Name: synthesis and structure determination of &#181;-conotoxin piiia isomers with different disulfide connectivities
Uploaded: 2018-10-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Synthesis and Structure Determination of Âµ-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities at JoVE.com

ونود أن نشكر ريسمان ألف وواو ياء ماير سوكو دال من بروكر دالتونيكس GmbH بريمن؛ دال تيتزي، تيتزي ألف ألف، شميدتس ف وتييلي جيم من جامعة دارمشتات للتكنولوجيا؛ Ohlenschläger سين من يينا FLI، م. انجيسير من جامعة بون؛ كرامر ك. وألف هارزين H. ناكاجامي من معهد ماكس بلانك لبحوث تربية النبات، كولونيا؛ سوزان نوبيرت من معهد علم الحيوان، كولونيا؛ ومرافق التحليل الطيفي الرنين المغناطيسي الجزيئية البيولوجية من جامعة فرانكفورت للتقنية الدعم والتدريب الوحدات النمطية، والوصول إلى الأدوات. هو العرفان بالدعم المالي المقدم من جامعة بون إلى D.I..

ملاحظة: جميع الأحماض الأمينية المستخدمة هنا كانت في لالتكوين. استخدمت المختصرات من الأحماض الأمينية ومشتقات الأحماض الأمينية طبقاً لتوصيات اللجنة التسميات من أيوب واللجنة المشتركة البحتة-أيوب في "مصطلحات الكيمياء الحيوية".
1-المرحلة الصلبة الببتيد التوليف (الكائنة)
<p class=...

