de início puberal. Este protocolo descreve uma abordagem não-invasivo para avaliar o início puberal em machos através da determinação da separação prepucial e nas fêmeas através da abertura vaginal e do primeiro estro. Após a confirmação da conclusão da puberdade e a consecução da maturidade sexual, um estudo de fertilidade pode ser iniciado. O procedimento descreve as condições de reprodução ideal para ratos e ratos, como configurar um estudo de fertilidade e quais os parâmetros para avaliar e determinar se o tratamento ou supressão do gene tem um impacto sobre a fertilidade.

Os resultados apresentados são de dois modelos de mouse diferente de transgênicos, onde o fator dos transcrição, nomeadamente a homeobox anterior Ventral 1 (Vax1) foi excluído em todo o corpo em um alelo, aqui referido como heterozigoto ratos (HET)13, ou Vax1 foi condicionalmente excluído dentro de GnRH neurônios22, aqui denominado KO condicional (cKO). Antes de configurar o estudo de fertilidade, é importante confi...

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Determination of Reproductive Competence by Confirming Pubertal Onset and Performing a Fertility Assay in Mice and Rats

Determinação da competência reprodutiva, confirmando o início puberal e realizando um ensaio de fertilidade em camundongos e ratos

Muitos tratamentos e mutações genéticas impactam o momento da maturidade sexual e fertilidade. Este protocolo descreve um método não-invasivo para avaliar o início puberal em camundongos e ratos antes da criação de um estudo de fertilidade em animais sexualmente maduros.

Assessment of reproductive competence is critical for understanding the impact of a treatment or genetic manipulation on the reproductive axis, also ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo reprodutivo, como como determinar o aparecimento pubertal em camundongos e ratos através de separação pré-putial, abertura vaginal e estabelecer primeiros estrus antes de realizar um estudo de fertilidade. A principal vantagem dessa técnica é que, ao estabelecer o início pubertal utilizando a abordagem não invasiva demonstrada, é possível acompanhar e realizar um estudo de fertilidade em animais sexualmente maduros. As implicações dessa técnica se estendem ao diagnóstico de déficits na reprodução, causados por mutações genéticas ou tratamentos suscetíveis à competência reprodutiva de impacto, como produtos químicos endócrinos.Embora este método possa fornecer uma visão da competência reprodutiva em camundongos, ele também pode ser aplicado a outros sistemas de modelo, como ratos e hamsters. A demonstração visual deste método é fundamental, pois requer boas e delicadas habilidades de manejo animal. É particularmente importante segurar os camundongos corretamente para a seguinte identificação visual de separação pré-putial e abertura vaginal.Para preparar a área de trabalho, coloque um bloco sobre a mesa. Em seguida, coloque uma parte superior limpa da gaiola do mouse com a grade voltada para cima, na almofada. Em seguida, montar uma escala na área de trabalho.Coloque um béquer limpo de 500 a 1000 mililitros na balança e o coloque. Em seguida, coloque uma folha ao lado da área de trabalho para registrar os dados. Depois disso, coloque a gaiola do rato na área de trabalho.Abra a gaiola e remova a tampa, a garrafa de água e o suporte de alimentos para a mesa. Enquanto segura o mouse pela cauda, coloque-o na parte superior limpa da gaiola do mouse. Mantendo o controle da cauda, permita que o mouse explore a grade do topo da gaiola.Puxe suavemente a cauda para trás e aproxime-se da outra mão para a pele perto do pescoço e orelhas. Segure a pele solta entre os ombros e o pescoço com o polegar e o dedo indicador. Em seguida, pegue a pele nas costas com os dedos restantes e segure o mouse pressionando-o suavemente contra a mão.Com a mão livre, empurre suavemente a pele ao redor do pênis para trás. Na separação pré-putial, a pele pré-putial desliza para trás, expondo o pênis glande. Após o exame, regise a presença ou ausência de separação pré-putial.Depois disso, pese o mouse e regisse seu peso. Em seguida, reintroduzir o rato na gaiola de habitação segurando o béquer sobre o chão da gaiola e permitindo que o rato saia por conta própria. Coloque uma bola de algodão, um grande béquer, e uma garrafa de água estéril na área de trabalho.Despeje água estéril no béquer. Em seguida, umidificar a bola de algodão com a água estéril no béquer, e colocá-la ao lado do topo da gaiola limpa. Coloque a gaiola do rato na área de trabalho.Em seguida, transfira o mouse para o topo da gaiola segurando-o pela base de sua cauda. Puxe suavemente a cauda do mouse para encorajar um movimento para a frente pelo mouse. Depois disso, levante a cauda enquanto apoia os quadris com três dedos.Limpe suavemente a vulva com a bola de algodão umidificada, em seguida, examine a vulva para determinar se a vagina está completamente aberta. Regisso se ocorreu abertura vaginal. Em seguida, pese o rato e devolva-o para a gaiola.Prepare uma gaiola de rato limpa com tampa, água, comida, roupa de cama e material de aninhamento para cada par de camundongos. Em seguida, preencha os cartões da gaiola com as informações necessárias. Coloque a gaiola de cama preparada sobre uma mesa limpa, em seguida, introduza lentamente uma mão enluvada na gaiola do rato e deixe-a na gaiola por um curto período de tempo.Aproxime-se lentamente dos ratos com a mão enluvada. Quando os ratos passarem por cima da mão, pegue a cauda de um rato entre o polegar e o dedo indicador, em seguida, levante o mouse pela cauda. O mouse pode ser segurado pela cauda sem suporte do corpo por até dois a três segundos.Coloque o rato na gaiola de reprodução preparada e feche a gaiola depois de garantir que os camundongos machos e fêmeas tenham alimentos, água e material de aninhamento. Utilizando o método apresentado, foram estudados dois modelos diferentes de camundongos transgênicos. Abertura vaginal e separação pré-putial ocorreram na mesma idade e peso tanto nos camundongos heterozigosos quanto nos camundongos de controle.Por outro lado, a abertura vaginal e a separação pré-putial foram significativamente em fêmeas e machos nocaute condicional, e associadas ao aumento do peso corporal. Com 4,5 semanas de idade, os controles femininos e os ratos eliminatórios condicionales tinham peso corporal comparável, enquanto os machos de nocaute condicional eram ligeiramente mais pesados que os controles. Isso indica que o atraso na abertura vaginal e a separação pré-putial dos camundongos eliminatórios condicional não foram associados a um atraso no ganho de peso.Após a conclusão do início pubertal, o estudo de fertilidade foi iniciado aos 10 a 16 semanas. Ambos os camundongos heterozigotos machos e fêmeas eram subfértil. As fêmeas heterozigotos geraram menos ninhadas no estudo de três meses, e tanto os camundongos heterozigotos masculinos quanto as fêmeas geraram ninhadas menores.Para ilustrar a importância de confirmar o início pubertal antes da criação de um ensaio de fertilidade, a competência reprodutiva foi avaliada em camundongos eliminatórios condicionais. Durante o estudo de fertilidade de 70 dias, nem machos ou fêmeas condicionales geraram lixo. Ao tentar esse procedimento, é importante lembrar de manusear os camundongos com cuidado e manter a calma enquanto se aproxima e manuseia os animais.Após este procedimento, outros métodos como medir os níveis de hormônio sexual circulante podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como se a infertilidade ou outra subfertilidade foi causada por testosterona anormal, estrogênio, hormônio estimulante folículo e níveis hormonais luteínos. Não se esqueça que trabalhar com camundongos pode ser perigoso devido ao risco de morder e desenvolvimento de alergias. Para reduzir a exposição, precauções como o uso de luvas e um jaleco, e o manuseio cuidadoso dos ratos, devem ser sempre tomadas durante a realização deste procedimento.

