Name: analysis of cancer cell invasion and anti-metastatic drug screening using hydrogel micro-chamber array (hmca)-based plates
Uploaded: 2018-10-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array HMCA-based Plates at JoVE.com

Dit werk wordt ondersteund door het legaat van Moshe Shimon en Judith Weisbrodt.

1. HMCA plaat preegdruk
Opmerking: Het volledige proces voor het ontwerp en de fabricage van Polydimethylsiloxaan (PDMS) stempel en imaging plaat HMCA gebruikt in dit protocol wordt gedetailleerd beschreven in onze eerdere artikelen15,16. Het PDMS stempel (negatieve vorm) wordt gebruikt om het reliëf van de HMCA (positieve vorm), die uit ongeveer 450 MCs per putje (figuur 1A bestaat). Zoals aangetoond in <s...

<ol>
	<li>Guan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+metastases:+challenges+and+opportunities.">Cancer metastases: challenges and opportunities.</a> Acta pharmaceutica Sinica. B. 5 (5), 402-418 (2015).</li><li>Sapudom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phenotype+of+cancer+cell+invasion+controlled+by+fibril+diameter+and+pore+size+of+3D+collagen+networks.">The phenotype of cancer cell invasion controlled by fibril diameter and pore size of 3D collagen networks.</a> Biomaterials. 52, 367-375 (2015).</li><li>Portillo-Lara, R., Annabi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microengineered+cancer-on-a-chip+platforms+to+study+the+metastatic+microenvironment.">Microengineered cancer-on-a-chip platforms to study the metastatic microenvironment.</a> Lab on a chip. 16 (21), 4063-4081 (2016).</li><li>Gkountela, S., Aceto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem-like+features+of+cancer+cells+on+their+way+to+metastasis.">Stem-like features of cancer cells on their way to metastasis.</a> Biology Direct. 11 (1), 33 (2016).</li><li>Kramer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+cell+migration+and+invasion+assays.">In vitro cell migration and invasion assays.</a> Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 752 (1), 10-24 (2013).</li><li>Guzman, A., S&#225;nchez Alemany, V., Nguyen, Y., Zhang, C. R., Kaufman, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+3D+in+vitro+metastasis+model+elucidates+differential+invasive+strategies+during+and+after+breaching+basement+membrane.">A novel 3D in vitro metastasis model elucidates differential invasive strategies during and after breaching basement membrane.</a> Biomaterials. 115, 19-29 (2017).</li><li>Lee, E., Song, H. -. H. G., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+on-a-chip+platforms+for+studying+cancer+metastasis.">Biomimetic on-a-chip platforms for studying cancer metastasis.</a> Current opinion in chemical engineering. 11, 20-27 (2016).</li><li>Mittler, F., Obe&#239;d, P., Rulina, A. V., Haguet, V., Gidrol, X., Balakirev, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Content+Monitoring+of+Drug+Effects+in+a+3D+Spheroid+Model.">High-Content Monitoring of Drug Effects in a 3D Spheroid Model.</a> Frontiers in Oncology. 7, 293 (2017).</li><li>Evensen, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+High-Throughput+Three-Dimensional+Invasion+Assay+for+Anti-Cancer+Drug+Discovery.">Development of a High-Throughput Three-Dimensional Invasion Assay for Anti-Cancer Drug Discovery.</a> PLoS ONE. 8 (12), e82811 (2013).</li><li>Aw Yong, K. M., Li, Z., Merajver, S. D., Fu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+tumor+invasion+front+using+long-term+fluidic+tumoroid+culture.">Tracking the tumor invasion front using long-term fluidic tumoroid culture.</a> Scientific Reports. 7 (1), 10784 (2017).</li><li>Mi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+co-culture+system+for+cancer+migratory+analysis+and+anti-metastatic+drugs+screening.">Microfluidic co-culture system for cancer migratory analysis and anti-metastatic drugs screening.</a> Scientific Reports. 6 (1), 35544 (2016).</li><li>Chung, S., Sudo, R., Mack, P. J., Wan, C. -. R., Vickerman, V., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+into+scaffolds+under+co-culture+conditions+in+a+microfluidic+platform.">Cell migration into scaffolds under co-culture conditions in a microfluidic platform.</a> Lab on a chip. 9 (2), 269-275 (2009).</li><li>Krakhmal, N. V., Zavyalova, M. V., Denisov, E. V., Vtorushin, S. V., Perelmuter, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+Invasion:+Patterns+and+Mechanisms.">Cancer Invasion: Patterns and Mechanisms.</a> Acta naturae. 7 (2), 17-28 (2015).</li><li>Lintz, M., Mu&#241;oz, A., Reinhart-King, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mechanics+of+Single+Cell+and+Collective+Migration+of+Tumor+Cells.">The Mechanics of Single Cell and Collective Migration of Tumor Cells.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 139 (2), 21005 (2017).</li><li>Afrimzon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogel+microstructure+live-cell+array+for+multiplexed+analyses+of+cancer+stem+cells,+tumor+heterogeneity+and+differential+drug+response+at+single-element+resolution.">Hydrogel microstructure live-cell array for multiplexed analyses of cancer stem cells, tumor heterogeneity and differential drug response at single-element resolution.</a> Lab on a Chip. 16 (6), 1047-1062 (2016).</li><li>Shafran, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+is+cytoprotective+to+breast+cancer+spheroids+vulnerable+to+estrogen-induced+apoptosis.">Nitric oxide is cytoprotective to breast cancer spheroids vulnerable to estrogen-induced apoptosis.</a> Oncotarget. 8 (65), 108890-108911 (2017).</li><li>Sato, H., Idiris, A., Miwa, T., Kumagai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabric+Vessels+for+Embryoid+Body+Formation+and+Rapid+Differentiation+of+Pluripotent+Stem+Cells.">Microfabric Vessels for Embryoid Body Formation and Rapid Differentiation of Pluripotent Stem Cells.</a> Scientific Reports. 6 (1), 31063 (2016).</li><li>Lee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gravity-oriented+microfluidic+device+for+uniform+and+massive+cell+spheroid+formation.">Gravity-oriented microfluidic device for uniform and massive cell spheroid formation.