Name: analysis of cancer cell invasion and anti-metastatic drug screening using hydrogel micro-chamber array (hmca)-based plates
Uploaded: 2018-10-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array HMCA-based Plates at JoVE.com

Detta arbete stöds av bequest Moshe Shimon och Judith Weisbrodt.

1. HMCA plattan prägling
Obs: Den kompletta processen för utformning och tillverkning av Polydimetylsiloxan (PDMS) stämpel och HMCA imaging plate används i detta protokoll är beskrivs i detalj i vår tidigare artiklarna15,16. PDMS stämpel (negativ form) används till Relief på HMCA (positiv form) som består av cirka 450 MCs per brunn (figur 1A). Som framgår i figur 1B, ...

<ol>
	<li>Guan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+metastases:+challenges+and+opportunities.">Cancer metastases: challenges and opportunities.</a> Acta pharmaceutica Sinica. B. 5 (5), 402-418 (2015).</li><li>Sapudom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phenotype+of+cancer+cell+invasion+controlled+by+fibril+diameter+and+pore+size+of+3D+collagen+networks.">The phenotype of cancer cell invasion controlled by fibril diameter and pore size of 3D collagen networks.</a> Biomaterials. 52, 367-375 (2015).</li><li>Portillo-Lara, R., Annabi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microengineered+cancer-on-a-chip+platforms+to+study+the+metastatic+microenvironment.">Microengineered cancer-on-a-chip platforms to study the metastatic microenvironment.</a> Lab on a chip. 16 (21), 4063-4081 (2016).</li><li>Gkountela, S., Aceto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem-like+features+of+cancer+cells+on+their+way+to+metastasis.">Stem-like features of cancer cells on their way to metastasis.</a> Biology Direct. 11 (1), 33 (2016).</li><li>Kramer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+cell+migration+and+invasion+assays.">In vitro cell migration and invasion assays.</a> Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 752 (1), 10-24 (2013).</li><li>Guzman, A., S&#225;nchez Alemany, V., Nguyen, Y., Zhang, C. R., Kaufman, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+3D+in+vitro+metastasis+model+elucidates+differential+invasive+strategies+during+and+after+breaching+basement+membrane.">A novel 3D in vitro metastasis model elucidates differential invasive strategies during and after breaching basement membrane.</a> Biomaterials. 115, 19-29 (2017).</li><li>Lee, E., Song, H. -. H. G., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+on-a-chip+platforms+for+studying+cancer+metastasis.">Biomimetic on-a-chip platforms for studying cancer metastasis.</a> Current opinion in chemical engineering. 11, 20-27 (2016).</li><li>Mittler, F., Obe&#239;d, P., Rulina, A. V., Haguet, V., Gidrol, X., Balakirev, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Content+Monitoring+of+Drug+Effects+in+a+3D+Spheroid+Model.">High-Content Monitoring of Drug Effects in a 3D Spheroid Model.</a> Frontiers in Oncology. 7, 293 (2017).</li><li>Evensen, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+High-Throughput+Three-Dimensional+Invasion+Assay+for+Anti-Cancer+Drug+Discovery.">Development of a High-Throughput Three-Dimensional Invasion Assay for Anti-Cancer Drug Discovery.</a> PLoS ONE. 8 (12), e82811 (2013).</li><li>Aw Yong, K. M., Li, Z., Merajver, S. D., Fu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+tumor+invasion+front+using+long-term+fluidic+tumoroid+culture.">Tracking the tumor invasion front using long-term fluidic tumoroid culture.</a> Scientific Reports. 7 (1), 10784 (2017).</li><li>Mi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+co-culture+system+for+cancer+migratory+analysis+and+anti-metastatic+drugs+screening.">Microfluidic co-culture system for cancer migratory analysis and anti-metastatic drugs screening.</a> Scientific Reports. 6 (1), 35544 (2016).</li><li>Chung, S., Sudo, R., Mack, P. J., Wan, C. -. R., Vickerman, V., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+into+scaffolds+under+co-culture+conditions+in+a+microfluidic+platform.">Cell migration into scaffolds under co-culture conditions in a microfluidic platform.