Name: analysis of cancer cell invasion and anti-metastatic drug screening using hydrogel micro-chamber array (hmca)-based plates
Uploaded: 2018-10-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array HMCA-based Plates at JoVE.com

Este trabajo es apoyado por el legado de Moshe Shimon y Judith Weisbrodt.

1. HMCA placa repujado
Nota: El proceso completo para el diseño y fabricación de sello de polidimetilsiloxano (PDMS) y HMCA imagen usada en este protocolo se describe en detalle en nuestros anteriores artículos15,16. El sello PDMS (forma negativa) se utiliza para realzar el HMCA (forma positiva) que consiste en aproximadamente 450 MCs por pozo (figura 1A). Como se muestra en la figura...

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Está bien documentado que los organismos vivos, caracterizados por su compleja organización multicelular 3D son muy distintos de las células de la monocapa 2D utilizados cultivada, haciendo hincapié en la crucial necesidad de utilizar modelos celulares que mejor imitan las funciones y procesos de un organismo vivo para drogas. Recientemente, esferoides multicelulares, culturas organotypic, organoides y órganos-en-un-chip han sido introducidas8 para el uso en el descubrimiento de fármacos est...

Muerte por cáncer se atribuye principalmente a la difusión de las células metastásicas a lugares distantes. Muchos esfuerzos en el tratamiento del cáncer se centran en objetivos o impedir la formación de colonias metastásicas y progresión de la enfermedad metastásica sistémica1. Migración de la célula de cáncer es un paso crucial en el proceso de metástasis de tumor, por lo tanto, la investigación de la cascada de invasión del cáncer es muy importante y un requisito previo a la búsqueda de terapias anti-metastásico.
El uso de modelos animales como herramientas para el estudio de enfermedad metastásica se ha encontrado para ser muy costoso y no siempre representativa del tumor en los seres humanos. Por otra parte, la topología de microambiente extracelular, mecánica y composición afectan fuertemente cáncer célula comportamiento2. En vivo modelos intrínsecamente carecen de la habilidad de separar y controlar estos parámetros específicos que contribuyen a la invasión del cáncer y la metástasis, es necesario para biomiméticos controlable en vitro modelos.
Para metastatizar a órganos distantes, las células cancerosas deben exhibir rasgos fenotípicos invasivos y migratorios que pueden ser destinados a la terapia. Sin embargo, puesto que la mayoría en vitro modelos de cáncer no imitar las reales características de tumores sólidos3, es muy difícil detectar fenotipos fisiológicamente relevantes. Además, la heterogeneidad fenotípica que existe dentro del tumor, dicta la necesidad de analizar la migración del tumor en el solo elemento de resolución para descubrir terapias dirigidas por fenotipo, por ejemplo, apuntando a la celda de inicio de la metástasis población dentro de los tumores heterogéneos4.
El estudio de la motilidad celular y la migración colectiva se lleva a cabo principalmente en cultivos monocapa de células epiteliales en las superficies planas homogéneas. Estos modelos celulares convencionales de migración de la célula de cáncer se basan en el análisis de la población de células invasoras a través de las membranas y componentes de ECM5, pero en estos sistemas, las diferencias intrínsecas entre las células individuales no pueden ser estudió. Generación 3D esferoides mediante andamios o en micro-estructuras de andamio-libre se considera como un superior significa estudiar el tumor de la célula crecimiento y cáncer invasión6,7,8. Sin embargo, la mayoría de los sistemas 3D no son adecuados a los formatos de alto rendimiento y esferoide entre interacción generalmente no puede lograrse desde esferoides individuales aisladas se generan en cada micro pozo9. Estudios recientes que involucran la migración del cáncer se basan en dispositivos microfluídicos3,10,11,12, sin embargo, estos sofisticación microfluídicos herramientas son difíciles de producir y no puede ser utilizado para alto rendimiento (HTS) de detección de drogas anti-invasivas.
Dos fenotipos principales, migración de la célula individual y colectiva, que juegan un papel en las células del tumor superando la barrera de ECM e invadiendo tejidos vecinos, han demostrado13,14, cada uno mostrando distintos morfológica características, mecanismos bioquímicos, moleculares y genéticos. Además, dos formas de migración de las células de tumor, fibroblasto-como y ameboides, se observan en cada fenotipo. Desde ambos, fenotipos de invasión y modos de la migración, principalmente se definen por las características morfológicas, hay una necesidad para celulares modelos que permiten basado en proyección de imagen de detección y examen de todas las formas de invasión tumoral y la migración de las células.
