Name: analysis of cancer cell invasion and anti-metastatic drug screening using hydrogel micro-chamber array (hmca)-based plates
Uploaded: 2018-10-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array HMCA-based Plates at JoVE.com

Эта работа поддерживается завещание о Шимон Моше и Джудит Weisbrodt.

1. HMCA пластина тиснение
Примечание: Полный процесс проектирования и изготовление полидиметилсилоксан (PDMS) штамп и HMCA изображений пластины, используемые в настоящем протоколе подробно в наших предыдущих статьях15,16. Отметку PDMS (отрицательные...

<ol>
	<li>Guan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+metastases:+challenges+and+opportunities.">Cancer metastases: challenges and opportunities.</a> Acta pharmaceutica Sinica. B. 5 (5), 402-418 (2015).</li><li>Sapudom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phenotype+of+cancer+cell+invasion+controlled+by+fibril+diameter+and+pore+size+of+3D+collagen+networks.">The phenotype of cancer cell invasion controlled by fibril diameter and pore size of 3D collagen networks.</a> Biomaterials. 52, 367-375 (2015).</li><li>Portillo-Lara, R., Annabi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microengineered+cancer-on-a-chip+platforms+to+study+the+metastatic+microenvironment.">Microengineered cancer-on-a-chip platforms to study the metastatic microenvironment.</a> Lab on a chip. 16 (21), 4063-4081 (2016).</li><li>Gkountela, S., Aceto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem-like+features+of+cancer+cells+on+their+way+to+metastasis.">Stem-like features of cancer cells on their way to metastasis.</a> Biology Direct. 11 (1), 33 (2016).</li><li>Kramer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+cell+migration+and+invasion+assays.">In vitro cell migration and invasion assays.</a> Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 752 (1), 10-24 (2013).</li><li>Guzman, A., S&#225;nchez Alemany, V., Nguyen, Y., Zhang, C. R., Kaufman, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+3D+in+vitro+metastasis+model+elucidates+differential+invasive+strategies+during+and+after+breaching+basement+membrane.">A novel 3D in vitro metastasis model elucidates differential invasive strategies during and after breaching basement membrane.</a> Biomaterials. 115, 19-29 (2017).</li><li>Lee, E., Song, H. -. H. G., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+on-a-chip+platforms+for+studying+cancer+metastasis.">Biomimetic on-a-chip platforms for studying cancer metastasis.</a> Current opinion in chemical engineering. 11, 20-27 (2016).</li><li>Mittler, F., Obe&#239;d, P., Rulina, A. V., Haguet, V., Gidrol, X., Balakirev, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Content+Monitoring+of+Drug+Effects+in+a+3D+Spheroid+Model.">High-Content Monitoring of Drug Effects in a 3D Spheroid Model.</a> Frontiers in Oncology. 7, 293 (2017).</li><li>Evensen, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+High-Throughput+Three-Dimensional+Invasion+Assay+for+Anti-Cancer+Drug+Discovery.">Development of a High-Throughput Three-Dimensional Invasion Assay for Anti-Cancer Drug Discovery.</a> PLoS ONE. 8 (12), e82811 (2013).</li><li>Aw Yong, K. M., Li, Z., Merajver, S. D., Fu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+tumor+invasion+front+using+long-term+fluidic+tumoroid+culture.">Tracking the tumor invasion front using long-term fluidic tumoroid culture.</a> Scientific Reports. 7 (1), 10784 (2017).</li><li>Mi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+co-culture+system+for+cancer+migratory+analysis+and+anti-metastatic+drugs+screening.">Microfluidic co-culture system for cancer migratory analysis and anti-metastatic drugs screening.</a> Scientific Reports. 6 (1), 35544 (2016).</li><li>Chung, S., Sudo, R., Mack, P. J., Wan, C. -. R., Vickerman, V., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+into+scaffolds+under+co-culture+conditions+in+a+microfluidic+platform.">Cell migration into scaffolds under co-culture conditions in a microfluidic platform.