</a> Lab on a chip. 9 (2), 269-275 (2009).</li><li>Krakhmal, N. V., Zavyalova, M. V., Denisov, E. V., Vtorushin, S. V., Perelmuter, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+Invasion:+Patterns+and+Mechanisms.">Cancer Invasion: Patterns and Mechanisms.</a> Acta naturae. 7 (2), 17-28 (2015).</li><li>Lintz, M., Mu&#241;oz, A., Reinhart-King, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mechanics+of+Single+Cell+and+Collective+Migration+of+Tumor+Cells.">The Mechanics of Single Cell and Collective Migration of Tumor Cells.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 139 (2), 21005 (2017).</li><li>Afrimzon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogel+microstructure+live-cell+array+for+multiplexed+analyses+of+cancer+stem+cells,+tumor+heterogeneity+and+differential+drug+response+at+single-element+resolution.">Hydrogel microstructure live-cell array for multiplexed analyses of cancer stem cells, tumor heterogeneity and differential drug response at single-element resolution.</a> Lab on a Chip. 16 (6), 1047-1062 (2016).</li><li>Shafran, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+is+cytoprotective+to+breast+cancer+spheroids+vulnerable+to+estrogen-induced+apoptosis.">Nitric oxide is cytoprotective to breast cancer spheroids vulnerable to estrogen-induced apoptosis.</a> Oncotarget. 8 (65), 108890-108911 (2017).</li><li>Sato, H., Idiris, A., Miwa, T., Kumagai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabric+Vessels+for+Embryoid+Body+Formation+and+Rapid+Differentiation+of+Pluripotent+Stem+Cells.">Microfabric Vessels for Embryoid Body Formation and Rapid Differentiation of Pluripotent Stem Cells.</a> Scientific Reports. 6 (1), 31063 (2016).</li><li>Lee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gravity-oriented+microfluidic+device+for+uniform+and+massive+cell+spheroid+formation.">Gravity-oriented microfluidic device for uniform and massive cell spheroid formation.</a> Biomicrofluidics. 6 (1), 14114 (2012).</li><li>Zaretsky, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+the+dynamics+of+primary+T+cell+activation+and+differentiation+using+long+term+live+cell+imaging+in+microwell+arrays.">Monitoring the dynamics of primary T cell activation and differentiation using long term live cell imaging in microwell arrays.</a> Lab on a Chip. 12 (23), 5007 (2012).</li><li>Khan, N., Syed, D. N., Ahmad, N., Mukhtar, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fisetin:+a+dietary+antioxidant+for+health+promotion.">Fisetin: a dietary antioxidant for health promotion.</a> Antioxidants &amp; redox signaling. 19 (2), 151-162 (2013).</li><li>Lee, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Networked+concave+microwell+arrays+for+constructing+3D+cell+spheroids.">Networked concave microwell arrays for constructing 3D cell spheroids.</a> Biofabrication. 10 (1), 15001 (2017).</li><li>Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+(3D)+tumor+spheroid+invasion+assay.">Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (99), e52686 (2015).</li><li>Toh, Y. -. C., Raja, A., Yu, H., van Noort, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+Microfluidic+Model+to+Recapitulate+Cancer+Cell+Migration+and+Invasion.">A 3D Microfluidic Model to Recapitulate Cancer Cell Migration and Invasion.</a> Bioengineering. 5 (2), 29 (2018).</li><li>Sugimoto, M., Kitagawa, Y., Yamada, M., Yajima, Y., Utoh, R., Seki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropassage-embedding+composite+hydrogel+fibers+enable+quantitative+evaluation+of+cancer+cell+invasion+under+3D+coculture+conditions.">Micropassage-embedding composite hydrogel fibers enable quantitative evaluation of cancer cell invasion under 3D coculture conditions.</a> Lab on a Chip. 18 (9), 1378-1387 (2018).</li><li>Yamamoto, S., Hotta, M. M., Okochi, M., Honda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Vascular+Formed+Endothelial+Cell+Network+on+the+Invasive+Capacity+of+Melanoma+Using+the+In+Vitro+3D+Co-Culture+Patterning+Model.">Effect of Vascular Formed Endothelial Cell Network on the Invasive Capacity of Melanoma Using the In Vitro 3D Co-Culture Patterning Model.