El objetivo general del método actual es proporcionar un simple y reproducible biomiméticos 3D en vitro sistema basadas en células para el análisis de la capacidad de invasión en grandes poblaciones de esferoides tumorales. Aquí, presentamos la base de HMCA 6 imagen placa de pozos para la investigación de invasión del tumor y terapia anti-metastásica. La tecnología permite la formación de un gran número de esferoides tumorales 3D uniforme (450 por pozo) en una estructura de micro-cámaras (MC) de hidrogel. Varios componentes de la ECM se añaden a la matriz de esferoide para permitir la invasión de las células en el entorno. Proceso de invasión es continuamente supervisado por observación de corto y largo plazo de las mismas células esferoides individuales/invadiendo y facilita la caracterización morfológica, tinción fluorescente y recuperación de esferoides específicos en cualquier momento. Puesto que numerosos esferoides comparten espacio y medio, interacción a través de moléculas solubles entre esferoides individuales y su impacto el uno del otro es posible. Análisis de semi-automática de la imagen se realizan utilizando interno código MATLAB que permite la más rápida y eficaz recopilación de gran cantidad de datos. La plataforma facilita la medición precisa y simultánea de numerosas células esferoides/invadiendo de manera eficiente, permitiendo la proyección del rendimiento medio de los medicamentos de lucha contra la invasión.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6 Micro-well Glass Bottom Plates with 14 mm micro-well #1.5 cover glass</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>P06-14-1.5-N</td>
			<td>Commercial glass bottom plates which are used for HMCA embossing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Low Melting Point Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520100</td>
			<td>A solution of 6% agarose is warmed up to 80&#176;C before use, a solution of 1% agarose is warmed to 37&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA solution B</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-052-1A</td>
			<td>Warmed to 37&#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM medium, high glucose</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>01-055-1A</td>
			<td>Warmed to 37&#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Special Newborn Calf Serum (NBCS)</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>04-122-1A</td>
			<td>Heat Inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (10X), no calcium, no magnesium</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>02-023-5A</td>
			<td>Kept on ice before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH, anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5881-500G</td>
			<td>Used for the preparation of 1M NaOH solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Type I collagen from rat tail, 5mg/ml</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>3440-100-01</td>
			<td>Kept on ice before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronic acid sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H5542-10MG</td>
			<td>Kept on ice before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisetin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F505-100MG</td>
			<td>Added to the culture medium, invasion inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DETA/NO</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>alx-430-014-m005</td>
			<td>Added to the culture medium, nitric oxide donor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4170</td>
			<td>Used at very low concenrtation without the need for washing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dymax 5000-EC UV flood lamp complete system with light shield &#38; Dymax 400 Watt EC power supply</td>
			<td>Dymax Corporation</td>
			<td>PN 39823</td>
			<td>Used for HMCA plate sterilization by UV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted IX81 microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Used for automatic image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator for microscope</td>
			<td>Life Imaging Services</td>
			<td></td>
			<td>Essential for time lapse experiments with image acquisition, pre adjusted to 37&#176;C, 5% CO2 and keeping a humidified atmosphere</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sub-micron motorized stage type SCAN-IM</td>
			<td>Marzhauser Wetzlar GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Used to predetermine image acquisition areas, for automatic image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14-bit, ORCA II C4742-98 cooled camera</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td></td>
			<td>Highly sensitive, used for imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent filter cube for PI detection</td>
			<td>Chroma Technology Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Filter cube specifications: excitation filter 530-550 nm, dichroic mirror 565 nm long pass and emission filter 600-660 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Olympus Cell^P operating software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Software used to control microscope, motorized stage, camera and image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab R2014B analysis software</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>Used to develop in house graphic user interface for image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel software</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Used for data management, calculation, plot creation and statistics</td>
		</tr>
	</tbody>
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analysis of cancer cell invasion and anti-metastatic drug screening using hydrogel micro-chamber array (hmca)-based plates