</a> Lab on a chip. 9 (2), 269-275 (2009).</li><li>Krakhmal, N. V., Zavyalova, M. V., Denisov, E. V., Vtorushin, S. V., Perelmuter, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+Invasion:+Patterns+and+Mechanisms.">Cancer Invasion: Patterns and Mechanisms.</a> Acta naturae. 7 (2), 17-28 (2015).</li><li>Lintz, M., Mu&#241;oz, A., Reinhart-King, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mechanics+of+Single+Cell+and+Collective+Migration+of+Tumor+Cells.">The Mechanics of Single Cell and Collective Migration of Tumor Cells.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 139 (2), 21005 (2017).</li><li>Afrimzon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogel+microstructure+live-cell+array+for+multiplexed+analyses+of+cancer+stem+cells,+tumor+heterogeneity+and+differential+drug+response+at+single-element+resolution.">Hydrogel microstructure live-cell array for multiplexed analyses of cancer stem cells, tumor heterogeneity and differential drug response at single-element resolution.</a> Lab on a Chip. 16 (6), 1047-1062 (2016).</li><li>Shafran, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+is+cytoprotective+to+breast+cancer+spheroids+vulnerable+to+estrogen-induced+apoptosis.">Nitric oxide is cytoprotective to breast cancer spheroids vulnerable to estrogen-induced apoptosis.</a> Oncotarget. 8 (65), 108890-108911 (2017).</li><li>Sato, H., Idiris, A., Miwa, T., Kumagai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabric+Vessels+for+Embryoid+Body+Formation+and+Rapid+Differentiation+of+Pluripotent+Stem+Cells.">Microfabric Vessels for Embryoid Body Formation and Rapid Differentiation of Pluripotent Stem Cells.</a> Scientific Reports. 6 (1), 31063 (2016).</li><li>Lee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gravity-oriented+microfluidic+device+for+uniform+and+massive+cell+spheroid+formation.">Gravity-oriented microfluidic device for uniform and massive cell spheroid formation.</a> Biomicrofluidics. 6 (1), 14114 (2012).</li><li>Zaretsky, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+the+dynamics+of+primary+T+cell+activation+and+differentiation+using+long+term+live+cell+imaging+in+microwell+arrays.">Monitoring the dynamics of primary T cell activation and differentiation using long term live cell imaging in microwell arrays.</a> Lab on a Chip. 12 (23), 5007 (2012).</li><li>Khan, N., Syed, D. N., Ahmad, N., Mukhtar, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fisetin:+a+dietary+antioxidant+for+health+promotion.">Fisetin: a dietary antioxidant for health promotion.</a> Antioxidants &amp; redox signaling. 19 (2), 151-162 (2013).</li><li>Lee, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Networked+concave+microwell+arrays+for+constructing+3D+cell+spheroids.">Networked concave microwell arrays for constructing 3D cell spheroids.</a> Biofabrication. 10 (1), 15001 (2017).</li><li>Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+(3D)+tumor+spheroid+invasion+assay.">Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (99), e52686 (2015).</li><li>Toh, Y. -. C., Raja, A., Yu, H., van Noort, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+Microfluidic+Model+to+Recapitulate+Cancer+Cell+Migration+and+Invasion.">A 3D Microfluidic Model to Recapitulate Cancer Cell Migration and Invasion.</a> Bioengineering. 5 (2), 29 (2018).</li><li>Sugimoto, M., Kitagawa, Y., Yamada, M., Yajima, Y., Utoh, R., Seki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropassage-embedding+composite+hydrogel+fibers+enable+quantitative+evaluation+of+cancer+cell+invasion+under+3D+coculture+conditions.">Micropassage-embedding composite hydrogel fibers enable quantitative evaluation of cancer cell invasion under 3D coculture conditions.</a> Lab on a Chip. 18 (9), 1378-1387 (2018).</li><li>Yamamoto, S., Hotta, M. M., Okochi, M., Honda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Vascular+Formed+Endothelial+Cell+Network+on+the+Invasive+Capacity+of+Melanoma+Using+the+In+Vitro+3D+Co-Culture+Patterning+Model.">Effect of Vascular Formed Endothelial Cell Network on the Invasive Capacity of Melanoma Using the In Vitro 3D Co-Culture Patterning Model.