Name: analysis of cancer cell invasion and anti-metastatic drug screening using hydrogel micro-chamber array (hmca)-based plates
Uploaded: 2018-10-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array HMCA-based Plates at JoVE.com

Dette arbejde støttes af arv af Moshe Shimon og Judith Weisbrodt.

1. HMCA plade prægning
Bemærk: Den komplet proces for design og fabrikation af Polydimethylsiloxan (PDMS) stempel og HMCA imaging plade anvendes i denne protokol er beskrevet i detaljer i vores tidligere artikel15,16. PDMS stempel (negativ form) bruges til prægning HMCA (positiv form), som består af omkring 450 MCs pr. brønd (figur 1A). Som vist i figur 1B, hver af MCs har ...

<ol>
	<li>Guan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+metastases:+challenges+and+opportunities.">Cancer metastases: challenges and opportunities.</a> Acta pharmaceutica Sinica. B. 5 (5), 402-418 (2015).</li><li>Sapudom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phenotype+of+cancer+cell+invasion+controlled+by+fibril+diameter+and+pore+size+of+3D+collagen+networks.">The phenotype of cancer cell invasion controlled by fibril diameter and pore size of 3D collagen networks.</a> Biomaterials. 52, 367-375 (2015).</li><li>Portillo-Lara, R., Annabi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microengineered+cancer-on-a-chip+platforms+to+study+the+metastatic+microenvironment.">Microengineered cancer-on-a-chip platforms to study the metastatic microenvironment.</a> Lab on a chip. 16 (21), 4063-4081 (2016).</li><li>Gkountela, S., Aceto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem-like+features+of+cancer+cells+on+their+way+to+metastasis.">Stem-like features of cancer cells on their way to metastasis.</a> Biology Direct. 11 (1), 33 (2016).</li><li>Kramer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+cell+migration+and+invasion+assays.">In vitro cell migration and invasion assays.</a> Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 752 (1), 10-24 (2013).</li><li>Guzman, A., S&#225;nchez Alemany, V., Nguyen, Y., Zhang, C. R., Kaufman, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+3D+in+vitro+metastasis+model+elucidates+differential+invasive+strategies+during+and+after+breaching+basement+membrane.">A novel 3D in vitro metastasis model elucidates differential invasive strategies during and after breaching basement membrane.</a> Biomaterials. 115, 19-29 (2017).</li><li>Lee, E., Song, H. -. H. G., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+on-a-chip+platforms+for+studying+cancer+metastasis.">Biomimetic on-a-chip platforms for studying cancer metastasis.</a> Current opinion in chemical engineering. 11, 20-27 (2016).</li><li>Mittler, F., Obe&#239;d, P., Rulina, A. V., Haguet, V., Gidrol, X., Balakirev, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Content+Monitoring+of+Drug+Effects+in+a+3D+Spheroid+Model.">High-Content Monitoring of Drug Effects in a 3D Spheroid Model.</a> Frontiers in Oncology. 7, 293 (2017).</li><li>Evensen, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+High-Throughput+Three-Dimensional+Invasion+Assay+for+Anti-Cancer+Drug+Discovery.">Development of a High-Throughput Three-Dimensional Invasion Assay for Anti-Cancer Drug Discovery.</a> PLoS ONE. 8 (12), e82811 (2013).</li><li>Aw Yong, K. M., Li, Z., Merajver, S. D., Fu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+tumor+invasion+front+using+long-term+fluidic+tumoroid+culture.">Tracking the tumor invasion front using long-term fluidic tumoroid culture.</a> Scientific Reports. 7 (1), 10784 (2017).</li><li>Mi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+co-culture+system+for+cancer+migratory+analysis+and+anti-metastatic+drugs+screening.">Microfluidic co-culture system for cancer migratory analysis and anti-metastatic drugs screening.</a> Scientific Reports. 6 (1), 35544 (2016).</li><li>Chung, S., Sudo, R., Mack, P. J., Wan, C. -. R., Vickerman, V., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+into+scaffolds+under+co-culture+conditions+in+a+microfluidic+platform.">Cell migration into scaffolds under co-culture conditions in a microfluidic platform.