<ol>
	<li>Fosgerau, K., Hoffmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+therapeutics:+Current+status+and+future+directions.">Peptide therapeutics: Current status and future directions.</a> Drug Discovery Today. 20 (1), 122-128 (2015).</li><li>Gongora-Ben&#237;tez, M., Tulla-Puche, J., Albericio, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifaceted+roles+of+disulfide+bonds.+peptides+as+therapeutics.">Multifaceted roles of disulfide bonds. peptides as therapeutics.</a> Chemical Reviews. 114 (2), 901-926 (2014).</li><li>Tietze, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structurally+diverse+&#181;-conotoxin+PIIIA+isomers+block+sodium+channel+NaV1.4.">Structurally diverse &#181;-conotoxin PIIIA isomers block sodium channel NaV1.4.</a> Angewandte Chemie - International Edition. 51 (17), 4058-4061 (2012).</li><li>Carstens, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-Activity+Studies+of+Cysteine-Rich+&#945;-Conotoxins+that+Inhibit+High-Voltage-Activated+Calcium+Channels+via+GABABReceptor+Activation+Reveal+a+Minimal+Functional+Motif.">Structure-Activity Studies of Cysteine-Rich &#945;-Conotoxins that Inhibit High-Voltage-Activated Calcium Channels via GABABReceptor Activation Reveal a Minimal Functional Motif.</a> Angewandte Chemie - International Edition. 55 (15), 4692-4696 (2016).</li><li>Zhang, Y., Schulten, K., Gruebele, M., Bansal, P. S., Wilson, D., Daly, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disulfide+bridges:+Bringing+together+frustrated+structure+in+a+bioactive+peptide.">Disulfide bridges: Bringing together frustrated structure in a bioactive peptide.</a> Biophysical Journal. 110 (8), 1744-1752 (2016).</li><li>Nielsen, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+structure+of+&#181;-conotoxin+PIIIA,+a+preferential+inhibitor+of+persistent+tetrodotoxin-sensitive+sodium+channels.">Solution structure of &#181;-conotoxin PIIIA, a preferential inhibitor of persistent tetrodotoxin-sensitive sodium channels.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (30), 27247-27255 (2002).</li><li>Heimer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+&#181;-Conotoxin+PIIIA+Isomers+Revisited:+Impact+of+Cysteine+Pairing+on+Disulfide-Bond+Assignment+and+Structure+Elucidation.">Conformational &#181;-Conotoxin PIIIA Isomers Revisited: Impact of Cysteine Pairing on Disulfide-Bond Assignment and Structure Elucidation.</a> Analytical Chemistry. 90 (5), 3321-3327 (2018).</li><li>Chang, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+pathways+of+oxidative+folding+of+disulfide+proteins:+Underlying+causes+and+folding+models.">Diverse pathways of oxidative folding of disulfide proteins: Underlying causes and folding models.</a> Biochemistry. 50 (17), 3414-3431 (2011).</li><li>B&#246;hm, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+insights+into+structure+and+function+of+factor+XIIIa-inhibitor+tridegin.">Novel insights into structure and function of factor XIIIa-inhibitor tridegin.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 57 (24), 10355-10365 (2014).</li><li>Postma, T. M., Albericio, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disulfide+Formation+Strategies+in+Peptide+Synthesis.">Disulfide Formation Strategies in Peptide Synthesis.</a> European Journal of Organic Chemistry. 2014 (17), 3519-3530 (2014).</li><li>Albericio, F., Isidro-llobet, A., Mercedes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+Acid-Protecting+Groups.">Amino Acid-Protecting Groups.</a> Chemical Reviews. 109 (6), 2455-2504 (2009).</li><li>Annis, I., Hargittai, B., Barany, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disulfide+bond+formation+in+peptides.">Disulfide bond formation in peptides.</a> Methods in Enzymology. 289 (1988), 198-221 (1997).</li><li>Kamber, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Synthesis+of+Cystine+Peptides+by+Iodine+Oxidation+of+S-Trityl-cysteine+and+S-Acetamidomethyl-cysteine+Peptides.">The Synthesis of Cystine Peptides by Iodine Oxidation of S-Trityl-cysteine and S-Acetamidomethyl-cysteine Peptides.</a> Helvetica Chimica Acta. 63 (4), 899-915 (1980).</li><li>Bosch, D. E., Zielinski, T., Lowery, R. G., Siderovski, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+Modulators+of+Regulator+of+G-Protein+Signaling+(RGS)+Proteins.">Evaluating Modulators of Regulator of G-Protein Signaling (RGS) Proteins.</a> Current Protocols in Pharmacology. 56 (2.8), 1-15 (2012).</li><li>Mochizuki, M., Tsuda, S., Tanimura, K., Nishiuchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regioselective+formation+of+multiple+disulfide+bonds+with+the+aid+of+postsynthetic+S-tritylation.">Regioselective formation of multiple disulfide bonds with the aid of postsynthetic S-tritylation.</a> Organic Letters. 17 (9), 2202-2205 (2015).</li><li>Peigneur, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#948;-conotoxins+synthesized+using+an+acid-cleavable+solubility+tag+approach+reveal+key+structural+determinants+for+NaV+subtype+selectivity.">&#948;-conotoxins synthesized using an acid-cleavable solubility tag approach reveal key structural determinants for NaV subtype selectivity.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (51), 35341-35350 (2014).</li><li>Heimer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Room-Temperature+Aprotic+and+Protic+Ionic+Liquids+for+Oxidative+Folding+of+Cysteine-Rich+Peptides.">Application of Room-Temperature Aprotic and Protic Ionic Liquids for Oxidative Folding of Cysteine-Rich Peptides.</a> ChemBioChem. 15 (18), 2754-2765 (2014).</li><li>Kates, S. A., Albericio, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Solid-Phase Synthesis: A Practical Guide. , (2000).</li><li>W&#252;thrich, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+studies+of+structure+and+function+of+biological+macromolecules+(Nobel+lecture).">NMR studies of structure and function of biological macromolecules (Nobel lecture).</a> Angewandte Chemie - International Edition. 42 (29), 3340-3363 (2003).</li></ol>