</a> PLoS ONE. 9 (7), e103502 (2014).</li><li>Lee, S. -. H., Moon, J. J., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+micropatterning+of+bioactive+hydrogels+via+two-photon+laser+scanning+photolithography+for+guided+3D+cell+migration.">Three-dimensional micropatterning of bioactive hydrogels via two-photon laser scanning photolithography for guided 3D cell migration.</a> Biomaterials. 29 (20), 2962-2968 (2008).</li><li>Gschwind, A., Zwick, E., Prenzel, N., Leserer, M., Ullrich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+communication+networks:+epidermal+growth+factor+receptor+transactivation+as+the+paradigm+for+interreceptor+signal+transmission.">Cell communication networks: epidermal growth factor receptor transactivation as the paradigm for interreceptor signal transmission.</a> Oncogene. 20 (13), 1594-1600 (2001).</li><li>Jiang, K., Dong, C., Xu, Y., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic-based+biomimetic+models+for+life+science+research.">Microfluidic-based biomimetic models for life science research.</a> RSC Advances. 6 (32), 26863-26873 (2016).</li><li>Mason, B. N., Starchenko, A., Williams, R. M., Bonassar, L. J., Reinhart-King, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+three-dimensional+collagen+matrix+stiffness+independently+of+collagen+concentration+modulates+endothelial+cell+behavior.">Tuning three-dimensional collagen matrix stiffness independently of collagen concentration modulates endothelial cell behavior.</a> Acta biomaterialia. 9 (1), 4635-4644 (2013).</li><li>Raub, C. B., Putnam, A. J., Tromberg, B. J., George, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+bulk+mechanical+properties+of+cellularized+collagen+gels+using+multiphoton+microscopy.">Predicting bulk mechanical properties of cellularized collagen gels using multiphoton microscopy.</a> Acta Biomaterialia. 6 (12), 4657-4665 (2010).</li><li>Paszek, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype.">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).</li><li>Rao, S. S., DeJesus, J., Short, A. R., Otero, J. J., Sarkar, A., Winter, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+Behaviors+in+Three-Dimensional+Collagen-Hyaluronan+Composite+Hydrogels.">Glioblastoma Behaviors in Three-Dimensional Collagen-Hyaluronan Composite Hydrogels.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 5 (19), 9276-9284 (2013).</li><li>Kreger, S. T., Voytik-Harbin, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronan+concentration+within+a+3D+collagen+matrix+modulates+matrix+viscoelasticity,+but+not+fibroblast+response.">Hyaluronan concentration within a 3D collagen matrix modulates matrix viscoelasticity, but not fibroblast response.</a> Matrix Biology. 28 (6), 336-346 (2009).</li><li>Chanmee, T., Ontong, P., Itano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronan:+A+modulator+of+the+tumor+microenvironment.">Hyaluronan: A modulator of the tumor microenvironment.</a> Cancer Letters. 375 (1), 20-30 (2016).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+Three-Dimensional+Microenvironment+with+Hyaluronan+of+Different+Molecular+Weights+Alters+Breast+Cancer+Cell+Invasion+Behavior.">Modulating Three-Dimensional Microenvironment with Hyaluronan of Different Molecular Weights Alters Breast Cancer Cell Invasion Behavior.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 9 (11), 9327-9338 (2017).</li><li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+role+of+low+molecular+weight+hyaluronan+in+breast+cancer+metastasis.">A novel role of low molecular weight hyaluronan in breast cancer metastasis.</a> The FASEB Journal. 29 (4), 1290-1298 (2015).</li><li>Fisher, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+resistance,+high+molecular+weight+hyaluronic+acid,+and+longevity.">Cancer resistance, high molecular weight hyaluronic acid, and longevity.</a> Journal of cell communication and signaling. 9 (1), 91-92 (2015).</li></ol>