Metástasis del cáncer se sabe que causan el 90% de mortalidad de cáncer. La metástasis es un proceso gradual que inicia con la penetración/invasión de células tumorales en el tejido vecino. Así, la invasión es un paso crucial en metástasis, haciendo la investigación del proceso de invasión y desarrollo de fármacos anti-metastásicos, altamente significativo. Para hacer frente a esta demanda, es necesario desarrollar modelos 3D en vitro que imitan la arquitectura de tumores sólidos y su microambiente más cerca a estado en vivo en una mano, pero al mismo tiempo ser reproducibles, robusta y conveniente para alto rendimiento y alto contenidas mediciones. Actualmente, la mayoría ensayos de invasión apoyan en tecnologías de microfluidos sofisticados que son adecuadas para la investigación pero no para la detección de drogas de alto volumen. Otros ensayos utilizando dispositivos basados en placa con esferoides individuales aisladas en cada pozo son material consumo y tamaño de la muestra baja por condición. El objetivo del protocolo actual es proporcionar un sistema de celulares 3D de biomiméticos simples y reproducibles para el análisis de la capacidad de invasión en grandes poblaciones de esferoides tumorales. Se desarrolló un modelo 3D para análisis de invasión basado en la placa de proyección de imagen de HMCA para la investigación de invasión del tumor y descubrimiento de fármacos anti-metastásico. Este dispositivo permite la producción de numerosos esferoides uniforme por pocillo (tamaño de la muestra alta por condición) rodeada por los componentes del ECM, mientras continuamente y al mismo tiempo observando y midiendo los esferoides en el solo elemento de resolución por medio proyección de producción de drogas anti-metastásicas. Esta plataforma se presenta aquí por la producción de HeLa y MCF7 esferoides para ejemplificar unicelular y la invasión colectiva. Comparar la influencia de la ECM componente el ácido hialurónico (HA) en la capacidad invasiva de colágeno que rodean esferoides de HeLa. Por último, no presentamos Fisetin (inhibidor de la invasión) HeLa esferoides y óxido nítrico () (activador de invasión) a MCF7 esferoides. Los resultados son analizados por el software interno que permite el análisis semi-automático, simple y rápido que facilita el examen de múltiples parámetro.

El único HMCA placa de la proyección de imagen se utiliza para el ensayo de invasión de esferoides tumorales 3D. El ensayo completo, comenzando con la formación esferoide y terminando con el proceso de invasión y manipulación adicional, se realiza en el mismo plato. Para la formación esferoide, células HeLa se cargan en la cuenca de la matriz y se instalan en el hidrogel MCs por gravedad. El hidrogel MCs, que tienen características de adherente/bajo sujeción, facilitar la intera...

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Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array HMCA-based Plates

Una placa de imagen basado en el HMCA se presenta para el funcionamiento de ensayo de invasión. Esta placa facilita la formación de esferoides tumorales (3D) tridimensional y la medición de la invasión de células de cáncer en la matriz extracelular (ECM). La cuantificación del ensayo de invasión se logra por análisis semiautomático.

Análisis de invasión de células de cáncer y uso de hidrogel Micro-cámara matriz (HMCA) de detección de drogas anti-metastásico-basado en placas

Cancer metastasis is known to cause 90% of cancer lethality. Metastasis is a multistage process which initiates with the penetration/invasion of tumor ...