</a> Biomicrofluidics. 6 (1), 14114 (2012).</li><li>Zaretsky, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+the+dynamics+of+primary+T+cell+activation+and+differentiation+using+long+term+live+cell+imaging+in+microwell+arrays.">Monitoring the dynamics of primary T cell activation and differentiation using long term live cell imaging in microwell arrays.</a> Lab on a Chip. 12 (23), 5007 (2012).</li><li>Khan, N., Syed, D. N., Ahmad, N., Mukhtar, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fisetin:+a+dietary+antioxidant+for+health+promotion.">Fisetin: a dietary antioxidant for health promotion.</a> Antioxidants &amp; redox signaling. 19 (2), 151-162 (2013).</li><li>Lee, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Networked+concave+microwell+arrays+for+constructing+3D+cell+spheroids.">Networked concave microwell arrays for constructing 3D cell spheroids.</a> Biofabrication. 10 (1), 15001 (2017).</li><li>Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+(3D)+tumor+spheroid+invasion+assay.">Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (99), e52686 (2015).</li><li>Toh, Y. -. C., Raja, A., Yu, H., van Noort, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+Microfluidic+Model+to+Recapitulate+Cancer+Cell+Migration+and+Invasion.">A 3D Microfluidic Model to Recapitulate Cancer Cell Migration and Invasion.</a> Bioengineering. 5 (2), 29 (2018).</li><li>Sugimoto, M., Kitagawa, Y., Yamada, M., Yajima, Y., Utoh, R., Seki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropassage-embedding+composite+hydrogel+fibers+enable+quantitative+evaluation+of+cancer+cell+invasion+under+3D+coculture+conditions.">Micropassage-embedding composite hydrogel fibers enable quantitative evaluation of cancer cell invasion under 3D coculture conditions.</a> Lab on a Chip. 18 (9), 1378-1387 (2018).</li><li>Yamamoto, S., Hotta, M. M., Okochi, M., Honda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Vascular+Formed+Endothelial+Cell+Network+on+the+Invasive+Capacity+of+Melanoma+Using+the+In+Vitro+3D+Co-Culture+Patterning+Model.">Effect of Vascular Formed Endothelial Cell Network on the Invasive Capacity of Melanoma Using the In Vitro 3D Co-Culture Patterning Model.</a> PLoS ONE. 9 (7), e103502 (2014).</li><li>Lee, S. -. H., Moon, J. J., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+micropatterning+of+bioactive+hydrogels+via+two-photon+laser+scanning+photolithography+for+guided+3D+cell+migration.">Three-dimensional micropatterning of bioactive hydrogels via two-photon laser scanning photolithography for guided 3D cell migration.</a> Biomaterials. 29 (20), 2962-2968 (2008).</li><li>Gschwind, A., Zwick, E., Prenzel, N., Leserer, M., Ullrich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+communication+networks:+epidermal+growth+factor+receptor+transactivation+as+the+paradigm+for+interreceptor+signal+transmission.">Cell communication networks: epidermal growth factor receptor transactivation as the paradigm for interreceptor signal transmission.</a> Oncogene. 20 (13), 1594-1600 (2001).</li><li>Jiang, K., Dong, C., Xu, Y., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic-based+biomimetic+models+for+life+science+research.">Microfluidic-based biomimetic models for life science research.</a> RSC Advances. 6 (32), 26863-26873 (2016).</li><li>Mason, B. N., Starchenko, A., Williams, R. M., Bonassar, L. J., Reinhart-King, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+three-dimensional+collagen+matrix+stiffness+independently+of+collagen+concentration+modulates+endothelial+cell+behavior.">Tuning three-dimensional collagen matrix stiffness independently of collagen concentration modulates endothelial cell behavior.</a> Acta biomaterialia. 9 (1), 4635-4644 (2013).</li><li>Raub, C. B., Putnam, A. J., Tromberg, B. J., George, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+bulk+mechanical+properties+of+cellularized+collagen+gels+using+multiphoton+microscopy.">Predicting bulk mechanical properties of cellularized collagen gels using multiphoton microscopy.</a> Acta Biomaterialia. 6 (12), 4657-4665 (2010).</li><li>Paszek, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype.">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).</li><li>Rao, S. S., DeJesus, J., Short, A. R., Otero, J. J., Sarkar, A., Winter, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+Behaviors+in+Three-Dimensional+Collagen-Hyaluronan+Composite+Hydrogels.">Glioblastoma Behaviors in Three-Dimensional Collagen-Hyaluronan Composite Hydrogels.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 5 (19), 9276-9284 (2013).</li><li>Kreger, S. T., Voytik-Harbin, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronan+concentration+within+a+3D+collagen+matrix+modulates+matrix+viscoelasticity,+but+not+fibroblast+response.">Hyaluronan concentration within a 3D collagen matrix modulates matrix viscoelasticity, but not fibroblast response.</a> Matrix Biology. 28 (6), 336-346 (2009).</li><li>Chanmee, T., Ontong, P., Itano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronan:+A+modulator+of+the+tumor+microenvironment.">Hyaluronan: A modulator of the tumor microenvironment.</a> Cancer Letters. 375 (1), 20-30 (2016).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+Three-Dimensional+Microenvironment+with+Hyaluronan+of+Different+Molecular+Weights+Alters+Breast+Cancer+Cell+Invasion+Behavior.">Modulating Three-Dimensional Microenvironment with Hyaluronan of Different Molecular Weights Alters Breast Cancer Cell Invasion Behavior.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 9 (11), 9327-9338 (2017).</li><li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+role+of+low+molecular+weight+hyaluronan+in+breast+cancer+metastasis.">A novel role of low molecular weight hyaluronan in breast cancer metastasis.</a> The FASEB Journal. 29 (4), 1290-1298 (2015).</li><li>Fisher, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+resistance,+high+molecular+weight+hyaluronic+acid,+and+longevity.">Cancer resistance, high molecular weight hyaluronic acid, and longevity.</a> Journal of cell communication and signaling. 9 (1), 91-92 (2015).</li></ol>