</a> Lab on a chip. 9 (2), 269-275 (2009).</li><li>Krakhmal, N. V., Zavyalova, M. V., Denisov, E. V., Vtorushin, S. V., Perelmuter, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+Invasion:+Patterns+and+Mechanisms.">Cancer Invasion: Patterns and Mechanisms.</a> Acta naturae. 7 (2), 17-28 (2015).</li><li>Lintz, M., Mu&#241;oz, A., Reinhart-King, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mechanics+of+Single+Cell+and+Collective+Migration+of+Tumor+Cells.">The Mechanics of Single Cell and Collective Migration of Tumor Cells.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 139 (2), 21005 (2017).</li><li>Afrimzon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogel+microstructure+live-cell+array+for+multiplexed+analyses+of+cancer+stem+cells,+tumor+heterogeneity+and+differential+drug+response+at+single-element+resolution.">Hydrogel microstructure live-cell array for multiplexed analyses of cancer stem cells, tumor heterogeneity and differential drug response at single-element resolution.</a> Lab on a Chip. 16 (6), 1047-1062 (2016).</li><li>Shafran, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+is+cytoprotective+to+breast+cancer+spheroids+vulnerable+to+estrogen-induced+apoptosis.">Nitric oxide is cytoprotective to breast cancer spheroids vulnerable to estrogen-induced apoptosis.</a> Oncotarget. 8 (65), 108890-108911 (2017).</li><li>Sato, H., Idiris, A., Miwa, T., Kumagai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabric+Vessels+for+Embryoid+Body+Formation+and+Rapid+Differentiation+of+Pluripotent+Stem+Cells.">Microfabric Vessels for Embryoid Body Formation and Rapid Differentiation of Pluripotent Stem Cells.</a> Scientific Reports. 6 (1), 31063 (2016).</li><li>Lee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gravity-oriented+microfluidic+device+for+uniform+and+massive+cell+spheroid+formation.">Gravity-oriented microfluidic device for uniform and massive cell spheroid formation.</a> Biomicrofluidics. 6 (1), 14114 (2012).</li><li>Zaretsky, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+the+dynamics+of+primary+T+cell+activation+and+differentiation+using+long+term+live+cell+imaging+in+microwell+arrays.">Monitoring the dynamics of primary T cell activation and differentiation using long term live cell imaging in microwell arrays.</a> Lab on a Chip. 12 (23), 5007 (2012).</li><li>Khan, N., Syed, D. N., Ahmad, N., Mukhtar, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fisetin:+a+dietary+antioxidant+for+health+promotion.">Fisetin: a dietary antioxidant for health promotion.</a> Antioxidants &amp; redox signaling. 19 (2), 151-162 (2013).</li><li>Lee, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Networked+concave+microwell+arrays+for+constructing+3D+cell+spheroids.">Networked concave microwell arrays for constructing 3D cell spheroids.</a> Biofabrication. 10 (1), 15001 (2017).</li><li>Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+(3D)+tumor+spheroid+invasion+assay.">Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (99), e52686 (2015).</li><li>Toh, Y. -. C., Raja, A., Yu, H., van Noort, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+Microfluidic+Model+to+Recapitulate+Cancer+Cell+Migration+and+Invasion.">A 3D Microfluidic Model to Recapitulate Cancer Cell Migration and Invasion.</a> Bioengineering. 5 (2), 29 (2018).</li><li>Sugimoto, M., Kitagawa, Y., Yamada, M., Yajima, Y., Utoh, R., Seki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropassage-embedding+composite+hydrogel+fibers+enable+quantitative+evaluation+of+cancer+cell+invasion+under+3D+coculture+conditions.">Micropassage-embedding composite hydrogel fibers enable quantitative evaluation of cancer cell invasion under 3D coculture conditions.</a> Lab on a Chip. 18 (9), 1378-1387 (2018).</li><li>Yamamoto, S., Hotta, M. M., Okochi, M., Honda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Vascular+Formed+Endothelial+Cell+Network+on+the+Invasive+Capacity+of+Melanoma+Using+the+In+Vitro+3D+Co-Culture+Patterning+Model.">Effect of Vascular Formed Endothelial Cell Network on the Invasive Capacity of Melanoma Using the In Vitro 3D Co-Culture Patterning Model.