Это хорошо документированы, что живые организмы, характеризуются их сложные 3D многоклеточных Организации весьма отличаются от широко используемых 2D монослоя культивируемых клеток, подчеркивая настоятельную необходимость использования сотовой модели, которые лучше имитировать функ...

Смерти рака обусловлено главным образом распространение метастатическим клеток в отдаленные места. Многие усилия в лечении рака сосредоточены на ориентации или предотвращение формирования метастатического колоний и прогрессирования системных метастатической болезни1. Миграции клеток рака является важным шагом в процессе метастазов опухоли, таким образом, исследования рака вторжения Каскад очень важное и необходимое условие для нахождения анти метастатическим терапии.
Было установлено, что использование животных моделей как инструменты для изучения метастатической болезни очень дорого и не всегда представитель опухоли в организме человека. Кроме того внеклеточная микроокружения топологии, механики и состав сильно влияют на поведение клеток рака2. Поскольку в естественных условиях модели по своей сути не имеют возможности отделить и контролировать такие конкретные параметры, которые способствуют рака вторжения и метастазов, существует необходимость для управляемой biomimetic в vitro моделей.
Для того чтобы метастазировать в отдаленные органы, раковые клетки должны exhibit перелетных и инвазивные фенотипических признаков, которые могут быть направлены для терапии. Однако поскольку большинство моделей в vitro рака не имитируют фактические возможности солидных опухолей3, это очень сложно обнаружить физиологически соответствующих фенотипов. Кроме того фенотипической неоднородности, которая существует в пределах опухоли, диктует необходимость анализа миграции опухоли на одного элемента резолюции для того, чтобы обнаружить фенотип направленного лечения, например, путем инициирования метастазирования клеток населения в гетерогенных опухоли4.
Исследование клеток подвижности и коллективной миграции главным образом проводится в монослоя культур клеток эпителия на однородных плоских поверхностей. Эти обычные сотовой модели для миграции клеток рака основаны на анализе населения отдельных ячеек, вторжение через мембраны и компоненты ECM5, но в таких системах, не могут быть внутренние различия между отдельными ячейками изучал. Создание 3D сфероидов, либо через леса или эшафот свободный микро-структур рассматривается как улучшенные средства для изучения опухоли клеток роста и рак вторжения6,,78. Однако большинство 3D систем не подходят для форматов высокой пропускной способности, и взаимодействие между сфероида обычно не могут быть достигнуты, поскольку изолированные индивидуальные сфероидов создаются в каждом микро ну9. Недавние исследования с участием миграции рака основаны на microfluidic приборы3,10,11,12, однако, эти сложные microfluidic инструменты трудны для производства и не может использоваться для высокой пропускной способности, скрининг (HTS) борьбы с инвазивными наркотиков.
Два главных фенотипы, коллективных и индивидуальных клеток миграции, которые играют роль в опухолевых клетках, преодоление барьера ECM и вторжение в соседние ткани, были продемонстрировали13,14, каждый показ различных морфологических характеристики, биохимические, молекулярно-генетических механизмов. Кроме того две формы миграции опухолевых клеток, фибробластов как и Саркодовые, наблюдаются в каждом фенотип. Поскольку оба вторжения фенотипы и режимах миграции, определяются главным образом морфологических свойств, есть потребность сотовых моделей что включить обнаружение на основе изображений и изучение всех форм прорастание опухоли и миграции клеток.
Общая цель текущего метода является обеспечение простой и воспроизводимые biomimetic 3D в vitro на основе ячеек системы для анализа потенциала вторжения в больших популяциях опухоли сфероидов. Здесь мы представляем на основе HMCA 6-ну изображений пластину для исследования прорастание опухоли и анти метастатическим терапии. Эта технология позволяет формирование большого числа сфероидов единообразных 3D опухоли (450 за хорошо) в структуре гидрогеля микро камеры (MC). Различные компоненты ECM добавляются в массив сфероида чтобы вторжения клетки в окружающую среду. Процесс вторжения непрерывно контролируется кратко - и долгосрочной перспективе наблюдения же индивидуальных сфероидов/вторжение клеток и способствует морфологическая характеристика, флуоресцентный окрашивание и поиска конкретных сфероидов в любой точке. Поскольку многочисленные сфероидов разделяют пространство и среднего, возможен взаимодействия через растворимых молекул между отдельными сфероидов и их влияние друг на друга. Анализ полуавтоматический изображения выполняется с помощью собственного кода MATLAB, который позволяет быстрее и эффективнее сбор большого объема данных. Платформа облегчает точную, одновременное измерение многочисленных сфероидов/вторжение клеток в времени-эффективно, позволяя средней пропускной способности скрининга наркотиков анти вторжения.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6 Micro-well Glass Bottom Plates with 14 mm micro-well #1.5 cover glass</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>P06-14-1.5-N</td>
			<td>Commercial glass bottom plates which are used for HMCA embossing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Low Melting Point Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520100</td>
			<td>A solution of 6% agarose is warmed up to 80&#176;C before use, a solution of 1% agarose is warmed to 37&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA solution B</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-052-1A</td>
			<td>Warmed to 37&#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM medium, high glucose</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>01-055-1A</td>
			<td>Warmed to 37&#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Special Newborn Calf Serum (NBCS)</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>04-122-1A</td>
			<td>Heat Inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (10X), no calcium, no magnesium</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>02-023-5A</td>
			<td>Kept on ice before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH, anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5881-500G</td>
			<td>Used for the preparation of 1M NaOH solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Type I collagen from rat tail, 5mg/ml</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>3440-100-01</td>
			<td>Kept on ice before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronic acid sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H5542-10MG</td>
			<td>Kept on ice before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisetin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F505-100MG</td>
			<td>Added to the culture medium, invasion inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DETA/NO</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>alx-430-014-m005</td>
			<td>Added to the culture medium, nitric oxide donor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4170</td>
			<td>Used at very low concenrtation without the need for washing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dymax 5000-EC UV flood lamp complete system with light shield &#38; Dymax 400 Watt EC power supply</td>
			<td>Dymax Corporation</td>
			<td>PN 39823</td>
			<td>Used for HMCA plate sterilization by UV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted IX81 microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Used for automatic image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator for microscope</td>
			<td>Life Imaging Services</td>
			<td></td>
			<td>Essential for time lapse experiments with image acquisition, pre adjusted to 37&#176;C, 5% CO2 and keeping a humidified atmosphere</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sub-micron motorized stage type SCAN-IM</td>
			<td>Marzhauser Wetzlar GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Used to predetermine image acquisition areas, for automatic image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14-bit, ORCA II C4742-98 cooled camera</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td></td>
			<td>Highly sensitive, used for imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent filter cube for PI detection</td>
			<td>Chroma Technology Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Filter cube specifications: excitation filter 530-550 nm, dichroic mirror 565 nm long pass and emission filter 600-660 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Olympus Cell^P operating software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Software used to control microscope, motorized stage, camera and image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab R2014B analysis software</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>Used to develop in house graphic user interface for image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel software</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Used for data management, calculation, plot creation and statistics</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of cancer cell invasion and anti-metastatic drug screening using hydrogel micro-chamber array (hmca)-based plates