الطريقة الموضحة هنا لتركيب الببتيدات سيستين الغنية مثل بيييا μ يمثل إمكانية لإنتاج ايزومرات ثنائي كبريتيد المستعبدين من نفس تسلسل الأحماض الأمينية بشكل انتقائي. ولذلك، أنشأت أساليب مثل الصلبة المستندة إلى معتدلاً المرحلة الببتيد التوليف18 واستراتيجية مجموعة حماية محددة لت...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/58368/synthesis-structure-determination-conotoxin-piiia-isomers-with">Synthesis and Structure Determination of &#181;-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities</a>. The Protocol and Materials sections were updated.
Step 1.1.3 in the Protocol section was updated from:
Weigh the individual reagents (amino acids, HBTU (2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate)) according to the protocol and dissolve them in dimethylformamide (DMF) to a final concentration of 2.4 M (amino acids) and 0.6 M (HBTU), respectively.
to:
Weigh the individual reagents (amino acids, HBTU (2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate)) according to the protocol and dissolve them in dimethylformamide (DMF) to a final concentration of 0.6 M (amino acids) and 0.6 M (HBTU), respectively.
Step 1.2 in the Protocol section was updated from:
NOTE: The protocol applies to 100 mg of resin (loading: 0.28 mmol/g) added to one reaction column for 28 &#956;mol scale.
to:
NOTE: The standardized protocol usually applies to 100 mg of resin (loading: 0.53 mmol/g) added to one reaction column for 53 &#956;mol scale leading to the following equivalents: 5 eq. HBTU, 10 eq. NMM, 5 eq. amino acid. In case of PIIIA, however, a loading of 0.28 mmol/g (28 &#181;mol scale) is used, which results in the specified higher equivalents.
Step 1.2.3.1 in the Protocol section was updated from:
HBTU (450 &#181;L; 0.6 M in DMF; 270 &#181;mol; 9.6 eq.), NMM (125 &#181;L; 50% in DMF; 568 &#181;mol; 20 eq.), Fmoc-amino acid (420 &#181;L; 2.4 M in DMF; 1.01 mmol; 36 eq.).
to:
HBTU (415 &#181;L; 0.6 M in DMF; 249 &#181;mol; 9 eq.), NMM (112 &#181;L; 50% in DMF; 510 &#181;mol; 18 eq.), Fmoc-amino acid (420 &#181;L; 0.6 M in DMF; 252 &#181;mol; 9 eq.).
The first item in the Materials table was updated from:
<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fmoc Rink amide resin</td>
			<td>Novabiochem</td>
			<td>855001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
to:
<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PS PEG2000 Fmoc Rink-amide Resin</td>
			<td>Varian, Inc.</td>
			<td>PL3867-3764</td>
			<td>AmphiSpheres 40 RAM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/58368/synthesis-structure-determination-conotoxin-piiia-isomers-with">Synthesis and Structure Determination of &#181;-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities</a>. The Protocol and Materials sections were updated.

Erratum: Synthesis and Structure Determination of &#181;-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities

استخدام الببتيدات النشطة بيولوجيا في البحوث الصيدلانية والتنمية هو تقديراً كبيرا، لأنها تمثل مركبات قوية وانتقائية للغاية لأهداف بيولوجية محددة1. لما بيواكتيفيتي، هيكل ثلاثي الأبعاد غير ذات أهمية كبيرة من أجل تنفيذ الهيكل والنشاط العلاقة دراسات2،،من34. وبصرف النظر عن تسلسل الأحماض الأمينية الأساسية التي تؤثر على تكيف عموما، استقرار السندات ثنائي كبريتيد إلى حد كبير هيكل الببتيدات الغنية سيستين5. وتشمل متعددة الببتيدات سد ثنائي كبريتيد والكونوتوكسين استيفاء مثل μ-بييا من أرجواني كونوس الذي يحتوي على ستة سيستينيس التسلسل. ويسمح هذا المحتوى سيستين عالية نظرياً تشكيل 15 ثنائي كبريتيد الايزومرات. اتصال ثنائي كبريتيد الصحيحة مهم جداً لأن النشاط البيولوجي6،7. بيد أن السؤال الذي يطرح نفسه ما إذا كان هناك أكثر من تكيف النشطة بيولوجيا الببتيدات التي تحدث بشكل طبيعي، وإذا كان ذلك، الذي هذه الايزومرات يمتلك النشاط البيولوجي أعلى؟ وفي حالة μ-والكونوتوكسين استيفاء، الأهداف البيولوجية بقنوات أيون الصوديوم عن طريق بوابة الجهد، و μ-بييا على وجه الخصوص أقوى للأنواع الفرعية ناV1.2، ناV1.4 و NaV1.73.
يمكن تركيب الببتيدات سد ثنائي كبريتيد باستخدام أساليب مختلفة. الأسلوب الأكثر ملاءمة لتشكيل ثنائي كبريتيد السندات داخل ببتيد هو ما يسمى بالنهج الذاتي للطي الأكسدة. هنا، يتم تصنيعه السلائف الخطي من الببتيد دوري المطلوب أولاً باستخدام الببتيد الصلبة-مرحلة التوليف، بعد انشقاق من دعم البوليمرية يتعرض للأكسدة في نظام المخزن مؤقت. غالباً ما يتم إضافة عوامل الأكسدة النشطة مثل انخفاض والمؤكسدة الجلوتاثيون (المدفع جريازيف/جسج) تشجيع تشكيل روابط ثنائي كبريتيد. والعيب الرئيسي في دعم المخزن المؤقت الذاتي قابلة للطي أن السندات ثنائي كبريتيد تتشكل ليس انتقائيا بشكل تدريجي. الببتيد الأصلية، التي غالباً ما يوصف ايزومير ثنائي كبريتيد محدد واحد فقط، بالمقارنة مع الممكن الحصول على العديد من الايزومرات الأخرى مع هذا النهج8. وقد أثبت بالفعل μ-بييا أن يؤدي على الأقل ثلاثة ايزومرات مطوية بشكل مختلف عند طي ذاتيا في دراسة سابقة3. بدلاً من ذلك صعباً نتيجة مماثلة مرات الاحتفاظ بفصل هذه أن خليط ايزومير إذا استخدام أساليب تنقية الكروماتوغرافي9. ولذلك توليف ايزومير محددة مستهدفة مفيد. لإنتاج على وجه التحديد أيسومر مع اتصال ثنائي كبريتيد محددة، استراتيجية خاصة مطلوب في فيها سندات ثنائي كبريتيد تباعا مغلقة. ولذلك، يتم تصنيعه السلائف خطية تحمل مجموعات حماية متميزة في أزواج سيستين الفردية في دعم البوليمر. بعد القضاء على، أزواج سيستين فردياً وتباعا ديبروتيكتيد وترتبط بفعل أكسدة لإنتاج ثنائي كبريتيد المطلوب سندات10،11،،من1213، 14 , 15 , 16-بعد التوليف وتنقية المنتج رد فعل، أنه مطلوب لتأكيد الهوية والاتصال ثنائي كبريتيد بالطرق التحليلية المناسبة. وتتوفر العديد من الأساليب التحليلية لتوضيح تسلسل الأحماض الأمينية الأساسية، على سبيل المثال-، MS/MS، حين تحديد اتصال ثنائي كبريتيد لا يزال أقل بكثير من التحقيق. وبصرف النظر عن الطابع المعقد لهذه الببتيدات المستعبدين من ثنائي كبريتيد متعددة، الشوائب المتعلقة بالمنتج (على سبيل المثال.، من ثنائي كبريتيد الهرولة)، نظراً لنموذج إعداد ومتابعة أعمال يمكن أن تزيد من تعقيد التحليل. في هذه الورقة، ونحن تبين أن استخدام مزيج من التقنيات التحليلية المختلفة اللازمة لتوضيح هوية السندات ثنائي كبريتيد في ايزومرات μ-بييا لا لبس فيه. لدينا طرق الكروماتوغرافي جنبا إلى جنب مع الطيف الكتلي وقدمت نفس العينات للتحليل الطيفي الرنين المغناطيسي النووي. وفي desorption/ionization(MALDI) الليزر ساعد مصفوفة تحليل MS/MS، حددنا السندات ثنائي كبريتيد باستخدام الحد الجزئي و derivatization إيودواسيتاميدي لأنه ليس من الممكن لهذا الببتيد التحليل من أعلى إلى أسفل. 2D الرنين المغناطيسي النووي تجارب أجريت من أجل الحصول على هيكل ثلاثي الأبعاد لكل أيزومر. وهكذا، عن طريق الجمع بين أساليب تحليلية متطورة متميزة، فمن الممكن توضيح بشكل صحيح اتصال ثنائي كبريتيد وبنية ثلاثية الأبعاد معقدة متعددة الببتيدات المستعبدين من ثنائي كبريتيد7.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:979px;" width="979">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Fmoc Rink amide resin</td>
			<td style="width:185px;">Novabiochem</td>
			<td style="width:191px;">855001</td>
			<td style="width:263px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Pyr(Boc)</td>
			<td style="width:185px;">Bachem</td>
			<td style="width:191px;">A-3850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Arg(Pbf)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FSC1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Asn(Trt)</td>
			<td style="width:185px;">Bachem</td>
			<td style="width:191px;">B-1785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Asp(tBu)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FSP1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Hyp(tBu)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FAA1627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Lys(Boc)</td>
			<td style="width:185px;">Bachem</td>
			<td style="width:191px;">B-1080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Ser(tBu)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FSC1190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Gln(Trt)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FSC1043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Glu(tBu)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FSP1045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Trp(Boc)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FSC1225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Tyr(tBu)</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">47623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Thr(tBu)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FSP1210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">His(Trt)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FDP1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">8510060</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">DMF</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:191px;">D119</td>
			<td>Flammable, Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">DCM</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td>D37</td>
			<td>Carcinogenic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Piperidine</td>
			<td style="width:185px;">Alfa Aesar</td>
			<td>A12442</td>
			<td>Flammable, Toxic, Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">N-Methyl-Morpholin</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">224286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Cys(Acm)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FAA1506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Cys(Trt)</td>
			<td style="width:185px;">Bachem</td>
			<td style="width:191px;">E-2495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Cys(tBu)</td>
			<td style="width:185px;">Bachem</td>
			<td style="width:191px;">B-1220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">trifluoruacetic acid</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">74564</td>
			<td>Toxic, Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">phenol</td>
			<td style="width:185px;">Merck</td>
			<td style="width:191px;">1002060</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">thioanisol</td>
			<td style="width:185px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:191px;">A14846</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">ethanedithiol</td>