Research

JoVE Journal

Biology

Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats

Restrição manual e rotas de Administração composto comum em camundongos e ratos

Being able to safely and effectively restrain mice and rats is an important part of conducting research.  Working confidently and humanely with mice and ...

Biologia

Diagnostic Necropsy and Selected Tissue and Sample Collection in Rats and Mice

Necropsia de diagnóstico e coleta de tecido e amostra selecionada em ratos e camundongos

There are multiple sample types that may be collected from a euthanized animal in order to help diagnose or discover infectious agents in an animal ...

Ovariectomy and 17&beta;-estradiol Replacement in Rats and Mice: A Visual Demonstration

Ovariectomy and 17&#946;-estradiol Replacement in Rats and Mice: A Visual Demonstration

Ovariectomia e 17β-estradiol substituição em ratos e camundongos: uma demonstração visual

Estrogens are a family of female sexual hormones with an exceptionally wide spectrum of effects. When rats and mice are used in estrogen research they are ...

A Rapid and Specific Microplate Assay for the Determination of Intra- and Extracellular Ascorbate in Cultured Cells

Uma rápida e específica de microplaca de ensaio para a determinação de ascorbato intra-e extracelular em células cultivadas

Vitamin C (ascorbate) plays numerous important roles in cellular metabolism, many of which have only come to light in recent years. For instance, within ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

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In Vivo Rastreamento 4-Dimensional de tronco hematopoéticas e células progenitoras em adultos mouse na calota craniana de Medula Óssea

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

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Face Detection En de óxido nítrico e superóxido na camada endotelial das artérias intactas

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The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

A técnica de rim perfundidos rato isolado

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

Determination of Sialic Acids in Liver and Milk Samples of Wild-type and CMAH Knock-out Mice.

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Determinação de ácidos sialic em amostras de fígado e leite de tipo selvagem e<em&gt; CMAH</em&gt; Ratinhos de eliminação.

CMAH (cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acid hydroxylase) is responsible for the oxidation of cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acids in ...

Forced Salivation As a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes

Forçado a salivação como um método para analisar a competência vetorial de mosquitos

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Reproductive Techniques for Ovarian Monitoring and Control in Amphibians

Técnicas reprodutivas para monitoramento e controle ovariano em anfíbios

Ovarian control and monitoring in amphibians require a multi-faceted approach. There are several applications that can successfully induce reproductive ...