</a> PLoS ONE. 9 (7), e103502 (2014).</li><li>Lee, S. -. H., Moon, J. J., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+micropatterning+of+bioactive+hydrogels+via+two-photon+laser+scanning+photolithography+for+guided+3D+cell+migration.">Three-dimensional micropatterning of bioactive hydrogels via two-photon laser scanning photolithography for guided 3D cell migration.</a> Biomaterials. 29 (20), 2962-2968 (2008).</li><li>Gschwind, A., Zwick, E., Prenzel, N., Leserer, M., Ullrich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+communication+networks:+epidermal+growth+factor+receptor+transactivation+as+the+paradigm+for+interreceptor+signal+transmission.">Cell communication networks: epidermal growth factor receptor transactivation as the paradigm for interreceptor signal transmission.</a> Oncogene. 20 (13), 1594-1600 (2001).</li><li>Jiang, K., Dong, C., Xu, Y., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic-based+biomimetic+models+for+life+science+research.">Microfluidic-based biomimetic models for life science research.</a> RSC Advances. 6 (32), 26863-26873 (2016).</li><li>Mason, B. N., Starchenko, A., Williams, R. M., Bonassar, L. J., Reinhart-King, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+three-dimensional+collagen+matrix+stiffness+independently+of+collagen+concentration+modulates+endothelial+cell+behavior.">Tuning three-dimensional collagen matrix stiffness independently of collagen concentration modulates endothelial cell behavior.</a> Acta biomaterialia. 9 (1), 4635-4644 (2013).</li><li>Raub, C. B., Putnam, A. J., Tromberg, B. J., George, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+bulk+mechanical+properties+of+cellularized+collagen+gels+using+multiphoton+microscopy.">Predicting bulk mechanical properties of cellularized collagen gels using multiphoton microscopy.</a> Acta Biomaterialia. 6 (12), 4657-4665 (2010).</li><li>Paszek, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype.">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).</li><li>Rao, S. S., DeJesus, J., Short, A. R., Otero, J. J., Sarkar, A., Winter, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+Behaviors+in+Three-Dimensional+Collagen-Hyaluronan+Composite+Hydrogels.">Glioblastoma Behaviors in Three-Dimensional Collagen-Hyaluronan Composite Hydrogels.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 5 (19), 9276-9284 (2013).</li><li>Kreger, S. T., Voytik-Harbin, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronan+concentration+within+a+3D+collagen+matrix+modulates+matrix+viscoelasticity,+but+not+fibroblast+response.">Hyaluronan concentration within a 3D collagen matrix modulates matrix viscoelasticity, but not fibroblast response.</a> Matrix Biology. 28 (6), 336-346 (2009).</li><li>Chanmee, T., Ontong, P., Itano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronan:+A+modulator+of+the+tumor+microenvironment.">Hyaluronan: A modulator of the tumor microenvironment.</a> Cancer Letters. 375 (1), 20-30 (2016).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+Three-Dimensional+Microenvironment+with+Hyaluronan+of+Different+Molecular+Weights+Alters+Breast+Cancer+Cell+Invasion+Behavior.">Modulating Three-Dimensional Microenvironment with Hyaluronan of Different Molecular Weights Alters Breast Cancer Cell Invasion Behavior.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 9 (11), 9327-9338 (2017).</li><li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+role+of+low+molecular+weight+hyaluronan+in+breast+cancer+metastasis.">A novel role of low molecular weight hyaluronan in breast cancer metastasis.</a> The FASEB Journal. 29 (4), 1290-1298 (2015).</li><li>Fisher, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+resistance,+high+molecular+weight+hyaluronic+acid,+and+longevity.">Cancer resistance, high molecular weight hyaluronic acid, and longevity.</a> Journal of cell communication and signaling. 9 (1), 91-92 (2015).</li></ol>