El objetivo de este sencillo sistema biomimético 3D basado en células es facilitar el análisis de la capacidad de invasión en una gran población de esferoides tumorales para el cribado de fármacos antisetásicos. La principal ventaja de nuestra matriz de microcámaras de hidrogel es que permite la producción de un gran número de esferoides uniformes que pueblan el mismo plano focal por pozo. La posición del esferoide se mantiene debido a la estructura de la matriz de microcámaras de hidrogel incluso después de la adición de la matriz extracelular, facilitando el monitoreo continuo preciso de los esferoides y el proceso de invasión.Además, la caracterización morfológica y la tinción fluorescente de numerosos esferoides y células invasoras se pueden realizar in situ y analizarse a una resolución de un solo elemento de una manera eficiente en el tiempo. La demostración del procedimiento de producción de placas de imágenes de seis pozos de la matriz de microcámaras de hidrogel será Maria Sobolev de nuestro laboratorio. Para preparar las placas de matriz de microcámaras de hidrogel, primero precaliente seis sellos de polidimetilsiloxano, o PDMS, sellos a 70 grados Celsius, y coloque una placa de seis pocillos con fondo de vidrio en un baño seco precalentado a 75 grados Celsius durante varios minutos.Cuando la placa esté caliente, vierta una gota de 400 microlitros de agarosa precalentada de baja fusión en la parte inferior de cada pozo de la placa de seis pozos, y coloque suavemente un sello sobre cada gota. Deje que la configuración se enfríe durante cinco a 10 minutos a temperatura ambiente, seguido de 20 minutos a cuatro grados Celsius para la gelificación completa de la agarosa. Cuando la agarosa se haya solidificado, despegue suavemente el PDMS de cada pozo, dejando los geles de agarosa estampados con microcámaras.Después de permitir que la lámpara UV alcance su mayor intensidad, coloque la placa en relieve en el sistema de curado de luz durante tres minutos, y llene los macro-pozos esterilizados por UV con PBS estéril. A continuación, cubra la placa y envuélvala con Parafilm para un almacenamiento Celsius de cuatro grados hasta su uso. Para cargar las células, retire el PBS de cada pozo y cargue suavemente 50 microlitros de las células de interés encima de cada matriz de hidrogeles.Después de permitir que las células se asienten por gravedad durante 15 minutos, agregue cuidadosamente seis a ocho alícuotas de 500 microlitros de medio fresco al borde del fondo plástico macro-pozo fuera de la matriz de anillo e hidrogel. Incubar las células durante el período de tiempo adecuado a 37 grados celsius y 5%dióxido de carbono con humedad para la formación de esferoides. Luego, transfiera los esferoides a una capucha de bioseguridad sobre hielo durante 10 minutos.Cuando la placa se haya enfriado, incline una punta de pipeta en el borde de la parte inferior de plástico macro-pozo junto a la matriz de hidrogeles, y retire todo el medio de alrededor de la matriz. A continuación, retire el medio del tanque de la matriz, incline una punta de pipeta de carga de gel en el borde del tanque de la matriz con mucho cuidado, teniendo cuidado de no molestar a las microcámaras y esferoides. A continuación, utilice una punta de pipeta fina precongelado para agregar dos alícuotas de 150 microlitros de la mezcla de colágeno de interés en el borde de la matriz de una en una, liberando la mezcla lentamente para evitar la luxación de esferoides.Después de que se haya añadido la segunda ronda de colágeno a cada pozo, devuelva los esferoides a la incubadora durante una hora para la gelación completa de la matriz extracelular. Cuando la matriz se haya solidificado, agregue 400 microlitros de agarosa precalegada al 1% de baja fusión en la parte superior del gel, e incubar la placa, cubierta a temperatura ambiente, durante cinco a siete minutos, antes de enfriar durante dos minutos a cuatro grados Celsius para la gelificación. A continuación, inclinando la pipeta en el borde de la parte inferior de plástico macro-pozo, añadir suavemente dos mililitros de medio completo a cada pozo.Para realizar un ensayo de invasión, cargue la placa de matriz de microcámara de hidrogel en una etapa de microscopio invertido motorizado equipada con una incubadora de 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono con una atmósfera humidificada, y utilice un objetivo de cuatro o 10x para pre-determinar las posiciones para la adquisición de la imagen en cada pozo de modo que se evalúe toda el área de la matriz. Luego, adquiera imágenes de campo brillante cada dos o cuatro horas para un total de 24 a 72 horas para rastrear la invasión celular desde el cuerpo esferoide en la matriz extracelular circundante. Al final de la adquisición de imágenes, exporte las imágenes de lapso de tiempo desde el software de adquisición de imágenes para guardar en un formato de archivo de imagen etiquetado a una carpeta dedicada.A continuación, abra la interfaz gráfica de usuario y haga clic en Cargar campo brillante. Ajuste los parámetros de segmentación de la imagen para lograr una segmentación precisa de los esferoides y sus áreas de invasión, y haga clic en Segmentación de región de interés para crear un borde alrededor de cada esferoide. Si la segmentación automática es incorrecta, pulse Suprimir o Agregar y realice las correcciones adecuadas manualmente.Haga clic en Seguimiento para numerar los esferoides en cada una de las imágenes de lapso de tiempo. A continuación, haga clic en Medición para generar una hoja de cálculo con todos los parámetros y guarde la hoja de cálculo en un formato adecuado para el procesamiento de datos y el análisis estadístico. Para examinar la influencia del ácido hialurónico en el proceso espontáneo de invasión de esferoides HeLa, en este experimento, los esferoides maduros de dos días se cubrieron con solución de colágeno y mezcla de ácido hialurónico y se compararon con esferoides maduros de dos días cubiertos con solución de colágeno solo.Después de 50 horas de incubación, los esferoides incrustados en colágeno y ácido hialurónico demostraron una dispersión celular inferior en la matriz extracelular circundante en comparación con los esferoides incrustados solo en colágeno. De hecho, el análisis de la cinética del área de invasión a lo largo del tiempo para 99 esferoides con una resolución de un solo esferoide indica claramente que la adición de ácido hialurónico al colágeno inhibe la dispersión celular fuera del esferoides, lo que resulta en áreas de invasión más pequeñas. El tratamiento del cultivo de esferoide HeLa con un flavonoide bioactivo con propiedades cito-y migratorias durante 24 horas da como resultado una dispersión celular inhibida alrededor de los esferoides en comparación con los esferoides HeLa no tratados.De hecho, el análisis de las áreas de invasión de 488 esferoides al final del experimento reveló una inhibición significativa después del tratamiento con tan poco como 10 micromolares de la droga. Debido a la baja fijación característica del hidrogel, esta tecnología basada en microcámaras facilita la formación de esferoides incluso en casos de muy pocas células. Esto es especialmente ventajoso en valiosas muestras limitadas de células primarias similares a tallos o derivados del paciente.La placa de imágenes de microcámara de hidrogel permite el análisis de la ubicación espacial exacta de los esferoides durante experimentos a largo plazo para la evaluación del proceso de invasión a nivel de un solo elemento y proporciona un alto grado de robustez estadística y precisión. Las aplicaciones futuras de esta metodología incluyen el cultivo unicelular en paralelo de células tumorales y estromales en diferentes regiones dentro del macro-pozo y la recuperación de esferoides individuales para el análisis molecular aguas abajo.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array (HMCA)-based Plates