Het is goed gedocumenteerd zijn levende organismen, gekenmerkt door hun complexe 3D meercellige organisatie duidelijk onderscheiden van de meest gebruikte 2D enkelgelaagde gekweekte cellen, nadruk op de cruciale noodzaak om cellulaire modellen die beter na te de functies bootsen en processen van levend materiaal voor drug screening. Meercellige spheroïden, organotypic culturen, organoids en organen-on-a-chip hebben onlangs geïntroduceerde8 voor het gebruik in gestandaardiseerde drugontdekking. G...

Kanker overlijden wordt toegeschreven voornamelijk aan de verspreiding van uitgezaaide cellen naar verre locaties. Vele inspanningen in de behandeling van kanker geconcentreerd op targeting of preventie van de vorming van metastatische kolonies en progressie van systemische gemetastaseerde ziekte1. Kanker cel migratie is een cruciale stap in het proces van tumor metastase, het onderzoek van de kanker invasie cascade is dus erg belangrijk en een voorwaarde voor het vinden van de anti-metastatische therapeutics.
Het gebruik van dierlijke modellen als instrumenten voor het bestuderen van gemetastaseerde ziekte is erg duur en niet altijd representatief voor de tumor bij de mens gevonden. Bovendien, de extracellulaire communicatie topologie, de mechanica en de samenstelling sterk van invloed op kanker cel gedrag2. Aangezien in vivo modellen is inherent gebrek aan de mogelijkheid om te scheiden en beheren van dergelijke specifieke parameters die aan kanker invasie en metastase bijdragen, is er behoefte aan een beheersbare biomimetische in vitro modellen.
Om het metastaseren tot verre organen, moeten de kankercellen trekkende en invasieve fenotypische eigenschappen die kunnen worden gericht voor therapie vertonen. Aangezien de meeste in vitro kanker modellen niet de feitelijke kenmerken van solide tumoren3nabootsen doen, is het echter zeer uitdagend om te detecteren fysiologisch relevante fenotypen. Bovendien, dicteert de fenotypische heterogeniteit die bestaat binnen de tumor, de noodzaak voor het analyseren van de tumor migratie op één element resolutie om te ontdekken fenotype gerichte therapieën, bijvoorbeeld door zich te richten de cel metastase-Inleiding bevolking binnen heterogene tumoren4.
De studie van de beweeglijkheid van de cel en collectieve migratie is voornamelijk uitgevoerd in enkelgelaagde culturen van epitheliale cellen op homogene vlakke oppervlakken. Deze conventionele cellulaire modellen voor kanker cel migratie zijn gebaseerd op de analyse van de bevolking van afzonderlijke cellen invasie door de membranen en ECM componenten5, maar in dergelijke systemen, de intrinsieke verschillen tussen afzonderlijke cellen kunnen niet studeerde. Genereren 3D spheroïden, hetzij via steigers of steiger-gratis micro-structuren is beschouwd als een superieure betekent om te studeren van de tumor cel groei en kanker invasie6,7,8. Echter meest 3D systemen zijn niet geschikt voor hoge doorvoer formaten, en inter sferoïde interactie meestal niet worden bereikt aangezien geïsoleerde individuele spheroïden worden gegenereerd in elk micro-well9. Recente studies met betrekking tot de migratie van kanker zijn gebaseerd op microfluidic apparaten3,10,11,12, echter deze verfijnde microfluidic tools zijn moeilijk te produceren en kan niet voor hoge throughput screening (HTS) van anti-invasieve drugs worden gebruikt.
Twee belangrijkste fenotypen, collectieve en individuele cel migratie, die een rol spelen bij de tumorcellen het overwinnen van de ECM-barrière en invasie van naburige weefsel, hebben aangetoond dat13,14, elke weergave van verschillende morfologische kenmerken, genetische, biochemische en moleculaire mechanismen. Daarnaast zijn twee vormen van migratie tumorcellen, fibroblast-achtige en Wortelpotigen, waargenomen in elke fenotype. Aangezien beide invasie fenotypes en migratie modi, voornamelijk door morfologische eigenschappen worden gedefinieerd, er is behoefte aan een mobiele modellen die inschakelen imaging gebaseerde detectie en behandeling van alle vormen van de invasie van de tumor en het migreren van cellen.
Het algemene doel van de huidige methode is bedoeld als een eenvoudige en reproduceerbare biomimetische 3D in vitro cel-gebaseerde systeem voor de analyse van de capaciteit van de invasie in grote populaties van de tumor spheroïden. Hier introduceren we de HMCA gebaseerde 6-well imaging plaat voor het onderzoek van de invasie van de tumor en anti-metastatische therapie. De technologie maakt de vorming van grote aantallen van uniforme 3D tumor spheroïden (450 per putje) in een hydrogel micro-kamers (MC) structuur. Verschillende onderdelen van de ECM zijn toegevoegd aan de matrix sferoïde om de invasie van de cellen in de omgeving. Invasie proces wordt voortdurend gecontroleerd door korte - en lange termijn waarneming van dezelfde individuele spheroïden/invasie cellen en vergemakkelijkt Morfologische karakterisering, fluorescerende vlekken en het ophalen van specifieke spheroïden op elk gewenst moment. Aangezien talrijke spheroïden ruimte en medium delen, is interactie via oplosbare moleculen tussen individuele spheroïden en hun invloed op elkaar mogelijk. Semi-automatische beeldanalyse wordt uitgevoerd met behulp van in-house MATLAB-code waarmee de snellere en meer efficiënte verzameling van grote hoeveelheden gegevens. Het platform vergemakkelijkt nauwkeurige, gelijktijdige meting van talrijke invasie van spheroïden/cellen in een tijd-efficiënte manier, waardoor middellange throughput screening van anti-invasie drugs.