Det är väl dokumenterat att levande organismer, kännetecknas av sin komplexa 3D multicellulär organisation skiljer sig helt från vanliga 2D enskiktslager odlade celler, betonar avgörande behovet av att använda cellular-modeller som bättre efterliknar funktionerna och processer i den levande organismen för drug screening. Nyligen, flercelliga spheroids, organotypic kulturer, organoids och organ-på-ett-chip har varit införda8 för användning av standardiserade läkemedelsutveckling. Dock...

Cancerdöd tillskrivs främst spridning av metastaserande celler till avlägsna platser. Många insatser i cancerbehandling fokuserar på inriktning eller förhindra bildandet av metastaserande kolonier och progression av systemisk metastaserande sjukdom1. Cancer cellmigration är ett avgörande steg i processen tumör metastasering, forskningen av cancer invasion kaskad är således mycket viktigt och en förutsättning att hitta anti metastaserande therapeutics.
Användning av djurmodeller som verktyg för att studera metastaserad sjukdom har visat sig vara mycket dyrt och inte alltid representativa för tumören hos människor. Dessutom påverkar extracellulära mikromiljö topologin, mekanik och sammansättning starkt cancer cell beteende2. Eftersom i vivo modeller saknar inneboende förmåga att skilja och kontrollera sådana specifika parametrar som bidrar till cancer invasion och metastasering, finns det ett behov för kontrollerbar biomimetiska in vitro- modeller.
För att metastasera till avlägsna organ, måste cancerceller uppvisar flyttande och invasiv fenotypiska drag som kan vara riktad terapi. Eftersom de flesta i vitro cancer modeller inte efterlikna riktiga funktioner av solida tumörer3, är det emellertid mycket utmanande att upptäcka fysiologiskt relevanta fenotyper. Dessutom dikterar den fenotypiska heterogenitet som finns inom tumören, behovet för att analysera tumör migration enda element upplösning för att upptäcka fenotyp-riktade terapier, till exempel genom att rikta cellen metastas-initiera befolkningen inom heterogen tumörer4.
Studien av cell motilitet och kollektiva migration genomförs främst i enskiktslager kulturer av epitelceller på homogena plana ytor. Dessa konventionella cellular-modeller för cancer cellmigration baseras på en analys av enskilda celler invaderar genom membran och ECM komponenter5, men i sådana system, till inneboende skillnader mellan enskilda celler kan inte studerade. Generera 3D spheroids antingen via ställningar eller i byggnadsställning-fri mikro-strukturer är ansedd som en överlägsen innebär att studera tumören cell tillväxt och cancer invasion6,7,8. Men mest 3D system lämpar sig inte till hög genomströmning format och Inter sfäroid interaktion vanligtvis uppnås inte eftersom isolerade enskilda spheroids genereras i varje mikro-väl9. Nyligen genomförda studier som involverar cancer migreringen är baserade på mikroflödessystem enheter3,10,11,12, dock dessa sofistikerade mikroflödessystem verktyg är svåra att tillverka och inte kan användas för hög genomströmning screening (HTS) av anti invasiva droger.
Två huvudsakliga fenotyper, kollektiva och individuella cellmigration, som spelar en roll i tumörceller att övervinna ECM barriären och invaderar angränsande vävnad, har varit visat13,14, varje visning distinkta morfologiska egenskaper, biokemiska och molekylära genetiska mekanismerna. Dessutom kan två former av migrerar tumörceller, fibroblast-liknande och amoeboid, observeras i varje fenotyp. Eftersom båda, invasion fenotyper och migration lägen, definieras främst av morfologiska egenskaper, det finns ett behov av cellular modeller att aktivera imaging-baserad detektion och granskning av alla former av tumör invasion och migrera celler.
Det övergripande målet för den nuvarande metoden är att tillhandahålla en enkel och reproducerbara biomimetiska 3D i vitro cell-baserat system för analys av invasion kapacitet i stora populationer av tumör spheroids. Här introducerar vi HMCA-baserade 6-väl tänkbar plattan för forskningen av tumör invasionen och anti metastaserande terapi. Tekniken gör det möjligt för bildandet av ett stort antal enhetliga 3D tumör spheroids (450 per brunn) i en hydrogel mikro-chambers (MC) struktur. Olika ECM komponenter läggs till i arrayen sfäroid aktivera invasionen av cellerna i den omgivande miljön. Invasionen-processen övervakas kontinuerligt av kort - och långsiktiga observationen av samma enskilda spheroids/invaderar celler och underlättar morfologisk karakterisering, fluorescerande färgning och hämtning av specifika spheroids när som helst. Eftersom många spheroids dela utrymme och medium, är interaktion via lösliga molekyler mellan enskilda spheroids och deras inverkan på varandra möjligt. Semi-automatisk bildanalys utförs med hjälp av interna MATLAB-kod som möjliggör snabbare och effektivare insamling av stora mängder data. Plattformen underlättar korrekt, samtidig mätning av många spheroids/invaderar celler på ett tidseffektivt sätt, så att medelstora throughput screening av anti invasion droger.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6 Micro-well Glass Bottom Plates with 14 mm micro-well #1.5 cover glass</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>P06-14-1.5-N</td>
			<td>Commercial glass bottom plates which are used for HMCA embossing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Low Melting Point Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520100</td>
			<td>A solution of 6% agarose is warmed up to 80&#176;C before use, a solution of 1% agarose is warmed to 37&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA solution B</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-052-1A</td>
			<td>Warmed to 37&#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM medium, high glucose</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>01-055-1A</td>
			<td>Warmed to 37&#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Special Newborn Calf Serum (NBCS)</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>04-122-1A</td>
			<td>Heat Inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (10X), no calcium, no magnesium</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>02-023-5A</td>
			<td>Kept on ice before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH, anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5881-500G</td>
			<td>Used for the preparation of 1M NaOH solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Type I collagen from rat tail, 5mg/ml</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>3440-100-01</td>
			<td>Kept on ice before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronic acid sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H5542-10MG</td>
			<td>Kept on ice before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisetin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F505-100MG</td>
			<td>Added to the culture medium, invasion inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DETA/NO</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>alx-430-014-m005</td>
			<td>Added to the culture medium, nitric oxide donor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4170</td>
			<td>Used at very low concenrtation without the need for washing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dymax 5000-EC UV flood lamp complete system with light shield &#38; Dymax 400 Watt EC power supply</td>
			<td>Dymax Corporation</td>
			<td>PN 39823</td>
			<td>Used for HMCA plate sterilization by UV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted IX81 microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Used for automatic image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator for microscope</td>
			<td>Life Imaging Services</td>
			<td></td>
			<td>Essential for time lapse experiments with image acquisition, pre adjusted to 37&#176;C, 5% CO2 and keeping a humidified atmosphere</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sub-micron motorized stage type SCAN-IM</td>
			<td>Marzhauser Wetzlar GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Used to predetermine image acquisition areas, for automatic image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14-bit, ORCA II C4742-98 cooled camera</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td></td>
			<td>Highly sensitive, used for imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent filter cube for PI detection</td>
			<td>Chroma Technology Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Filter cube specifications: excitation filter 530-550 nm, dichroic mirror 565 nm long pass and emission filter 600-660 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Olympus Cell^P operating software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Software used to control microscope, motorized stage, camera and image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab R2014B analysis software</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>Used to develop in house graphic user interface for image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel software</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Used for data management, calculation, plot creation and statistics</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of cancer cell invasion and anti-metastatic drug screening using hydrogel micro-chamber array (hmca)-based plates