</a> PLoS ONE. 9 (7), e103502 (2014).</li><li>Lee, S. -. H., Moon, J. J., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+micropatterning+of+bioactive+hydrogels+via+two-photon+laser+scanning+photolithography+for+guided+3D+cell+migration.">Three-dimensional micropatterning of bioactive hydrogels via two-photon laser scanning photolithography for guided 3D cell migration.</a> Biomaterials. 29 (20), 2962-2968 (2008).</li><li>Gschwind, A., Zwick, E., Prenzel, N., Leserer, M., Ullrich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+communication+networks:+epidermal+growth+factor+receptor+transactivation+as+the+paradigm+for+interreceptor+signal+transmission.">Cell communication networks: epidermal growth factor receptor transactivation as the paradigm for interreceptor signal transmission.</a> Oncogene. 20 (13), 1594-1600 (2001).</li><li>Jiang, K., Dong, C., Xu, Y., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic-based+biomimetic+models+for+life+science+research.">Microfluidic-based biomimetic models for life science research.</a> RSC Advances. 6 (32), 26863-26873 (2016).</li><li>Mason, B. N., Starchenko, A., Williams, R. M., Bonassar, L. J., Reinhart-King, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+three-dimensional+collagen+matrix+stiffness+independently+of+collagen+concentration+modulates+endothelial+cell+behavior.">Tuning three-dimensional collagen matrix stiffness independently of collagen concentration modulates endothelial cell behavior.</a> Acta biomaterialia. 9 (1), 4635-4644 (2013).</li><li>Raub, C. B., Putnam, A. J., Tromberg, B. J., George, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+bulk+mechanical+properties+of+cellularized+collagen+gels+using+multiphoton+microscopy.">Predicting bulk mechanical properties of cellularized collagen gels using multiphoton microscopy.</a> Acta Biomaterialia. 6 (12), 4657-4665 (2010).</li><li>Paszek, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype.">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).</li><li>Rao, S. S., DeJesus, J., Short, A. R., Otero, J. J., Sarkar, A., Winter, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+Behaviors+in+Three-Dimensional+Collagen-Hyaluronan+Composite+Hydrogels.">Glioblastoma Behaviors in Three-Dimensional Collagen-Hyaluronan Composite Hydrogels.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 5 (19), 9276-9284 (2013).</li><li>Kreger, S. T., Voytik-Harbin, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronan+concentration+within+a+3D+collagen+matrix+modulates+matrix+viscoelasticity,+but+not+fibroblast+response.">Hyaluronan concentration within a 3D collagen matrix modulates matrix viscoelasticity, but not fibroblast response.</a> Matrix Biology. 28 (6), 336-346 (2009).</li><li>Chanmee, T., Ontong, P., Itano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronan:+A+modulator+of+the+tumor+microenvironment.">Hyaluronan: A modulator of the tumor microenvironment.</a> Cancer Letters. 375 (1), 20-30 (2016).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+Three-Dimensional+Microenvironment+with+Hyaluronan+of+Different+Molecular+Weights+Alters+Breast+Cancer+Cell+Invasion+Behavior.">Modulating Three-Dimensional Microenvironment with Hyaluronan of Different Molecular Weights Alters Breast Cancer Cell Invasion Behavior.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 9 (11), 9327-9338 (2017).</li><li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+role+of+low+molecular+weight+hyaluronan+in+breast+cancer+metastasis.">A novel role of low molecular weight hyaluronan in breast cancer metastasis.</a> The FASEB Journal. 29 (4), 1290-1298 (2015).</li><li>Fisher, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+resistance,+high+molecular+weight+hyaluronic+acid,+and+longevity.">Cancer resistance, high molecular weight hyaluronic acid, and longevity.</a> Journal of cell communication and signaling. 9 (1), 91-92 (2015).</li></ol>

