Name: analysis of cancer cell invasion and anti-metastatic drug screening using hydrogel micro-chamber array (hmca)-based plates
Uploaded: 2018-10-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array HMCA-based Plates at JoVE.com

Dette arbeidet er støttet av testamentere Moshe Shimon og Judith Weisbrodt.

1. HMCA Plate relieff
Merk: Hele prosessen for design og fabrikasjon av polydimethylsiloxane (PDMS) stempel og HMCA tenkelig platen brukes i denne protokollen er beskrevet i detalj i våre tidligere artikler15,16. PDMS stempelet (negativ shape) brukes til å skrive HMCA (positiv figur) som består av ca 450 MCs per brønn (figur 1A). Som vist i figur 1B, hver av MCs har en form ...

<ol>
	<li>Guan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+metastases:+challenges+and+opportunities.">Cancer metastases: challenges and opportunities.</a> Acta pharmaceutica Sinica. B. 5 (5), 402-418 (2015).</li><li>Sapudom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phenotype+of+cancer+cell+invasion+controlled+by+fibril+diameter+and+pore+size+of+3D+collagen+networks.">The phenotype of cancer cell invasion controlled by fibril diameter and pore size of 3D collagen networks.</a> Biomaterials. 52, 367-375 (2015).</li><li>Portillo-Lara, R., Annabi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microengineered+cancer-on-a-chip+platforms+to+study+the+metastatic+microenvironment.">Microengineered cancer-on-a-chip platforms to study the metastatic microenvironment.</a> Lab on a chip. 16 (21), 4063-4081 (2016).</li><li>Gkountela, S., Aceto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem-like+features+of+cancer+cells+on+their+way+to+metastasis.">Stem-like features of cancer cells on their way to metastasis.</a> Biology Direct. 11 (1), 33 (2016).</li><li>Kramer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+cell+migration+and+invasion+assays.">In vitro cell migration and invasion assays.</a> Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 752 (1), 10-24 (2013).</li><li>Guzman, A., S&#225;nchez Alemany, V., Nguyen, Y., Zhang, C. R., Kaufman, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+3D+in+vitro+metastasis+model+elucidates+differential+invasive+strategies+during+and+after+breaching+basement+membrane.">A novel 3D in vitro metastasis model elucidates differential invasive strategies during and after breaching basement membrane.</a> Biomaterials. 115, 19-29 (2017).</li><li>Lee, E., Song, H. -. H. G., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+on-a-chip+platforms+for+studying+cancer+metastasis.">Biomimetic on-a-chip platforms for studying cancer metastasis.</a> Current opinion in chemical engineering. 11, 20-27 (2016).</li><li>Mittler, F., Obe&#239;d, P., Rulina, A. V., Haguet, V., Gidrol, X., Balakirev, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Content+Monitoring+of+Drug+Effects+in+a+3D+Spheroid+Model.">High-Content Monitoring of Drug Effects in a 3D Spheroid Model.</a> Frontiers in Oncology. 7, 293 (2017).</li><li>Evensen, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+High-Throughput+Three-Dimensional+Invasion+Assay+for+Anti-Cancer+Drug+Discovery.">Development of a High-Throughput Three-Dimensional Invasion Assay for Anti-Cancer Drug Discovery.</a> PLoS ONE. 8 (12), e82811 (2013).</li><li>Aw Yong, K. M., Li, Z., Merajver, S. D., Fu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+tumor+invasion+front+using+long-term+fluidic+tumoroid+culture.">Tracking the tumor invasion front using long-term fluidic tumoroid culture.</a> Scientific Reports. 7 (1), 10784 (2017).</li><li>Mi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+co-culture+system+for+cancer+migratory+analysis+and+anti-metastatic+drugs+screening.">Microfluidic co-culture system for cancer migratory analysis and anti-metastatic drugs screening.</a> Scientific Reports. 6 (1), 35544 (2016).</li><li>Chung, S., Sudo, R., Mack, P. J., Wan, C. -. R., Vickerman, V., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+into+scaffolds+under+co-culture+conditions+in+a+microfluidic+platform.">Cell migration into scaffolds under co-culture conditions in a microfluidic platform.