Метастазами рака известно причиной 90% рака летальность. Метастазирование представляет собой многоэтапный процесс, который инициирует с нашествия/проникновения опухолевых клеток в соседние ткани. Таким образом вторжение представляет собой решающий шаг в метастазов, делая вторжение процесса исследований и разработок анти метастатического наркотиков, весьма значительный. Для удовлетворения этого спроса, существует необходимость разработки моделей 3D в пробирке , которые имитируют архитектура твердых опухолей и их микроокружения наиболее близко к в естественных условиях государства, с одной стороны, но в то же время быть воспроизводимость, надежные и подходит для высокая урожайность и высокое содержание измерения. В настоящее время, большинство анализов вторжения опереться на сложные microfluidic технологий, которые являются адекватными для научных исследований, но не для большого объема наркотиков скрининг. Другие анализы, с помощью устройств на основе плиты с изолированной отдельных сфероидов в каждой скважине материал потребления и имеют низкий выборки за состояние. Цель нынешнего протокола является обеспечение простой и воспроизводимые biomimetic 3D на основе ячеек системы для анализа потенциала вторжения в больших популяциях опухоли сфероидов. Мы разработали 3D модель для assay вторжения на основе изображений плита HMCA для исследования прорастание опухоли и анти метастатического лекарственных препаратов. Это устройство позволяет производство многочисленных единообразных сфероидов за хорошо (высокая выборки за состояние) окружении компоненты ECM, при этом постоянно и одновременно наблюдения и измерения сфероидов разрешением одного элемента для средних пропускная способность скрининг анти метастатического наркотиков. Эта платформа здесь представлено производство HeLa и MCF7 сфероидов для иллюстрирующих одну ячейку и коллективные вторжения. Мы сравнить влияние ECM компонент гиалуроновой кислоты (HA) на инвазивные способность коллагена, окружающих HeLa сфероидов. Наконец мы представляем Fisetin (вторжения ингибитор) HeLa сфероидов и оксида азота (NO) (вторжения активатор) для MCF7 сфероидов. Проанализированы результаты собственных программное обеспечение, которое позволяет полуавтоматический, простой и быстрый анализ, который облегчает Многопараметрический экспертизы.