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6 Micro-well Glass Bottom Plates with 14 mm micro-well #1.5 cover glass</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>P06-14-1.5-N</td>
			<td>Commercial glass bottom plates which are used for HMCA embossing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Low Melting Point Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520100</td>
			<td>A solution of 6% agarose is warmed up to 80&#176;C before use, a solution of 1% agarose is warmed to 37&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA solution B</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-052-1A</td>
			<td>Warmed to 37&#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM medium, high glucose</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>01-055-1A</td>
			<td>Warmed to 37&#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Special Newborn Calf Serum (NBCS)</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>04-122-1A</td>
			<td>Heat Inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (10X), no calcium, no magnesium</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>02-023-5A</td>
			<td>Kept on ice before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH, anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5881-500G</td>
			<td>Used for the preparation of 1M NaOH solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Type I collagen from rat tail, 5mg/ml</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>3440-100-01</td>
			<td>Kept on ice before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronic acid sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H5542-10MG</td>
			<td>Kept on ice before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisetin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F505-100MG</td>
			<td>Added to the culture medium, invasion inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DETA/NO</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>alx-430-014-m005</td>
			<td>Added to the culture medium, nitric oxide donor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4170</td>
			<td>Used at very low concenrtation without the need for washing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dymax 5000-EC UV flood lamp complete system with light shield &#38; Dymax 400 Watt EC power supply</td>
			<td>Dymax Corporation</td>
			<td>PN 39823</td>
			<td>Used for HMCA plate sterilization by UV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted IX81 microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Used for automatic image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator for microscope</td>
			<td>Life Imaging Services</td>
			<td></td>
			<td>Essential for time lapse experiments with image acquisition, pre adjusted to 37&#176;C, 5% CO2 and keeping a humidified atmosphere</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sub-micron motorized stage type SCAN-IM</td>
			<td>Marzhauser Wetzlar GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Used to predetermine image acquisition areas, for automatic image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14-bit, ORCA II C4742-98 cooled camera</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td></td>
			<td>Highly sensitive, used for imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent filter cube for PI detection</td>
			<td>Chroma Technology Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Filter cube specifications: excitation filter 530-550 nm, dichroic mirror 565 nm long pass and emission filter 600-660 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Olympus Cell^P operating software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Software used to control microscope, motorized stage, camera and image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab R2014B analysis software</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>Used to develop in house graphic user interface for image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel software</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Used for data management, calculation, plot creation and statistics</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of cancer cell invasion and anti-metastatic drug screening using hydrogel micro-chamber array (hmca)-based plates