</a> Lab on a chip. 9 (2), 269-275 (2009).</li><li>Krakhmal, N. V., Zavyalova, M. V., Denisov, E. V., Vtorushin, S. V., Perelmuter, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+Invasion:+Patterns+and+Mechanisms.">Cancer Invasion: Patterns and Mechanisms.</a> Acta naturae. 7 (2), 17-28 (2015).</li><li>Lintz, M., Mu&#241;oz, A., Reinhart-King, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mechanics+of+Single+Cell+and+Collective+Migration+of+Tumor+Cells.">The Mechanics of Single Cell and Collective Migration of Tumor Cells.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 139 (2), 21005 (2017).</li><li>Afrimzon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogel+microstructure+live-cell+array+for+multiplexed+analyses+of+cancer+stem+cells,+tumor+heterogeneity+and+differential+drug+response+at+single-element+resolution.">Hydrogel microstructure live-cell array for multiplexed analyses of cancer stem cells, tumor heterogeneity and differential drug response at single-element resolution.</a> Lab on a Chip. 16 (6), 1047-1062 (2016).</li><li>Shafran, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+is+cytoprotective+to+breast+cancer+spheroids+vulnerable+to+estrogen-induced+apoptosis.">Nitric oxide is cytoprotective to breast cancer spheroids vulnerable to estrogen-induced apoptosis.</a> Oncotarget. 8 (65), 108890-108911 (2017).</li><li>Sato, H., Idiris, A., Miwa, T., Kumagai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabric+Vessels+for+Embryoid+Body+Formation+and+Rapid+Differentiation+of+Pluripotent+Stem+Cells.">Microfabric Vessels for Embryoid Body Formation and Rapid Differentiation of Pluripotent Stem Cells.</a> Scientific Reports. 6 (1), 31063 (2016).</li><li>Lee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gravity-oriented+microfluidic+device+for+uniform+and+massive+cell+spheroid+formation.">Gravity-oriented microfluidic device for uniform and massive cell spheroid formation.</a> Biomicrofluidics. 6 (1), 14114 (2012).</li><li>Zaretsky, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+the+dynamics+of+primary+T+cell+activation+and+differentiation+using+long+term+live+cell+imaging+in+microwell+arrays.">Monitoring the dynamics of primary T cell activation and differentiation using long term live cell imaging in microwell arrays.</a> Lab on a Chip. 12 (23), 5007 (2012).</li><li>Khan, N., Syed, D. N., Ahmad, N., Mukhtar, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fisetin:+a+dietary+antioxidant+for+health+promotion.">Fisetin: a dietary antioxidant for health promotion.</a> Antioxidants &amp; redox signaling. 19 (2), 151-162 (2013).</li><li>Lee, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Networked+concave+microwell+arrays+for+constructing+3D+cell+spheroids.">Networked concave microwell arrays for constructing 3D cell spheroids.</a> Biofabrication. 10 (1), 15001 (2017).</li><li>Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+(3D)+tumor+spheroid+invasion+assay.">Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (99), e52686 (2015).</li><li>Toh, Y. -. C., Raja, A., Yu, H., van Noort, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+Microfluidic+Model+to+Recapitulate+Cancer+Cell+Migration+and+Invasion.">A 3D Microfluidic Model to Recapitulate Cancer Cell Migration and Invasion.</a> Bioengineering. 5 (2), 29 (2018).</li><li>Sugimoto, M., Kitagawa, Y., Yamada, M., Yajima, Y., Utoh, R., Seki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropassage-embedding+composite+hydrogel+fibers+enable+quantitative+evaluation+of+cancer+cell+invasion+under+3D+coculture+conditions.">Micropassage-embedding composite hydrogel fibers enable quantitative evaluation of cancer cell invasion under 3D coculture conditions.</a> Lab on a Chip. 18 (9), 1378-1387 (2018).</li><li>Yamamoto, S., Hotta, M. M., Okochi, M., Honda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Vascular+Formed+Endothelial+Cell+Network+on+the+Invasive+Capacity+of+Melanoma+Using+the+In+Vitro+3D+Co-Culture+Patterning+Model.">Effect of Vascular Formed Endothelial Cell Network on the Invasive Capacity of Melanoma Using the In Vitro 3D Co-Culture Patterning Model.