			<td style="width:185px;">Fluka Analytical</td>
			<td style="width:191px;">2390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">diethyl ether</td>
			<td style="width:185px;">VWR</td>
			<td style="width:191px;">100,921</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">tert-butanol</td>
			<td style="width:185px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:191px;">L12338</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">acetonitrile</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:191px;">A998</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">water</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:191px;">W5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">isopropanol</td>
			<td style="width:185px;">VWR</td>
			<td style="width:191px;">ACRO42383</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">sodium hydroxide</td>
			<td style="width:185px;">AppliChem</td>
			<td style="width:191px;">A6579,1000</td>
			<td>Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">iodoacetamide</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">I6125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">iodine</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">I0385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:185px;">Merck</td>
			<td style="width:191px;">110165</td>
			<td>Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">ascorbic acid</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">A4403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">diphenylsulfoxide</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">P35405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">anisol</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">96109</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">trichloromethylsilane</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">M85301</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sample dilution buffer</td>
			<td style="width:185px;">Laborservice Onken</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">sodium dihydrogen phosphate</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">106370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">disodium hydrogen phosphate</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">795410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">C4706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">citric acid</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">251275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">sodium citrate dihydrate</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">W302600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">tris-acetate</td>
			<td style="width:185px;">Carl Roth,&#160;</td>
			<td style="width:191px;">7125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">E26282&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">peptide calibration standard II</td>
			<td style="width:185px;">Bruker Daltonics GmbH</td>
			<td style="width:191px;">8222570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;"></td>
			<td style="width:185px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:185px;">Company</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">solid-phase peptide synthesizer</td>
			<td>Intavis Bioanalytical Instruments AG</td>
			<td style="width:191px;">EPS 221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:340px;">lyophilizer&#160;</td>
			<td>Martin Christ GmbH</td>
			<td style="width:191px;">&#160;Alpha 1-2 Ldplus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">semipreparative HPLC</td>
			<td>Jasco</td>
			<td style="width:191px;">system PV-987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Eurospher 100 C18 column (RP, 5 &#181;m particle size, 100 &#197; pore size, 250 x 32 mm)</td>
			<td style="width:185px;">Knauer</td>
			<td style="width:191px;">25QE181E2J</td>
			<td>purification of the linear peptide</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:340px;">Vydac 218TP1022 column (RP C18, 10 &#181;m particle size, 300 &#197; pore size, 250 x 22 mm)</td>
			<td>Hichrom-VWR</td>
			<td style="width:191px;">HICH218TP1022</td>
			<td>purification of the oxidized peptide</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:340px;">analytical HPLC&#160;</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td style="width:191px;">system LC-20AD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Vydac 218TP54 column (C18 RP, 5 &#181;m particle size, 300 &#197; pore size, 250 x 4.6 mm)&#160;</td>
			<td>Hichrom-VWR</td>
			<td style="width:191px;">HICH218TP54</td>
			<td>analytical column</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">ground steel target (MTP 384)</td>
			<td>Bruker Daltonics GmbH</td>
			<td style="width:191px;">NC0910436</td>
			<td>MALDI preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">C18-concentration filter (ZipTip)</td>
			<td style="width:185px;">Merck KGaA</td>
			<td style="width:191px;">ZTC18S096</td>
			<td>MALDI preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">MALDI mass spectrometer</td>
			<td style="width:185px;">Bruker Daltonics GmbH</td>
			<td style="width:191px;">ultraflex III TOF/TOF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">amino acid analyzer</td>
			<td>Eppendorf-Biotronik GmbH</td>
			<td style="width:191px;">LC 3000 system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">NMR spectrometer Bruker Avance III</td>
			<td>Bruker Daltonics GmbH</td>
			<td style="width:191px;">Bruker Avance III 600 MHz</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">computer program for molecular visualising</td>
			<td>YASARA Biosciences GmbH</td>
			<td style="width:191px;">Yasara structures</td>
			<td>NMR structure calculation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">computer program for MALDI data evaluation&#160;</td>
			<td>Bruker Daltonics GmbH</td>
			<td style="width:191px;">flexAnalysis, BioTools</td>
			<td>MS/MS fragmentation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">analog vortex mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td style="width:191px;">VM 3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td style="width:191px;">5410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Centrifuge</td>
			<td>Hettich</td>
			<td style="width:191px;">EBA 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Rotational vacuum concentrator</td>
			<td style="width:185px;">Christ</td>
			<td style="width:191px;">2-18 Cdplus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Analytical Balance</td>
			<td style="width:185px;">A&#38;D Instruments</td>
			<td style="width:191px;">GR-202-EC</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis and structure determination of &#181;-conotoxin piiia isomers with different disulfide connectivities