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

La utilización de la genómica funcional de selección para identificar dianas farmacológicas potencialmente nueva en la celda cáncer culturas Esferoide

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

A Model for Perineural Invasion in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Un modelo para la invasión perineural en cabeza y cuello Carcinoma de células escamosas

Perineural invasion (PNI) is found in approximately 40% of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC). Despite multimodal treatment with surgery, ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Generación de esferoides tumorales tridimensional de alto rendimiento para la detección de drogas

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Análisis de imágenes de células vivas para estudio Glioblastoma cerebral Tumor células madre migración y la invasión

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

3-D Cell Culture System for Studying Invasion and Evaluating Therapeutics in Bladder Cancer

Sistema del cultivo celular 3-d para invasión de estudiar y evaluar la terapéutica en el cáncer de vejiga

Bladder cancer is a significant health problem. It is estimated that more than 16,000 people will die this year in the United States from bladder cancer. ...

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

Un flujo de trabajo Simple migración/invasión usando a un sensor automatizado de células vivas

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Examen de drogas de xenoinjertos de tumores derivados del paciente primario en peces cebra

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

Impedance-based Real-time Measurement of Cancer Cell Migration and Invasion

Medición en tiempo real basada en impedancia de la migración e invasión de células cancerosas

Cancer arises due to uncontrolled proliferation of cells initiated by genetic instability, mutations, and environmental and other stress factors. These ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Evaluación de la muerte celular utilizando sobrenadante libre de células de probióticos en cultivos esferoides tridimensionales de células de cáncer colorrectal

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

Monitoreo de la invasión de células cancerosas y la citotoxicidad de células T en el cultivo 3D

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...