</a> PLoS ONE. 9 (7), e103502 (2014).</li><li>Lee, S. -. H., Moon, J. J., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+micropatterning+of+bioactive+hydrogels+via+two-photon+laser+scanning+photolithography+for+guided+3D+cell+migration.">Three-dimensional micropatterning of bioactive hydrogels via two-photon laser scanning photolithography for guided 3D cell migration.</a> Biomaterials. 29 (20), 2962-2968 (2008).</li><li>Gschwind, A., Zwick, E., Prenzel, N., Leserer, M., Ullrich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+communication+networks:+epidermal+growth+factor+receptor+transactivation+as+the+paradigm+for+interreceptor+signal+transmission.">Cell communication networks: epidermal growth factor receptor transactivation as the paradigm for interreceptor signal transmission.</a> Oncogene. 20 (13), 1594-1600 (2001).</li><li>Jiang, K., Dong, C., Xu, Y., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic-based+biomimetic+models+for+life+science+research.">Microfluidic-based biomimetic models for life science research.</a> RSC Advances. 6 (32), 26863-26873 (2016).</li><li>Mason, B. N., Starchenko, A., Williams, R. M., Bonassar, L. J., Reinhart-King, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+three-dimensional+collagen+matrix+stiffness+independently+of+collagen+concentration+modulates+endothelial+cell+behavior.">Tuning three-dimensional collagen matrix stiffness independently of collagen concentration modulates endothelial cell behavior.</a> Acta biomaterialia. 9 (1), 4635-4644 (2013).</li><li>Raub, C. B., Putnam, A. J., Tromberg, B. J., George, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+bulk+mechanical+properties+of+cellularized+collagen+gels+using+multiphoton+microscopy.">Predicting bulk mechanical properties of cellularized collagen gels using multiphoton microscopy.</a> Acta Biomaterialia. 6 (12), 4657-4665 (2010).</li><li>Paszek, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype.">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).</li><li>Rao, S. S., DeJesus, J., Short, A. R., Otero, J. J., Sarkar, A., Winter, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+Behaviors+in+Three-Dimensional+Collagen-Hyaluronan+Composite+Hydrogels.">Glioblastoma Behaviors in Three-Dimensional Collagen-Hyaluronan Composite Hydrogels.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 5 (19), 9276-9284 (2013).</li><li>Kreger, S. T., Voytik-Harbin, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronan+concentration+within+a+3D+collagen+matrix+modulates+matrix+viscoelasticity,+but+not+fibroblast+response.">Hyaluronan concentration within a 3D collagen matrix modulates matrix viscoelasticity, but not fibroblast response.</a> Matrix Biology. 28 (6), 336-346 (2009).</li><li>Chanmee, T., Ontong, P., Itano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronan:+A+modulator+of+the+tumor+microenvironment.">Hyaluronan: A modulator of the tumor microenvironment.</a> Cancer Letters. 375 (1), 20-30 (2016).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+Three-Dimensional+Microenvironment+with+Hyaluronan+of+Different+Molecular+Weights+Alters+Breast+Cancer+Cell+Invasion+Behavior.">Modulating Three-Dimensional Microenvironment with Hyaluronan of Different Molecular Weights Alters Breast Cancer Cell Invasion Behavior.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 9 (11), 9327-9338 (2017).</li><li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+role+of+low+molecular+weight+hyaluronan+in+breast+cancer+metastasis.">A novel role of low molecular weight hyaluronan in breast cancer metastasis.</a> The FASEB Journal. 29 (4), 1290-1298 (2015).</li><li>Fisher, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+resistance,+high+molecular+weight+hyaluronic+acid,+and+longevity.">Cancer resistance, high molecular weight hyaluronic acid, and longevity.</a> Journal of cell communication and signaling. 9 (1), 91-92 (2015).</li></ol>