Cancer metastaser är kända för att orsaka 90% av cancer dödlighet. Metastaser är en flerstegs process som initierar med penetration/invasionen av tumörceller i närliggande vävnad. Således, invasion är ett avgörande steg i metastaser, att göra invasion process forskning och utveckling av anti metastaserande droger, mycket betydelsefullt. För att möta denna efterfrågan, det finns ett behov av att utveckla 3D i vitro modeller som imiterar arkitekturen av solida tumörer och deras närmiljön närmast till i vivo stat å ena sidan, men samtidigt vara reproducerbara, robust och passar hög avkastning och hög innehåll mätningar. För närvarande, de flesta invasion analyser luta på sofistikerade mikroflödessystem tekniker som är lämpliga för forskning men inte för hög volym drogkontroll. Andra analyser som använder plattan-baserade enheter med isolerade enskilda spheroids i varje brunn är materialet konsumerar och har låg provstorlek per tillstånd. Syftet med det nuvarande protokollet är att tillhandahålla en enkel och reproducerbara biomimetiska 3D cell-baserat system för analys av invasion kapacitet i stora populationer av tumör spheroids. Vi utvecklat en 3D-modell för invasionen analys baserat på HMCA imaging plate för forskningen av tumör invasionen och anti metastaserande läkemedelsutveckling. Denna enhet möjliggör produktion av talrika enhetliga spheroids per brunn (höga provstorlek per skick) omgiven av ECM komponenter, medan kontinuerligt och samtidigt att observera och mäta spheroids enda element upplösning för medium Throughput screening av anti metastaserande droger. Denna plattform presenteras här genom uppvisande av HeLa och MCF7 spheroids för exemplifierar enskild cell och kollektiva invasion. Vi jämför påverkan av ECM komponent hyaluronsyra (HA) av kollagen som omger HeLa spheroids invasiv förmåga. Slutligen, vi introducerar Fisetin (invasion-hämmare) till HeLa spheroids och kväveoxid (NO) (invasion aktivare) till MCF7 spheroids. Resultaten analyseras av interna programvara som möjliggör halvautomatiska, enkel och snabb analys vilket underlättar multi-parameter undersökning.