عادة ما تتأثر الببتيدات مع عدد كبير من سيستينيس فيما يتعلق بهيكل ثلاثي الأبعاد باتصال ثنائي كبريتيد بهم. أنه هكذا هو بالغ الأهمية لتجنب تشكيل السندات ثنائي كبريتيد غير مرغوب فيها أثناء التوليف الببتيد، لأن ذلك قد يؤدي في بنية ببتيد مختلفة تماما، ونتيجة لذلك تعديل بيواكتيفيتي. غير الصحيح تشكيل السندات ثنائي كبريتيد متعددة في ببتيد يصعب الحصول عليها باستخدام أساليب ذاتية قابلة للطي القياسية مثل بروتوكولات أكسدة العازلة التقليدية، لأنه يمكن أن تشكل عدة ثنائي كبريتيد connectivities. ويمثل هذا البروتوكول استراتيجية متقدمة اللازمة لتركيب الببتيدات سد ثنائي كبريتيد المتعددة التي لا يمكن تجميعها عن طريق الأكسدة العازلة عالية الجودة والكمية المستهدفة. الدراسة يوضح تطبيق استراتيجية مجموعة حماية متميزة لتوليف جميع ايزومرات الببتيد ممكن 3-ثنائي كبريتيد المستعبدين بييا μ-كونوتوكسين بطريقة هادفة. الببتيدات يعدها توليف الببتيد المرحلة الصلبة المستندة إلى معتدلاً باستخدام استراتيجية مجموعة حماية لتشكيل ثنائي كبريتيد تعريف السندات. محمية أزواج كل منها من سيستينيس مع تريتيل (حزب تاي راك تاي)، أسيتاميدوميثيل (الأسبستوس) و ثالثي-بوتيل (تيبو) حماية المجموعات للتأكد من أن ديبروتيكتيد ومرتبطة فقط حاجة سيستينيس خلال كل خطوة الأكسدة. بالإضافة إلى توليف المستهدفة، يستخدم مزيجاً من عدة أساليب تحليلية لتوضيح الصحيح للطي وإنشاء هياكل الببتيد المرجوة. المقارنة بين الايزومرات المستعبدين من ثنائي كبريتيد 3 مختلفة تشير إلى أهمية تحديد دقيق والمعرفة باتصال ثنائي كبريتيد لحساب هيكل ثلاثي الأبعاد وتفسير البيولوجية النشاط ايزومرات الببتيد. ويشمل وصف تحليلي استجلاء هذه السندات ثنائي كبريتيد الدقيق عن طريق تحليل الطيف الكتلي (MS/MS) جنبا إلى جنب التي تتم مع مشتقات جزئيا انخفاض ويؤلكل أيسومر الببتيد سليمة تنتجها بروتوكولا تكييف. وعلاوة على ذلك، يتم تحديد هياكل الببتيد استخدام 2D الرنين المغناطيسي النووي (الرنين المغناطيسي النووي) التجارب والمعارف التي تم الحصول عليها من تحليل MS/MS.