Det er godt dokumentert at levende organismer, preget av komplekse 3D flercellet organisasjonen er ganske forskjellige fra de vanlige 2D monolayer kultivert cellene, understreker avgjørende måtte bruke mobilnettet modeller som bedre etterligner funksjonene og prosesser av den levende organismen for narkotika screening. Nylig har flercellet spheroids, organotypic kulturer, organoids og organer på-chip vært introdusert8 for bruk i standardiserte medisiner. Men truer 3D flercellet modellens stor ...

Døden skyldes hovedsakelig til formidling av metastatisk celler til fjerntliggende steder. Mange anstrengelser i kreftbehandling fokusere på målretting eller hindre dannelsen av metastatisk kolonier og progresjon av systemisk metastaser1. Kreft celle migrasjon er et viktig skritt i svulst metastasering prosessen, dermed forskning kreft invasjonen cascade er svært viktig og en forutsetning for å finne anti-metastatisk therapeutics.
Bruk av dyr modeller som verktøy for å studere metastatisk sykdom har blitt funnet for å være svært dyrt og ikke alltid representative for svulst i mennesker. Videre er påvirke den ekstracellulære microenvironment topologi, mekanikk og komposisjon sterkt kreft cellen oppførsel2. Siden i vivo modeller iboende mangel evnen å skille og kontrollere slike spesifikke parametere som bidrar til kreft invasjon og metastasering, er det behov for kontrollerbar biomimetic i vitro modeller.
For å kunne metastase å fjerne organer, må kreftceller utstilling vandrende og invasive fenotypiske trekk som kan målrettes for terapi. Men siden de fleste i vitro kreft modeller ikke etterligne faktiske funksjonene i solide svulster3, er det svært utfordrende å oppdage fysiologisk relevante fenotyper. I tillegg dikterer til fenotypiske heterogene som finnes i svulsten, behovet for å analysere svulst overføring på ett element oppløsning for å oppdage fenotypen rettet behandlinger, for eksempel ved å målrette metastasering-starte cellen befolkningen i heterogene svulster4.
Studiet av cellen motilitet og kollektiv migrasjon gjennomføres hovedsakelig monolayer kulturer av epitelceller på homogen Plane overflater. Disse konvensjonelle mobilnettet modeller for kreft celle migrasjon er basert på befolkningen analyse av enkeltceller invadere gjennom membraner og ECM komponenter5, men i slike systemer, iboende forskjellene mellom individuelle celler ikke studerte. Genererer 3D spheroids via stillaser eller stillaset uten mikro-strukturer er regnet som en overlegen betyr å studere svulst celle vekst og kreft invasjonen6,7,8. Men mest 3D systemer er ikke egnet til høy gjennomstrømning formater, og mellom spheroid interaksjon vanligvis oppnås ikke siden isolerte individuelle spheroids genereres i hver mikro-og9. Studier med kreft overføringen er basert på microfluidic enheter3,10,11,12, men disse sofistikerte microfluidic verktøy er vanskelig å produsere og ikke kan brukes for høy gjennomstrømning screening (HTS) av anti-invasiv narkotika.
To viktigste fenotyper, kollektive og individuelle celle migrasjon, som spiller en rolle i kreftceller overvinne ECM barrieren og invadere nærliggende vev, har blitt demonstrert13,14, hver viser atskilte morfologiske egenskaper, biokjemiske, molekylære og genetiske mekanismer. I tillegg er to former for overføring kreftceller, fibroblast-like og amoeboid, observert i hver fenotypen. Siden både invasjonen fenotyper og migrasjon moduser, defineres hovedsakelig av morfologiske egenskaper, det er behov for mobilnettet modeller som aktiverer imaging-basert oppdagelsen og undersøkelse av alle former for svulst invasjon og migrere celler.
Det overordnede målet med det aktuelle metoden er å gi en enkel og reproduserbar biomimetic 3D i vitro cellen-basert system for analyse av invasjonen kapasitet i store populasjoner av svulst spheroids. Her introduserer vi HMCA-baserte 6-og bildebehandling platen til forskning av svulst invasjon og anti-metastatisk terapi. Teknologien gjør det mulig for dannelsen av et stort antall uniform 3D svulst spheroids (450 per brønn) i en hydrogel mikro-kammer (MC) struktur. Ulike ECM-komponenter er lagt til spheroid matrisen aktivere invasjonen av cellene i omgivelsene. Invasjonen er kontinuerlig overvåket av kort - og langsiktige observasjon av samme personlige spheroids/invadere celler og muliggjør morfologiske karakterisering, fluorescerende flekker og gjenfinning av bestemt spheroids når som helst. Siden mange spheroids deler plassen og medium, er kommunikasjon via løselige molekyler mellom individuelle spheroids og deres innvirkning på hverandre mulig. Halvautomatisk bildeanalyser utføres ved hjelp av interne MATLAB kode som gjør det raskere og mer effektiv samling av store mengder data. Plattformen forenkler nøyaktig, samtidig måling av mange spheroids/invadere celler på en tidkrevende måte, slik at medium gjennomstrømming screening av anti-invasjonen narkotika.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6 Micro-well Glass Bottom Plates with 14 mm micro-well #1.5 cover glass</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>P06-14-1.5-N</td>
			<td>Commercial glass bottom plates which are used for HMCA embossing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Low Melting Point Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520100</td>
			<td>A solution of 6% agarose is warmed up to 80&#176;C before use, a solution of 1% agarose is warmed to 37&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA solution B</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-052-1A</td>
			<td>Warmed to 37&#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM medium, high glucose</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>01-055-1A</td>
			<td>Warmed to 37&#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Special Newborn Calf Serum (NBCS)</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>04-122-1A</td>
			<td>Heat Inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (10X), no calcium, no magnesium</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>02-023-5A</td>
			<td>Kept on ice before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH, anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5881-500G</td>
			<td>Used for the preparation of 1M NaOH solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Type I collagen from rat tail, 5mg/ml</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>3440-100-01</td>
			<td>Kept on ice before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronic acid sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H5542-10MG</td>
			<td>Kept on ice before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisetin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F505-100MG</td>
			<td>Added to the culture medium, invasion inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DETA/NO</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>alx-430-014-m005</td>
			<td>Added to the culture medium, nitric oxide donor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4170</td>
			<td>Used at very low concenrtation without the need for washing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dymax 5000-EC UV flood lamp complete system with light shield &#38; Dymax 400 Watt EC power supply</td>
			<td>Dymax Corporation</td>
			<td>PN 39823</td>
			<td>Used for HMCA plate sterilization by UV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted IX81 microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Used for automatic image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator for microscope</td>
			<td>Life Imaging Services</td>
			<td></td>
			<td>Essential for time lapse experiments with image acquisition, pre adjusted to 37&#176;C, 5% CO2 and keeping a humidified atmosphere</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sub-micron motorized stage type SCAN-IM</td>
			<td>Marzhauser Wetzlar GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Used to predetermine image acquisition areas, for automatic image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14-bit, ORCA II C4742-98 cooled camera</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td></td>
			<td>Highly sensitive, used for imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent filter cube for PI detection</td>
			<td>Chroma Technology Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Filter cube specifications: excitation filter 530-550 nm, dichroic mirror 565 nm long pass and emission filter 600-660 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Olympus Cell^P operating software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Software used to control microscope, motorized stage, camera and image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab R2014B analysis software</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>Used to develop in house graphic user interface for image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel software</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Used for data management, calculation, plot creation and statistics</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of cancer cell invasion and anti-metastatic drug screening using hydrogel micro-chamber array (hmca)-based plates