Уникальный HMCA изображений пластина используется для вторжения assay 3D опухоли сфероидов. Всего, начиная с формирования сфероида и заканчивая процессом вторжения и дополнительные манипуляции, генотипирования в пределах же пластины. Для формирования сфероида клетки HeLa ?...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array HMCA-based Plates at JoVE.com

Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array HMCA-based Plates

На основе HMCA изображений пластина представлен для вторжения анализа производительности. Эта пластинка облегчает формирование трехмерной (3D) опухоли сфероидов и измерение раковых клеток вторжения в внеклеточного матрикса (ECM). Квантификация assay вторжения достигается полуавтоматического анализа.

Анализ вторжения клеток рака и борьбы с метастатическим наркотиков Скрининг с использованием массива гидрогеля микро камеры (HMCA)-на основе плиты

Cancer metastasis is known to cause 90% of cancer lethality. Metastasis is a multistage process which initiates with the penetration/invasion of tumor ...

Цель этой простой воспроизводимой биомиметической 3D-клеточной системы заключается в облегчении анализа способности к вторжению в большую популяцию сфероидов опухоли для скрининга антиметастатических препаратов. Основным преимуществом нашего гидрогеля микрокамерного массива является то, что он позволяет производство большого количества однородных сфероидов, которые населяют ту же фокусную плоскость на колодец. Положение сфероида сохраняется благодаря структуре микрокамерного массива гидрогеля даже после добавления внеклеточной матрицы, облегчая точный непрерывный мониторинг сфероидов и процесс вторжения.Кроме того, морфологическая характеристика и флуоресцентное окрашивание многочисленных сфероидов и вторгающихся клеток могут быть выполнены на месте и проанализированы в одном элементном разрешении эффективным способом. Демонстрацией гидрогелевого микрокамерного массива шестиявежелой процедуры производства пластин будет Мария Соболева из нашей лаборатории. Чтобы подготовить гидрогель микро-камеры массив пластин, сначала разогреть шесть polydimethylsiloxane, или PDMS, штампы до 70 градусов по Цельсию, и место шесть хорошо, стекло-дно пластины на сухой ванне предварительно нагревается до 75 градусов по Цельсию в течение нескольких минут.Когда тарелка теплая, залить 400-микролитер капли предварительно нагретых низкоплавильных агарозы на дно каждого хорошо из шести хорошо пластины, и аккуратно поместите одну печать над каждой каплей. Разрешить установки для охлаждения в течение пяти до 10 минут при комнатной температуре, а затем 20 минут при четырех градусах по Цельсию для полного агарозного гелеобразования. Когда агароза затвердеет, аккуратно снимите PDMS с каждой хорошо, оставляя агарозы гели узорчатые с микро-камер.После того, как УФ-лампа достигнет своей наивысшей интенсивности, поместите тиснение пластины в системе легкого лечения в течение трех минут, и заполнить УФ-стерилизованных макро-колодцев с стерильной PBS. Затем накройте пластину и оберните ее Parafilm для четырехградсового хранения по Цельсию до использования. Чтобы загрузить клетки, удалите PBS из каждой хорошо, и осторожно загрузить 50 микролитров клеток, представляющих интерес на вершине каждого гидрогеля массива.После того, как клетки оседают под действием силы тяжести в течение 15 минут, осторожно добавьте от шести до восьми алицитов 500 микролитров свежей среды к краю макро-хорошо пластикового дна за пределами кольца и гидрогеля массива. Инкубировать клетки в течение соответствующего периода времени при 37 градусах цельсия и 5%углекислого газа с влажностью для образования сфероидов. Затем перенесите сфероиды в капюшон биобезопасности на льду в течение 10 минут.Когда пластина остынет, наклонитесь наконечник пипетки на краю макро-хорошо пластикового дна рядом с массивом гидрогеля, и удалить все среды со всего массива. Затем, удалить среду из бака массива, опереться гель-загрузки пипетки отзыв на краю массива бак очень тщательно, заботясь, чтобы не беспокоить микро-камер и сфероидов. Затем используйте предварительно замороженный, тонкий наконечник пипетки, чтобы добавить две алициты из 150 микролитров коллагеновой смеси, представляющих интерес на краю массива по одному, выпуская смесь медленно, чтобы избежать вывиха сфероидов.