Den unika HMCA imaging plate används för invasionen analysen av 3D tumör spheroids. Hela analysen, börjar med sfäroid bildandet och slutar med den invasion processen och ytterligare manipulationer, utförs inom samma platta. För sfäroid bildandet, HeLa cells läses in matris bassängen och bosätta sig i hydrogel MCs självtryck. Hydrogel MCs, som har icke-anhängare/låg bifogade egenskaper, underlätta cell cell interaktionen och bildandet av 3D tumör spheroids. <strong class="x...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array HMCA-based Plates at JoVE.com

Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array HMCA-based Plates

En HMCA-baserat imaging tallrik presenteras för invasionen analysens prestanda. Denna platta underlättar bildningen av tredimensionella (3D) tumör spheroids och mätning av cancer cell invasion in i extracellulär matrix (ECM). Invasion assay kvantifiering uppnås genom semi-automatisk analys.

Analys av Cancer Cell Invasion och anti metastaserande Drug Screening med hjälp av Hydrogel Micro-kammare Array (HMCA)-baserade plattor

Cancer metastasis is known to cause 90% of cancer lethality. Metastasis is a multistage process which initiates with the penetration/invasion of tumor ...

Målet med denna enkla reproducerbara biomimetic 3D cell-baserade systemet är att underlätta invasion kapacitet analys i stora populationen av tumör sfäroid för anti-metastaserande drog screening. Den största fördelen med vår hydrogel mikro-kammare array är att det möjliggör produktion av ett stort antal enhetliga sfäroider som befolkar samma fokalplan per brunn. Den sfäroida positionen behålls på grund av hydrogel mikro-kammare array struktur även efter extracellulära matris tillägg, underlätta noggrann kontinuerlig övervakning av sfäroiderna och invasionsprocessen.Vidare kan den morfologiska karakteriseringen och fluorescerande färgning av många sfäroider och invaderande celler utföras på plats och analyseras med en enda elementupplösning på ett tidseffektivt sätt. Demonstrera hydrogel mikro-kammare array sex-väl imaging platta produktion förfarande kommer att Maria Sobolev från vårt laboratorium. För att förbereda hydrogel mikro-kammare array plattor, först förvärma sex polydimetylsiloxan, eller PDMS, stämplar till 70 grader Celsius, och placera en sex-väl, glas-botten tallrik på ett torrt bad föruppvärmt till 75 grader Celsius i flera minuter.När plattan är varm, häll en 400-mikroliter droppe förvärmda lågsmältning agarose på botten av varje brunn av sex-väl plattan, och försiktigt placera en stämpel över varje droppe. Låt installationen svalna i fem till 10 minuter vid rumstemperatur, följt av 20 minuter vid fyra grader Celsius för full agarose gelation. När agarosen har stelnat, skala försiktigt bort PDMS från varje brunn, lämnar agarosgelerna mönstrade med mikro-kammare.Efter att UV-lampan har nått sin högsta intensitet, placera den präglade plattan i ljushärdningssystemet i tre minuter, och fyll de UV-steriliserade makrobrunnarna med steril PBS. Täck sedan plattan och linda den med Parafilm för fyra grader Celsius lagring tills den används. För att ladda cellerna, ta bort PBS från varje brunn, och försiktigt ladda 50 mikroliter av de celler av intresse ovanpå varje hydrogel array.Efter att cellerna att bosätta sig genom gravitationen i 15 minuter, tillsätt försiktigt sex till åtta alikvoter av 500 mikroliter av färskt medium till kanten av makro-väl plast botten utanför ringen och hydrogel array. Inkubera cellerna för lämplig tidsperiod vid 37 grader Celsius och 5%koldioxid med fuktighet för bildande av sfäroider. Sedan överföra sfäroiderna till en biosäkerhetshuva på is i 10 minuter.När plattan har svalnat, luta en pipett spets på kanten av makro-väl plast botten bredvid hydrogel array, och ta bort alla medium från runt arrayen. Sedan, ta bort mediet från matrisen tanken, luta en gel-lastande pipett spets på kanten av matrisen tanken mycket noggrant, var noga med att inte störa mikro-kammare och sfäroider. Därefter använder