Det er veldokumenteret, at levende organismer, kendetegnet ved deres komplekse 3D flercellede organisation er helt adskilt fra almindeligt anvendte 2D éncellelag kulturperler celler, understreger det påtrængende behov for at bruge cellulære modeller, som bedre efterligner funktioner og processer i den levende organisme for stof screening. For nylig, flercellede spheroids, organotypic kulturer, organoids og organer-on-a-chip har været indført8 til brug i standardiseret drug discovery. Dog tru...

Kræft død er hovedsagelig tilskrives spredning af metastatisk celler til fjerne steder. Mange bestræbelser i kræftbehandling fokusere på målretning eller forhindre dannelsen af metastatisk kolonier og progression af systemisk metastatisk sygdom1. Kræft celle migration er et afgørende skridt i tumor metastaser proces, forskning i kræft invasion cascade er således meget vigtigt og en forudsætning for at finde anti-metastatisk therapeutics.
Anvendelsen af dyremodeller som værktøjer til at studere metastatisk sygdom er blevet fundet for at være meget dyrt og ikke altid repræsentativt for tumor hos mennesker. Desuden påvirker de ekstracellulære mikromiljø topologi, mekanik og sammensætning kraftigt kræft celle opførsel2. Da i vivo modeller i sagens natur mangler evnen til at adskille og kontrollere sådanne specifikke parametre, som bidrager til kræft invasion og metastaser, er der behov for en kontrollerbar biomimetiske in vitro- modeller.
For at metastaserer til fjerntliggende organer, skal kræftceller udstille vandrende og invasive fænotypiske egenskaber, som kan målrettes til terapi. Da de fleste in vitro- kræftmodeller ikke efterligne de faktiske funktioner af solide tumorer3, er det imidlertid meget udfordrende at opdage fysiologisk relevante fænotyper. Derudover dikterer fænotypiske heterogenitet, der findes inden for tumor, at analysere tumor migration på ét element beslutning for at opdage fænotype-instrueret behandlinger, for eksempel ved at målrette den metastase-indlede celle befolkningen i heterogene tumorer4.
Undersøgelse af celle motilitet og kollektive migration er primært udført i éncellelag kulturer af epitelceller på homogene plane overflader. Disse konventionelle cellulære modeller for kræft celle migration er baseret på befolkning analysen af individuelle celler invaderer gennem membraner og ECM komponenter5, men i sådanne systemer, de iboende forskelle mellem individuelle celler ikke kan være studerede. Generere 3D spheroids enten via stilladser eller stillads-gratis mikro-strukturer er betragtes som en overlegen betyder at studere tumor celle vækst og cancer invasion6,7,8. Dog mest 3D systemer er ikke egnet til høj overførselshastighed formater, og Inter klumpformet interaktion opnås normalt ikke da isolerede enkelte spheroids genereres i hver mikro-godt9. Nylige undersøgelser der involverer kræft migration er baseret på mikrofluid enheder3,10,11,12, men disse sofistikerede mikrofluid værktøjer er vanskelige at producere og ikke kan bruges til high throughput screening (HTS) af anti-invasive narkotika.
To vigtigste fænotyper, kollektive og individuelle celle migration, som spiller en rolle i tumorceller at overvinde ECM barriere og invaderer nærliggende væv, har været demonstreret13,14, hver viser forskellige morfologiske karakteristika, biokemiske, molekylære og genetiske mekanismer. Desuden er to former for overflytning tumorceller, fibroblast-lignende og amoeboid, observeret i hver fænotype. Da begge, invasion fænotyper og migration tilstande, defineres primært ved morfologiske egenskaber, der er behov for cellulær modeller at aktivere imaging-baseret detektion og behandling af alle former for tumor invasion og overflytning af celler.
Det overordnede mål i den aktuelle metode er at give en simpel og reproducerbar biomimetiske 3D i vitro celle-baserede system til analyse af invasion kapacitet i store bestande af tumor spheroids. Her introducerer vi HMCA-baserede 6-godt imaging plade for forskning af tumor invasion og anti-metastatisk terapi. Teknologien gør det muligt for dannelsen af et stort antal ensartet 3D tumor spheroids (450 pr. brønd) i en hydrogel mikro-kamre (MC) struktur. Forskellige ECM komponenter føjes til matrixen klumpformet aktivere invasion af celler ind i det omgivende miljø. Invasion processen overvåges løbende af kort og lang sigt observation af de samme individuelle spheroids/invaderer celler og letter morfologiske karakteristika, fluorescerende farvning og hentning af specifikke spheroids på ethvert tidspunkt. Da talrige spheroids deler plads og medium, er interaktion via opløselige molekyler mellem individuelle spheroids og deres indvirkning på hinanden muligt. Semi-automatisk billedanalyse udføres ved hjælp af in-house MATLAB kode, som giver mulighed for hurtigere og mere effektiv samling af store datamængder. Platformen letter præcise, samtidig måling af talrige spheroids/invaderer celler i en tid-effektive måde, medium throughput screening af anti-invasion narkotika.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6 Micro-well Glass Bottom Plates with 14 mm micro-well #1.5 cover glass</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>P06-14-1.5-N</td>
			<td>Commercial glass bottom plates which are used for HMCA embossing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Low Melting Point Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520100</td>
			<td>A solution of 6% agarose is warmed up to 80&#176;C before use, a solution of 1% agarose is warmed to 37&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA solution B</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-052-1A</td>
			<td>Warmed to 37&#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM medium, high glucose</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>01-055-1A</td>
			<td>Warmed to 37&#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Special Newborn Calf Serum (NBCS)</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>04-122-1A</td>
			<td>Heat Inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (10X), no calcium, no magnesium</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>02-023-5A</td>
			<td>Kept on ice before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH, anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5881-500G</td>
			<td>Used for the preparation of 1M NaOH solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Type I collagen from rat tail, 5mg/ml</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>3440-100-01</td>
			<td>Kept on ice before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronic acid sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H5542-10MG</td>
			<td>Kept on ice before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisetin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F505-100MG</td>
			<td>Added to the culture medium, invasion inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DETA/NO</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>alx-430-014-m005</td>
			<td>Added to the culture medium, nitric oxide donor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4170</td>
			<td>Used at very low concenrtation without the need for washing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dymax 5000-EC UV flood lamp complete system with light shield &#38; Dymax 400 Watt EC power supply</td>
			<td>Dymax Corporation</td>
			<td>PN 39823</td>
			<td>Used for HMCA plate sterilization by UV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted IX81 microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Used for automatic image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator for microscope</td>
			<td>Life Imaging Services</td>
			<td></td>
			<td>Essential for time lapse experiments with image acquisition, pre adjusted to 37&#176;C, 5% CO2 and keeping a humidified atmosphere</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sub-micron motorized stage type SCAN-IM</td>
			<td>Marzhauser Wetzlar GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Used to predetermine image acquisition areas, for automatic image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14-bit, ORCA II C4742-98 cooled camera</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td></td>
			<td>Highly sensitive, used for imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent filter cube for PI detection</td>
			<td>Chroma Technology Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Filter cube specifications: excitation filter 530-550 nm, dichroic mirror 565 nm long pass and emission filter 600-660 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Olympus Cell^P operating software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Software used to control microscope, motorized stage, camera and image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab R2014B analysis software</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>Used to develop in house graphic user interface for image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel software</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Used for data management, calculation, plot creation and statistics</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of cancer cell invasion and anti-metastatic drug screening using hydrogel micro-chamber array (hmca)-based plates