Kreft metastasering er kjent at 90% av kreft dødelighet. Metastasering er en flertrinns prosess som starter med penetrasjon/invasjonen av svulst cellene i nærliggende vev. Dermed er invasjonen et viktig skritt i metastasering, gjør invasjonen prosess forskning og utvikling av anti-metastatisk narkotika, stor betydning. For å møte denne etterspørselen, det er behov for å utvikle 3D i vitro modeller som imiterer arkitektur solide svulster og deres microenvironment nærmest til i vivo tilstand på den ene siden, men samtidig være reproduserbare, robust og egnet for høy kapasitet og høy innhold målinger. Foreløpig mest invasjonen analyser lene på sofistikerte microfluidic teknologi som er tilstrekkelig for forskning, men ikke for høyt volum narkotikarelaterte screening. Andre analyser plate-baserte enheter med isolerte individuelle spheroids i hver brønn er materiale forbruker og har lav utvalgsstørrelsen per betingelse. Målet med gjeldende protokollen er å gi en enkel og reproduserbar biomimetic 3D cellen-basert system for analyse av invasjonen kapasitet i store populasjoner av svulst spheroids. Vi utviklet en 3D-modell for invasjonen analysen basert på HMCA tenkelig plate til forskning av svulst invasjon og anti-metastatisk medisiner. Denne enheten kan mange uniform spheroids per brønn (høy utvalgsstørrelsen per betingelse) omgitt av ECM komponenter, mens kontinuerlig og samtidig observere og måle spheroids på ett element oppløsning for middels gjennomstrømming screening av anti-metastatisk narkotika. Denne plattformen er presentert her av produksjonen av HeLa og MCF7 spheroids for exemplifying enkelt celle og kollektive invasjonen. Vi sammenligne påvirkning av ECM komponent hyaluronic syre (HA) på invasiv kapasiteten av kollagen rundt HeLa spheroids. Til slutt, vi introdusere Fisetin (invasjonen hemmer) HeLa spheroids og nitrogenoksid (ingen) (invasjonen Aktivator) til MCF7 spheroids. Resultatene analyseres av Husets programvare som gjør halvautomatisk, enkel og rask analyse som gjør flere parameter eksamen.