en pre-fryst, fin pipetter spets för att lägga till två alikvoter av 150 mikroliter av kollagen blandning av intresse vid kanten av matrisen en i taget, släppa blandningen långsamt för att undvika sfäroid störning.Efter den andra omgången av kollagen har lagts till varje brunn, returnera sfäroiderna till inkubatorn i en timme för full gelation av den extracellulära matrisen. När matrisen har stelnat, tillsätt 400 mikroliter av förvupp värmde 1%lågsmältande agaros ovanpå gelén, och inkubera plattan, täckt vid rumstemperatur, i fem till sju minuter, innan kylning i två minuter vid fyra grader Celsius för agarosgelering. Sedan lutar pipetten på kanten av makro-väl plast botten, försiktigt lägga till två milliliter av komplett medium till varje brunn.För att utföra en invasionsanalys, ladda hydrogel mikro-kammare array plattan på en motoriserad inverterad mikroskop skede utrustad med en 37-graders Celsius och 5%koldioxid inkubator med en befuktad atmosfär, och använda en fyra eller 10x mål att i förväg bestämma positionerna för bilden förvärv i varje brunn så att hela arrayen området kommer att bedömas. Sedan förvärva ljusa fältbilder varannan till var fjärde timmar för totalt 24 till 72 timmar för att spåra cellinvasionen från sfäroidkroppen i den omgivande extracellulära matrisen. I slutet av bildförvärvet exporterar du timelapsebilderna från bildanskaffningsprogrammet för att spara i ett taggat bildfilformat till en dedikerad mapp.Öppna sedan det grafiska användargränssnittet och klicka på Ladda ljusstarkt fält. Justera bildens segmenteringsparametrar för att uppnå en exakt segmentering av sfäroiderna och deras invasionsområden och klicka på Segmentering av region av intresse för att skapa en kantlinje runt varje sfäroid. Om den automatiska segmenteringen är felaktig trycker du på Delete eller Add och gör lämpliga korrigeringar manuellt.Klicka på Spårning om du vill numrera sfäroiderna i var och en av timelapsebilderna. Klicka sedan på Mätning för att generera ett kalkylblad med alla parametrarna, och spara kalkylarket i ett lämpligt format för databearbetning och statistisk analys. För att undersöka inverkan av hyaluronsyra på den spontana HeLa sfäroid invasionsprocessen, i detta experiment, var två dagar mognat sfäroider täckt med kollagen och hyaluronsyra blandning lösning och jämfört med två-dag-mognat sfäroider täckt med kollagen lösning ensam.Efter 50 timmars inkubation visade sfäroiderna inbäddade i kollagen och hyaluronsyra en lägre cellspridning i den omgivande extracellulära matrisen jämfört med de sfäroider inbäddade i kollagen ensam. Analys av invasionsområdets kinetik över tiden för 99 sfäroider vid enkelsfäroidupplösning visar tydligt att tillsats av hyaluronsyra till kollagenet hämmar cellspridning ut ur sfäroiden, vilket resulterar i mindre invasionsområden. Behandling av HeLa-sfäroidkulturen med en bioaktiv flavonoid med cyto- och migrastatiska egenskaper under 24 timmar resulterar i en hämmad cellspridning runt sfäroiderna jämfört med icke-behandlade HeLa-sfäroider.Faktum är att analys av invasionen områden av 488 sfäroider i slutet av experimentet visade en betydande hämning efter behandling med så lite som 10 mikromolar av läkemedlet. På grund av hydrogelens låga fästegenskaper underlättar denna mikrokammarbaserade teknik bildandet av sfäroid även i instanser av mycket få celler. Detta är särskilt fördel i värdefulla begränsad cancer stam-liknande eller patient-derived primära cell prover.Hydrogel mikro-kammare avbildningsplattan möjliggör analys av den exakta rumsliga platsen för sfäroiderna under långsiktiga experiment för utvärdering av invasionsprocessen på enelementnivå och ger en hög grad av statistisk robusthet och noggrannhet. Framtida tillämpningar av denna metodik inkluderar sida-vid-sida multi-cell odling av tumör och stromal celler i olika regioner inom makro-väl och hämtning av enskilda sfäroider för nedströms molekylär analys.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array (HMCA)-based Plates