Kræft metastaser er kendt for at forårsage 90% af kræft dødelighed. Metastaser er en flertrins proces, som starter med penetration/invasion af tumorceller i omkringliggende væv. Invasionen er således et afgørende skridt i metastase, gør invasion proces forskning og udvikling af anti-metastatisk narkotika, meget sigende. For at løse dette krav, der er behov for at udvikle 3D in vitro- modeller, der imiterer arkitektur af solide tumorer og deres mikromiljø tættest til i vivo staten på den ene side, men på samme tid være reproducerbare, robust og velegnet til højt udbytte og høj indhold målinger. I øjeblikket, de fleste invasion assays lean på sofistikeret mikrofluid teknologier, som er passende for forskning, men ikke for høj lydstyrke stof screening. Andre assays ved hjælp af plade-baserede enheder med isolerede enkelte spheroids i hver brønd er materiale forbruger og har lav stikprøvestørrelse pr. betingelse. Målet med den nuværende protokol er at give en simpel og reproducerbar biomimetiske 3D celle-baseret system til analyse af invasion kapacitet i store bestande af tumor spheroids. Vi udviklede en 3D model for invasion analysen baseret på HMCA imaging plade for forskning af tumor invasion og anti-metastatisk drug discovery. Denne enhed gør det muligt for produktion af talrige ensartet spheroids pr. brønd (høj stikprøvestørrelse pr. betingelse) omgivet af ECM komponenter, mens løbende og samtidig observere og måle spheroids på ét element opløsning til mellemstore throughput screening af anti-metastatisk narkotika. Denne platform er præsenteret her af produktionen af HeLa og MCF7 spheroids for eksemplificere enkelt celle og kollektive invasion. Vi sammenligner indflydelse af ECM komponent hyaluronsyre (HA) på kollagen omkring HeLa spheroids invasive kapacitet. Endelig, vi introducere Fisetin (invasion hæmmer) til HeLa spheroids og nitrogenoxid (NO) (invasion aktivator) til MCF7 spheroids. Resultaterne er analyseret af in-house software, som gør det muligt for semi-automatiske, enkel og hurtig analyse, som letter multi-parameter undersøgelse.