Den unike HMCA imaging platen brukes for invasjonen analysen av 3D svulst spheroids. Hele analysen, begynner med spheroid dannelse og slutter med invasjonen prosessen og flere manipulasjoner, utføres innen samme plate. For formet formasjon, HeLa celler er lastet inn i matrisen bassenget og bosette seg i hydrogel MCs av tyngdekraften. Hydrogel MCs, som har ikke-tilhenger/lav vedlegg egenskaper, lette celle-celle samspillet og dannelse av 3D svulst spheroids. Figur 2A<...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array HMCA-based Plates at JoVE.com

Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array HMCA-based Plates

En HMCA-basert bildebehandling plate er presentert for invasjonen analysen ytelse. Denne platen forenkler dannelsen av tredimensjonale (3D) svulst spheroids og måling av kreft cellen invasjonen i den ekstracellulære matrisen (EFM). Invasjonen analysen kvantifiseringen oppnås ved halvautomatisk analyse.

Analyse av kreft cellen invasjon og anti-metastatisk narkotikarelaterte Screening bruker Hydrogel mikro-kammer Array (HMCA)-baserte plater

Cancer metastasis is known to cause 90% of cancer lethality. Metastasis is a multistage process which initiates with the penetration/invasion of tumor ...

Målet med dette enkle reproduserbare biomimetiske 3D-cellebaserte systemet er å lette invasjonskapasitetsanalysen i stor populasjon av tumorsfæroid for antimetastatisk legemiddelscreening. Den største fordelen med vår hydrogel mikro-kammer array er at det tillater produksjon av et stort antall ensartede sfæroider som fyller samme fokalplan per brønn. Sfæroidposisjonen beholdes på grunn av hydrogelmikrokammermatrisestrukturen selv etter ekstracellulær matrisetillegg, noe som letter nøyaktig kontinuerlig overvåking av sfæroidene og invasjonsprosessen.Videre kan den morfologiske karakteriseringen og fluorescerende fargingen av mange sfæroider og invaderende celler utføres in situ og analyseres ved en enkeltelementoppløsning på en tidseffektiv måte. Viser hydrogel mikro-kammer array seks-brønn bildeplate produksjonsprosedyre vil være Maria Sobolev fra vårt laboratorium. For å forberede hydrogel mikro-kammer array plater, først forvarm seks polydimethylsiloxane, eller PDMS, frimerker til 70 grader Celsius, og plassere en seks-brønn, glass-bunnplate på et tørt bad forvarmet til 75 grader Celsius i flere minutter.Når platen er varm, hell en 400-mikroliter dråpe forvarmet lavtsmeltende oppsto på bunnen av hver brønn av seksbrønnsplaten, og legg forsiktig ett stempel over hver dråpe. La oppsettet avkjøles i fem til 10 minutter ved romtemperatur, etterfulgt av 20 minutter ved fire grader Celsius for full agarose gelasjon. Når agarose har størknet, forsiktig skrelle av PDMS fra hver brønn, slik at agarose geler mønstret med mikro-kamre.Etter at UV-lampen har nådd sin høyeste intensitet, plasserer du den pregede platen i lysherdesystemet i tre minutter, og fyller de UV-steriliserte makrobrønnene med steril PBS. Dekk deretter platen, og pakk den med Parafilm for fire graders Celsius-lagring til bruk. For å laste cellene, fjern PBS fra hver brønn, og legg forsiktig 50 mikroliter av cellene av interesse på toppen av hver hydrogel array.Etter å ha tillatt cellene å bosette seg ved tyngdekraften i 15 minutter, legg forsiktig til seks til åtte aliquots av 500 mikroliter med friskt medium til kanten av makrobrønnplastbunnen utenfor ringen og hydrogelarrayet. Inkuber cellene for riktig tidsperiode ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid med fuktighet for dannelsen av sfæroider. Deretter overfører du sfæroidene til en biosikkerhetshette på is i 10 minutter.Når platen er avkjølt, lener du en pipettespiss på kanten av den makrobrønnbaserte plastbunnen ved siden av hydrogelmatrisen, og fjern alt mediet fra rundt arrayet. Deretter fjerner du mediet fra arraytanken, lener en gellastende pipettespiss på kanten av arraytanken veldig nøye, og tar vare på å ikke forstyrre mikrokamrene og sfæroidene. Deretter