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

Med hjälp av funktionsgenomik screening för att identifiera potentiellt ny läkemedelsmål för cancercellernas Spheroid Kulturer

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

A Model for Perineural Invasion in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

En modell för Perineural invasion i huvud- och hals Skivepitelcancer

Perineural invasion (PNI) is found in approximately 40% of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC). Despite multimodal treatment with surgery, ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Generation av High-Throughput tredimensionella tumör Spheroids för drogkontroll

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Live-Cell Imaging analyser för studien Glioblastoma hjärnan tumören Stem cellmigration och Invasion

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

3-D Cell Culture System for Studying Invasion and Evaluating Therapeutics in Bladder Cancer

3-D cellodlingssystem för att studera Invasion och utvärdera Therapeutics i Cancer i urinblåsan

Bladder cancer is a significant health problem. It is estimated that more than 16,000 people will die this year in the United States from bladder cancer. ...

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

En enkel Migration/Invasion arbetsflöde med hjälp av en automatiserad Live-cell Imager

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Läkemedelsscreening av primär patient härledd tumör Xenografts i Zebrafish

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

Impedance-based Real-time Measurement of Cancer Cell Migration and Invasion

Impedansbaserad realtidsmätning av cancercellmigration och invasion

Cancer arises due to uncontrolled proliferation of cells initiated by genetic instability, mutations, and environmental and other stress factors. These ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Utvärdera celldöd med hjälp av cellfri supernatant av probiotika i tredimensionella sfäroidkulturer av kolorektalcancerceller

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

Övervakning Cancer Cell Invasion och T-Cell cytotoxicitet i 3D-kultur

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...