Den unikke HMCA imaging plade bruges til invasion analysen af 3D tumor spheroids. Hele analysen, begynder med den sfæroide dannelse og slutter med invasion proces og yderligere manipulationer, der udføres inden for den samme plade. For klumpformet dannelse, HeLa celler er indlæst i array-bassinet og bosætte sig i hydrogel MCs af tyngdekraften. Hydrogel MCs, som har egenskaber, ikke-tilhænger/lav vedhæftet fil, lette celle-celle interaktion og dannelsen af 3D tumor spheroids. <strong...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array HMCA-based Plates at JoVE.com

Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array HMCA-based Plates

En HMCA-baseret tænkelig plade præsenteres for invasion assay ydeevne. Denne plade letter dannelsen af tre-dimensionelle (3D) tumor spheroids og måling af kræft celle invasion i den ekstracellulære matrix (ECM). Invasion assay kvantificering opnås ved halvautomatiske analyse.

Analyse af kræft celle Invasion og anti-metastatisk stof Screening ved hjælp af Hydrogel mikro-kammer Array (HMCA)-baseret plader

Cancer metastasis is known to cause 90% of cancer lethality. Metastasis is a multistage process which initiates with the penetration/invasion of tumor ...

Målet med denne enkle reproducerbare biomimetiske 3D-celle-baserede system er at lette invasion kapacitet analyse i store population af tumor sfæroid for anti-metastatisk lægemiddel screening. Den største fordel ved vores hydrogel mikro-kammer array er, at det giver mulighed for produktion af et stort antal ensartede sfæroider, der befolker det samme brændplan per brønd. Den sfæriske position bevares på grund af hydrogel mikrokammer array struktur selv efter ekstracellulære matrix tilføjelse, lette den nøjagtige løbende overvågning af sfæroider og invasionsprocessen.Endvidere kan den morfologiske karakterisering og fluorescerende farvning af talrige sfæroider og invaderende celler udføres in situ og analyseres på en tidseffektiv måde. Demonstration af hydrogel mikro-kammer array seks-brønd billedplade produktion procedure vil være Maria Sobolev fra vores laboratorium. For at forberede hydrogel mikro-kammer array plader, første forvarm seks polydimethylsiloxan, eller PDMS, frimærker til 70 grader Celsius, og placere en seks-godt, glasbund plade på et tørt bad forvarmet til 75 grader Celsius i flere minutter.Når pladen er varm, hæld en 400-microliter dråbe forvarmet lavsmeltende agarose på bunden af hver brønd af de seks-brønd plade, og forsigtigt placere et stempel over hver dråbe. Lad opsætningen køle af i fem til 10 minutter ved stuetemperatur, efterfulgt af 20 minutter ved fire grader Celsius for fuld agarosegelé. Når agarose har størknet, forsigtigt skrælle PDMS fra hver brønd, forlader agarose geler mønstret med mikro-kamre.Når UV-lampen er blevet nået, skal den prægede plade i lyshærdningssystemet være placeret i tre minutter, og de UV-steriliserede makrobæde med sterile PBS fyldes. Derefter dække pladen, og pak det med Parafilm for fire grader Celsius opbevaring indtil brug. For at indlæse cellerne skal du fjerne PBS fra hver brønd og forsigtigt indlæse 50 mikroliter af de celler, der er af interesse, oven på hvert hydrogelarray.Efter at have ladet cellerne til at bosætte sig ved tyngdekraften i 15 minutter, forsigtigt tilføje seks til otte aliquots af 500 mikroliter af frisk medium til kanten af makro-godt plast bund uden for ringen og hydrogel array. Inkuber cellerne i den rette periode ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid med fugtighed til dannelse af sfæroider. Derefter overføres sfæroiderne til en biosikkerhedshætte på is i 10 minutter.Når pladen er afkølet, læn dig en pipettespids på kanten af den makro-brønd plastbund ved siden af hydrogelarrayen, og fjern hele mediet fra omkring arrayet. Fjern derefter mediet fra array tanken, læn dig en gel-loading pipettespids på kanten af arraytanken meget omhyggeligt, idet du passe på ikke at forstyrre mikrokamrene og sfæroiderne. Dernæst skal du bruge en forfrosset, fin