bruker du en pre-frossen, fin pipettespiss for å legge til to aliquots av 150 mikroliter av kollagenblandingen av interesse på kanten av matrisen en om gangen, og frigjør blandingen sakte for å unngå sfæroid forvridning.Etter den andre runden av kollagen er lagt til hver brønn, returnere sfæroider til inkubatoren i en time for full gelasjon av den ekstracellulære matrisen. Når matrisen har størknet, tilsett 400 mikroliter forhåndsoppvarmede 1% lavtsmeltende agarose på toppen av gelen, og inkuber platen, dekket ved romtemperatur, i fem til syv minutter, før avkjøling i to minutter ved fire grader Celsius for agarose gelasjon. Deretter lener pipetten på kanten av makrobrønnen plastbunn, legg forsiktig til to milliliter komplett medium til hver brønn.For å utføre en invasjonsanalyse, last hydrogelmikrokammermaterplaten på et motorisert invertert mikroskopstadium utstyrt med en 37-graders Celsius og 5% karbondioksidinkubator med en fuktet atmosfære, og bruk et fire eller 10x mål for å forhåndsdeskgjøre posisjonene for bildeoppkjøpet i hver brønn slik at hele arrayområdet vil bli vurdert. Deretter får du lyse feltbilder hver to til fire timer i totalt 24 til 72 timer for å spore celleinvasjonen fra sfæroidkroppen inn i den omkringliggende ekstracellulære matrisen. På slutten av bildeinnhentelsen eksporterer du tidsforløpsbildene fra bildeanskaffelsesprogramvaren for lagring i et merket bildefilformat til en dedikert mappe.Deretter åpner du det grafiske brukergrensesnittet og klikker Last inn lyst felt. Juster segmenteringsparametrene for bildet for å oppnå en nøyaktig segmentering av sfæroidene og deres invasjonsområder, og klikk Region of Interest Segmentering for å opprette en grense rundt hver sfæroid. Hvis den automatiske segmenteringen er feil, trykker du Slett eller Legg til og foretar de riktige rettelsene manuelt.Klikk Sporing for å nummerere sfæroidene i hvert av tidsforløpsbildene. Klikk deretter Måling for å generere et regneark med alle parameterne, og lagre regnearket i et passende format for databehandling og statistisk analyse. For å undersøke påvirkningen av hyaluronsyre på den spontane HeLa sfæroidinvasjonsprosessen, ble to-dagers modnet sfæroider dekket med kollagen og hyaluronsyreblandingsløsning og sammenlignet med to-dagers modne sfæroider dekket med kollagenløsning alene.Etter 50 timers inkubasjon viste spheroidene innebygd i kollagen og hyaluronsyre en lavere celledispersjon i den omkringliggende ekstracellulære matrisen sammenlignet med sfæroidene innebygd i kollagen alene. Faktisk indikerer analyse av invasjonsområdet kinetikk over tid for 99 sfæroider ved enkeltsfæroid oppløsning tydelig at tilsetning av hyaluronsyre til kollagen hemmer celledispersjon ut av sfæroid, noe som resulterer i mindre invasjonsområder. Behandling av HeLa sfæroidkulturen med en bioaktiv flavonoid med cyto- og migrastatiske egenskaper i 24 timer resulterer i en hemmet celledispersjon rundt sfæroidene sammenlignet med ikke-behandlede HeLa-sfæroider.Faktisk viste analyse av invasjonsområdene på 488 sfæroider på slutten av eksperimentet en betydelig hemming etter behandling med så lite som 10 mikromolar av legemidlet. På grunn av hydrogelens lave vedlegg, letter denne mikrokammerbaserte teknologien dannelsen av sfæroid selv i tilfeller av svært få celler. Dette er spesielt fordel i verdifulle begrensede kreftstamlignende eller pasientavledede primære celleprøver.Hydrogel mikro-kammer bildeplate gjør det mulig å analyse av den nøyaktige romlige plasseringen av sfæroider under langsiktige eksperimenter for evaluering av invasjonsprosessen på enkeltelementnivå og gir en høy grad av statistisk robusthet og nøyaktighet. Fremtidige anvendelser av denne metodikken inkluderer side-ved-side multi-celle culturing av tumor og stromal celler i ulike regioner innenfor makrobrønnen og henting av individuelle sfæroider for nedstrøms molekylær analyse.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array (HMCA)-based Plates