Uitzaaiing van kanker is bekend dat het veroorzaken van 90% van kanker letaliteit. Metastase is een meertraps proces dat met de penetratie/invasie van tumorcellen in naburige weefsel start. Invasie is dus een cruciale stap in de metastase, waardoor de invasie proces onderzoek en de ontwikkeling van anti-metastatische drugs, veelbetekenend. Om aan deze vraag, er is een noodzaak om 3D in vitro modellen die imiteren van de architectuur van solide tumoren te ontwikkelen en hun communicatie nauwst aan in vivo staat aan de ene kant, maar op hetzelfde moment worden gereproduceerd, robuust en geschikt voor hoge opbrengst en hoog inhoud metingen. Op dit moment de meeste invasie testen leunen op geavanceerde microfluidic-technologieën die geschikt zijn voor onderzoek, maar niet voor hoog volume drug screening. Andere plaat-gebaseerde apparaten met geïsoleerde individuele spheroïden in elk putje testen zijn materiaal consumeren en lage steekproefgrootte per voorwaarde. Het doel van het huidige protocol is bedoeld als een eenvoudige en reproduceerbare biomimetische 3D cel-gebaseerde systeem voor de analyse van de capaciteit van de invasie in grote populaties van de tumor spheroïden. We ontwikkelden een 3D-model voor invasie assay gebaseerd op HMCA imaging plaat voor het onderzoek van de invasie van de tumor en anti-metastatische drugontdekking. Dit apparaat maakt de productie van talrijke uniforme spheroïden per putje (hoge steekproefgrootte per voorwaarde) omgeven door ECM-onderdelen, terwijl tegelijkertijd en continu observeren en meten van de spheroïden met één element voor medium resolutie throughput screening van anti-metastatische drugs. Dit platform wordt hier gepresenteerd door de productie van HeLa en MCF7 spheroïden voor het voorbeeldig voor eencellige en collectieve invasie. We vergelijken de invloed van de ECM component hyaluronzuur (HA) op de invasieve capaciteit van collageen rondom HeLa spheroïden. Tot slot, we kennismaken met Fisetin (invasie remmer) HeLa spheroïden en stikstofmonoxide (NO) (invasie activator) naar MCF7 spheroïden. De resultaten worden geanalyseerd door interne software waarmee semi-automatische, eenvoudige en snelle analyse die Multi-parameter onderzoek vergemakkelijkt.