pipette spids til at tilføje to aliquots af 150 mikroliter af kollagen blanding af interesse på kanten af array en ad gangen, frigive blandingen langsomt for at undgå sfæroid dislokation.Efter den anden runde af kollagen er blevet tilføjet til hver brønd, returnere sfæroider til inkubatoren i en time for fuld gelering af den ekstracellulære matrix. Når matrixen er størknet, tilsættes 400 mikroliter af forvarmte 1% lavsmeltende agarose oven på gelen, og inkubere pladen, dækket ved stuetemperatur, i fem til syv minutter, før afkøling i to minutter ved fire grader Celsius for agarose gelation. Derefter hælder pipetten på kanten af den makro-godt plast bund, tilsæt forsigtigt to milliliter komplet medium til hver brønd.For at udføre en invasion assay, indlæse hydrogel mikro-kammer array plade på en motoriseret omvendt mikroskop fase udstyret med en 37-graders Celsius og 5% kuldioxid inkubator med en befugtet atmosfære, og bruge en fire eller 10x mål at pre-bestemme positioner for billedet erhvervelse i hver brønd, således at hele array området vil blive vurderet. Derefter erhverve lyse-felt billeder hver to til fire timer i alt 24 til 72 timer til at spore celle invasion fra sfæriske krop i den omgivende ekstracellulære matrix. I slutningen af billedopkøbet skal du eksportere time-lapse-billederne fra billedopkøbssoftwaren til lagring i et kodet billedfilformat til en dedikeret mappe.Åbn derefter den grafiske brugergrænseflade, og klik på Indlæs lyst felt. Juster segmentationsparametrene for billedet for at opnå en præcis segmentering af sfæroiderne og deres invasionsområder, og klik på Segmentation af interesseområde for at oprette en kant omkring hver sfæroid. Hvis den automatiske segmentering er forkert, skal du trykke på Slet eller Tilføj og foretage de relevante rettelser manuelt.Klik på Sporing for at nummerere sfæroiderne i hvert af time-lapse-billederne. Klik derefter på Måling for at generere et regneark med alle parametrene, og gem regnearket i et passende format til databehandling og statistisk analyse. At undersøge indflydelsen af hyaluronsyre på den spontane HeLa sfæroide invasion proces, i dette eksperiment, to-dages modnet sfæroider blev dækket med kollagen og hyaluronsyre blanding løsning og sammenlignet med to-dages modnet sfæroider dækket med kollagen løsning alene.Efter 50 timers inkubation viste sfæroiderne indlejret i kollagen og hyaluronsyre en lavere cellespredning i den omgivende ekstracellulære matrix sammenlignet med sfærerne indlejret i kollagen alene. Faktisk, analyse af invasionen område kinetik over tid for 99 sfæroide ved single-sfæroide opløsning viser klart, at tilsætning af hyaluronsyre til kollagen hæmmer celle dispersion ud af sfæroide, hvilket resulterer i mindre invasion områder. Behandling af HeLa spheroid kultur med en bioaktiv flavonoid med cyto-og migrastatiske egenskaber i 24 timer resulterer i en hæmmet celle dispersion omkring sfæroider sammenlignet med ikke-behandlede HeLa sfæroider.Faktisk viste analyse af invasionsområderne på 488 sfæroider i slutningen af forsøget en betydelig hæmning efter behandling med så lidt som 10 mikromolar af lægemidlet. På grund af den lave vedhæftet fil karakteristisk for hydrogel, denne mikro-kammer-baserede teknologi lette dannelsen af sfæroid selv i tilfælde af meget få celler. Dette er især fordel i værdifulde begrænset kræft stamceller-lignende eller patient-afledte primære celleprøver.Hydrogel mikro-kammer billeddannelse plade giver mulighed for analyse af den nøjagtige rumlige placering af sfæroider under langsigtede eksperimenter til evaluering af invasionsprocessen på enkelt-element niveau og giver en høj grad af statistisk robusthed og nøjagtighed. Fremtidige anvendelser af denne metode omfatter side-by-side multi-celle dyrkning af tumor og stromale celler i forskellige regioner inden for makro-godt og hentning af individuelle sfæroider til downstream molekylær analyse.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array (HMCA)-based Plates