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

Utnytte Funksjonell genom Screening for å identifisere potensielt Novel narkotika mål i Cancer Cell spheroid kulturer

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

A Model for Perineural Invasion in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

En modell for perinevral invasjon i Head and Neck Plateepitelkarsinom

Perineural invasion (PNI) is found in approximately 40% of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC). Despite multimodal treatment with surgery, ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Generering av høy gjennomstrømming tredimensjonale svulst Spheroids for narkotikarelaterte Screening

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Live-celle Imaging analyser studie Glioblastoma hjerne svulst stamcelleforskningen migrasjon og invasjon

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

3-D Cell Culture System for Studying Invasion and Evaluating Therapeutics in Bladder Cancer

3-D celle kultur-systemet for å studere invasjonen og evaluere legemiddelselskap i blærekreft

Bladder cancer is a significant health problem. It is estimated that more than 16,000 people will die this year in the United States from bladder cancer. ...

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

En enkel overføring/invasjonen arbeidsflyt ved hjelp av en automatisert Live-celle-Imager

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Narkotikascreening av primær pasient avledet tumor xenografts i sebrafisk

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

Impedance-based Real-time Measurement of Cancer Cell Migration and Invasion

Impedansbasert sanntidsmåling av kreftcellemigrasjon og invasjon

Cancer arises due to uncontrolled proliferation of cells initiated by genetic instability, mutations, and environmental and other stress factors. These ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Evaluering av celledød ved hjelp av cellefri supernatant av probiotika i tredimensjonale sfæroidkulturer av kolorektale kreftceller

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

Overvåking av kreftcelleinvasjon og T-celle cytotoksisitet i 3D-kultur

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...