De unieke HMCA imaging plaat wordt gebruikt voor de bepaling van de invasie van de 3D tumor spheroïden. De gehele assay, begint met de vorming van sferoïde en eindigt met het proces van de invasie en de extra manipulaties, wordt uitgevoerd binnen de dezelfde plaat. Voor de vorming van sferoïde, HeLa cellen zijn geladen in het bekken van de matrix en vestigen in de hydrogel MCs door de zwaartekracht. De hydrogel MCs, die hebben niet-aanhanger/lage bijlage kenmerken, faciliteren van de i...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array HMCA-based Plates at JoVE.com

Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array HMCA-based Plates

Een HMCA gebaseerde imaging plaat wordt gepresenteerd voor invasie assay prestaties. Deze plaat vergemakkelijkt de vorming van driedimensionale (3D) tumor spheroïden en het meten van kanker cel invasie in de extracellulaire matrix (ECM). De invasie assay kwantificering wordt bereikt door semi-automatische analyse.

Analyse van kanker cel invasie en anti-metastatische Drug Screening met behulp van Hydrogel Micro-kamer Array (HMCA)-op basis van platen

Cancer metastasis is known to cause 90% of cancer lethality. Metastasis is a multistage process which initiates with the penetration/invasion of tumor ...

Het doel van dit eenvoudige reproduceerbare biomimetische 3D-celgebaseerde systeem is om invasiecapaciteitsanalyse te vergemakkelijken bij grote populatie tumorsferoïde voor anti-gemetastaseerde geneesmiddelenscreening. Het belangrijkste voordeel van onze hydrogel micro-kamer array is dat het mogelijk maakt de productie van een groot aantal uniforme sferoïden die hetzelfde brandpuntsvlak per goed bevolken. De sferoïde positie blijft behouden als gevolg van de hydrogel micro-kamer array structuur, zelfs na extracellulaire matrix toevoeging, het vergemakkelijken van de nauwkeurige continue monitoring van de sferoïden en het invasieproces.Verder kan de morfologische karakterisering en fluorescerende kleuring van talrijke sferoïden en binnenvallende cellen ter plaatse worden uitgevoerd en op een tijdefficiënte manier met één element worden geanalyseerd. Het aantonen van de hydrogel micro-kamer array zes-goed beeldplaat productie procedure zal Maria Sobolev uit ons laboratorium. Ter voorbereiding van de hydrogel micro-kamer array platen, eerst voorverwarmen zes polydimethylsiloxaan, of PDMS, stempels tot 70 graden Celsius, en plaats een zes-goed, glazen bodem plaat op een droog bad voorverwarmd tot 75 graden Celsius gedurende enkele minuten.Wanneer de plaat warm is, giet een 400-microliter druppel van voorverwarmde laag-smeltende agarose op de bodem van elke put van de zes-put plaat, en voorzichtig plaats een stempel over elke druppel. Laat de setup vijf tot tien minuten afkoelen bij kamertemperatuur, gevolgd door 20 minuten bij vier graden Celsius voor volledige agarose gelatie. Wanneer de agarose is gestold, voorzichtig afpellen van de PDMS van elke put, waardoor de agarose gels patroon met micro-kamers.Nadat u de UV-lamp de hoogste intensiteit heeft laten bereiken, plaatst u de reliëfplaat gedurende drie minuten in het lichtverhardingssysteem en vult u de UV-gesteriliseerde macro-putten met steriele PBS. Bedek vervolgens de plaat en wikkel deze met Parafilm voor de opslag van vier graden Celsius tot gebruik. Om de cellen te laden, verwijder de PBS uit elke put, en voorzichtig laden 50 microliter van de cellen van belang op de top van elke hydrogel array.Na het toestaan van de cellen te vestigen door de zwaartekracht voor 15 minuten, zorgvuldig toe te voegen zes tot acht aliquots van 500 microliter van vers medium aan de rand van de macro-goed plastic bodem buiten de ring en hydrogel array. Incubeer de cellen voor de juiste periode bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide met vochtigheid voor de vorming van sferoïden. Breng de sferoïden vervolgens gedurende 10 minuten over in een bioveiligheidskap op ijs.Wanneer de plaat is afgekoeld, leun een pipet tip op de rand van de macro-well plastic bodem naast de hydrogel array, en verwijder al het medium uit de hele array. Verwijder vervolgens het medium uit de arraytank, leun een gel-loading pipet tip aan de rand van de array tank zeer zorgvuldig, oppassen niet te verstoren de micro-kamers en sferoïden. Gebruik vervolgens een voorgevroren, fijne pipettip om twee