После того, как второй раунд коллагена был добавлен в каждый колодец, вернуть сфероиды в инкубатор в течение одного часа для полного гелеобразования внеклеточной матрицы. Когда матрица затвердеет, добавьте 400 микролитров предварительно разогретой 1%низкоплавильной агарозы поверх геля и инкубировать пластину, покрытую при комнатной температуре, в течение пяти-семи минут, перед охлаждением в течение двух минут при четырех градусах Цельсия для агарозного гелеобразования. Затем, опираясь пипетку на краю макро-хорошо пластикового дна, аккуратно добавить два миллилитров полной среды к каждому хорошо.Для проведения анализа вторжения загрузите гидрогельную микрокамерную массивную пластину на моторизованную перевернутую стадию микроскопа, оснащенную 37-градусным цельсием и 5%-ным инкубатором двуокиси углерода с увлажненной атмосферой, и используйте четырех- или 10-х цель для предварительного определения позиций для получения изображения в каждой хорошо, так что вся площадь массива будет оценена. Затем, приобрести яркие поля изображения каждые два-четыре часа в общей сложности от 24 до 72 часов, чтобы отслеживать вторжение клеток из сфероидного тела в окружающую внеклеточную матрицу. В конце приобретения изображения экспортут изображения замедленного действия из программного обеспечения для приобретения изображений для сохранения в формате файла с тегами в специальную папку.Затем откройте графический пользовательский интерфейс и нажмите Load Bright Field. Отрегулируйте параметры сегментации изображения, чтобы достичь точной сегментации сфероидов и областей их вторжения, и нажмите Регион Сегментации интересов, чтобы создать границу вокруг каждого сфероида. Если автоматическая сегментация неверна, нажмите Удалить или Добавить, и внести соответствующие исправления вручную.Нажмите Отслеживание, чтобы знать сфероиды в каждом из изображений замедленного действия. Затем нажмите Измерение, чтобы создать электронную таблицу со всеми параметрами, и сохранить таблицу в соответствующем формате для обработки данных и статистического анализа. Для изучения влияния гиалуроновой кислоты на спонтанный процесс нашествия сфероидов HeLa, в этом эксперименте, двухдневные созревают сфероиды были покрыты коллагеном и раствором смеси гиалуроновой кислоты и по сравнению с двухдневными созревает сфероиды покрыты коллагеновым раствором в одиночку.После 50 часов инкубации сфероиды, встроенные в коллаген и гиалуроновую кислоту, продемонстрировали более низкую дисперсию клеток в окружающую внеклеточную матрицу по сравнению со сфероидами, встроенными только в коллаген. Действительно, анализ кинетики области вторжения с течением времени для 99 сфероидов в односферном разрешении ясно показывает, что добавление гиалуроновой кислоты к коллагену подавляет рассеивание клеток из сфероида, что приводит к меньшим областям вторжения. Лечение сфероидной культуры HeLa биоактивным флавоноидом с цито- и миграстатическими свойствами в течение 24 часов приводит к ингибированию дисперсии клеток вокруг сфероидов по сравнению с необработанные сфероиды HeLa.Действительно, анализ зон вторжения 488 сфероидов в конце эксперимента выявил значительное торможение после лечения всего 10 микромолерами препарата. Из-за низкой привязанности, характерной для гидрогеля, эта технология на основе микрокамер облегчает образование сфероидов даже в очень немногих клетках. Это особенно преимущество в ценных ограниченных раковых стволовых или пациентов, полученных первичных образцов клеток.Гидрогелевая микрокамерная томография позволяет анализировать точное пространственное расположение сфероидов в ходе длительных экспериментов по оценке процесса вторжения на уровне одного элемента и обеспечивает высокую степень статистической достоверности и точности. Будущие применения этой методологии включают бок о бок многоклеточное культивирование опухолевых и стромальных клеток в различных регионах в пределах макро-хорошо и поиск отдельных сфероидов для вниз по течению молекулярного анализа.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array (HMCA)-based Plates