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

Ved hjælp af Functional Genomics Screening at identificere potentielt nyt lægemiddel mod cancer Cell sfæroide Cultures

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

A Model for Perineural Invasion in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

En model for perineurale invasion i hoved og hals pladecellecarcinom

Perineural invasion (PNI) is found in approximately 40% of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC). Despite multimodal treatment with surgery, ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Generation af høj overførselshastighed tredimensionale Tumor Spheroids for narkotika-Screening

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Live-celle Imaging Assays til undersøgelse glioblastom hjerne Tumor stamcelle Migration og Invasion

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

3-D Cell Culture System for Studying Invasion and Evaluating Therapeutics in Bladder Cancer

3D-celle kultur System for at studere Invasion og evaluere Therapeutics i blærekræft

Bladder cancer is a significant health problem. It is estimated that more than 16,000 people will die this year in the United States from bladder cancer. ...

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

En simpel Migration/Invasion arbejdsgang ved hjælp af en automatiseret Live-celle Imager

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Drug Screening af primære patient afledt tumor xenografts i Zebrafish

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

Impedance-based Real-time Measurement of Cancer Cell Migration and Invasion

Impedans-baseret Real-time Måling af Kræft Cell Migration og Invasion

Cancer arises due to uncontrolled proliferation of cells initiated by genetic instability, mutations, and environmental and other stress factors. These ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Evaluering cell død ved hjælp af cellefri supernatant af probiotika i tre-dimensionelle sfæroid kulturer colorectal cancerceller

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

Overvågning af kræftcelleinvasion og T-cellecytotoksicitet i 3D-kultur

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...