aliquots van 150 microliter van het collageenmengsel van belang aan de rand van de array één voor één toe te voegen, waardoor het mengsel langzaam wordt vrijgegeven om sferoïde dislocatie te voorkomen.Nadat de tweede ronde collageen aan elke put is toegevoegd, geven ze de sferoïden een uur terug naar de couveuse voor volledige gelatie van de extracellulaire matrix. Wanneer de matrix is gestold, voeg 400 microliter voorverwarmde 1%laag smeltende agarose op de top van de gel, en incubeer de plaat, bedekt bij kamertemperatuur, gedurende vijf tot zeven minuten, voordat koeling gedurende twee minuten op vier graden Celsius voor agarose gelatie. Dan, leunend de pipet op de rand van de macro-goed plastic bodem, voorzichtig voeg twee milliliter van volledige medium aan elke put.Om een invasietest uit te voeren, laadt u de microkamerarrayplaat van hydrogel op een gemotoriseerde omgekeerde microscoopfase die is uitgerust met een 37-graden Celsius en 5% koolstofdioxide-incubator met een bevochtigde atmosfeer, en gebruik een doelstelling van vier of 10x om de posities voor de beeldverwerving in elke put vooraf te bepalen, zodat het hele arraygebied zal worden beoordeeld. Verwerf vervolgens om de twee tot vieren om de twee tot vieren om een totaal van 24 tot 72 uur om de celinvasie van het sferoïde lichaam in de omringende extracellulaire matrix te volgen. Exporteer aan het einde van de afbeeldingsverwerving de time-lapse-afbeeldingen van de software voor het verkrijgen van afbeeldingen voor het opslaan in een gelabelde afbeeldingsbestandsindeling naar een speciale map.Open vervolgens de grafische gebruikersinterface en klik op Helder veld laden. Pas de segmentatieparameters van de afbeelding aan om een nauwkeurige segmentatie van de sferoïden en hun invasiegebieden te bereiken en klik op Segmentatie van regio's om een rand rond elke sferoïde te maken. Als de automatische segmentatie onjuist is, drukt u op Delete of Toevoegen en voert u handmatig de juiste correcties aan.Klik op Bijhouden om de sferoïden in elk van de time-lapse-afbeeldingen te nummeren. Klik vervolgens op Meten om een spreadsheet met alle parameters te genereren en sla de spreadsheet op in een geschikte indeling voor gegevensverwerking en statistische analyse. Om de invloed van hyaluronzuur op het spontane HeLa sferoïde invasieproces te onderzoeken, werden in dit experiment twee dagen gerijpte sferoïden bedekt met collageen en hyaluronzuurmengseloplossing en vergeleken met tweedaagse gerijpte sferoïden die alleen met collageenoplossing waren bedekt.Na 50 uur incubatie, de sferoïden ingebed in collageen en hyaluronzuur aangetoond een lagere cel dispersie in de omringende extracellulaire matrix in vergelijking met de sferoïden ingebed in collageen alleen. Inderdaad, analyse van de invasie gebied kinetiek na verloop van tijd voor 99 sferoïden op single-spheroid resolutie geeft duidelijk aan dat de toevoeging van hyaluronzuur aan het collageen remt cel dispersie uit de sferoïde, wat resulteert in kleinere invasie gebieden. Behandeling van de HeLa sferoïde cultuur met een bioactieve flavonoïde met cyto- en migrastatische eigenschappen gedurende 24 uur resulteert in een geremde celdispersie rond de sferoïden in vergelijking met niet-behandelde HeLa-sferoïden.Inderdaad, analyse van de invasie gebieden van 488 sferoïden aan het einde van het experiment bleek een aanzienlijke remming na de behandeling met zo weinig als 10 micromolar van het geneesmiddel. Door het lage bevestigingskenmerk van de hydrogel vergemakkelijkt deze microkamergebaseerde technologie de vorming van sferoïde, zelfs in gevallen van zeer weinig cellen. Dit is vooral voordeel in waardevolle beperkte kanker stam-achtige of patiënt-afgeleide primaire cel monsters.De hydrogel micro-kamer imaging plaat maakt het mogelijk analyse van de exacte ruimtelijke locatie van de sferoïden tijdens langdurige experimenten voor de evaluatie van het invasieproces op het niveau van één element en biedt een hoge mate van statistische robuustheid en nauwkeurigheid. Toekomstige toepassingen van deze methodologie omvatten side-by-side multi-cellculuring van tumor en stromale cellen in verschillende regio's binnen de macro-put en het ophalen van individuele sferoïden voor downstream moleculaire analyse.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array (HMCA)-based Plates