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

Использование функциональной геномики скрининг для выявления потенциально новых целей наркотиком в сфероида культур раковых клеток

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

A Model for Perineural Invasion in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Модель для периневральная инвазия в области головы и шеи карцинома роговых клеток

Perineural invasion (PNI) is found in approximately 40% of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC). Despite multimodal treatment with surgery, ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Поколение высокопроизводительных трехмерных опухоли сфероидов для скрининга наркотиков

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Assays клеток опухоли стволовых клеток глиобластомы мозга исследования миграции и вторжения

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

3-D Cell Culture System for Studying Invasion and Evaluating Therapeutics in Bladder Cancer

3-D клетки культуры системы для изучения вторжения и оценки терапии рака мочевого пузыря

Bladder cancer is a significant health problem. It is estimated that more than 16,000 people will die this year in the United States from bladder cancer. ...

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

Простая миграция/вторжения рабочий процесс, с помощью автоматизированных Imager клеток

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Скрининг наркотиков первичного пациента, полученных опухоли Xenografts в зебрафиш

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

Impedance-based Real-time Measurement of Cancer Cell Migration and Invasion

Impedance основе в режиме реального времени Измерения миграции раковых клеток и вторжения

Cancer arises due to uncontrolled proliferation of cells initiated by genetic instability, mutations, and environmental and other stress factors. These ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Оценка гибели клеток с использованием бесклеточного супернатанта пробиотиков в трехмерных сфероидных культурах колоректальных раковых клеток

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

Мониторинг вторжения раковых клеток и цитотоксичности Т-клеток в 3D-культуре

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...