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

Gebruik makend van Functional Genomics Screening om potentieel nieuwe drug targets in Cancer Cell Sferoïde Cultures Identificeer

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

A Model for Perineural Invasion in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Een Model voor perineurale invasie in hoofd en nek plaveiselcelcarcinoom

Perineural invasion (PNI) is found in approximately 40% of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC). Despite multimodal treatment with surgery, ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Generatie van High-Throughput driedimensionale Tumor spheroïden voor Drug Screening

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Live-cel Imaging tests studie Glioblastoma Brain Tumor stamcel migratie en invasie

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

3-D Cell Culture System for Studying Invasion and Evaluating Therapeutics in Bladder Cancer

3D-celcultuur voor het bestuderen van de invasie en evalueren van Therapeutics in blaaskanker

Bladder cancer is a significant health problem. It is estimated that more than 16,000 people will die this year in the United States from bladder cancer. ...

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

Een eenvoudige migratie/invasie Workflow met behulp van een geautomatiseerde Live-cel Imager

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Drug Screening van primaire patiënt afgeleid tumor Xenografts bij zebravissen

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

Impedance-based Real-time Measurement of Cancer Cell Migration and Invasion

Impedantie-gebaseerde Real-time meting van kanker cel migratie en invasie

Cancer arises due to uncontrolled proliferation of cells initiated by genetic instability, mutations, and environmental and other stress factors. These ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Celdood evalueren met celvrije supernatant van probiotica in driedimensionale sferoïde culturen van colorectale kankercellen

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

Monitoring Cancer Cell Invasion en T-Cell Cytotoxicity in 3D Cultuur

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...