15 مختلفة سد ثنائي كبريتيد ايزومرات بييا μ-كونوتوكسين توليفها وتتميز بالتفصيل (الشكل 1). يتم تعريف السندات ثنائي كبريتيد بالحد الجزئي والتحليل اللاحق MS/MS (الشكل 2). يتم إجراء تحليل الرنين المغناطيسي ايزومرات مختلفة (الشكل 3) ل...

Watch this Scientific Journal Video about Synthesis and Structure Determination of Âµ-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities at JoVE.com

Synthesis and Structure Determination of &#181;-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities

إضعاف الببتيدات سيستين الغنية في هياكل ثلاثية الأبعاد مميزة اعتماداً على اتصال ثنائي كبريتيد. مطلوب توليف المستهدفة من ايزومرات ثنائي كبريتيد الفردية عند أكسدة العازلة لا يؤدي إلى اتصال ثنائي كبريتيد المرجوة. ويتناول البروتوكول التوليف انتقائية من الببتيدات 3-ثنائي كبريتيد المستعبدين والتحليل الهيكلي استخدام دراسات الرنين المغناطيسي النووي و MS/MS.

التوليف وتصميم هيكل الايزومرات بييا μ-كونوتوكسين مع Connectivities ثنائي كبريتيد مختلفة

Peptides with a high number of cysteines are usually influenced regarding the three-dimensional structure by their disulfide connectivity. It is thus ...

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال تخليق الببتيد مثل توليف الببتيدات الغنية بالتكفيد وتحديد نمط جسر كبريتيد المقابل لها. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بالتخلّص الانتقائي من بُتّيد ثنائي الوثّاق وخواصها الكيميائية والهيكلية اللاحقة. عموما الأفراد الجدد لهذه الطريقة سوف النضال لأن كل الببتيد الغنية كبريتيد يتصرف بشكل مختلف.قد يكون التوليف والتحليل الأمثل جزئيا لpetide الفردية أو البروتين. نقل الكواشف المذكورة في بروتوكول النص إلى السفن المقابلة ووضعها في المضارب المناسبة من المزج الببتيد المرحلة الصلبة. ثم، إضافة 100 ملليغرام من الراتنج الجاف لأعمدة رد فعل ووضعها في مضرب المزج.بدء تركيب الببتيد الصلبة المرحلة كما هو مفصل في بروتوكول النص. بعد الانتهاء من التوليف، lyophilized الراتنج بين عشية وضحاها. الآن اضمب الببتيد من الراتنج وأداء حماية عميقة من السلاسل الجانبية.للقيام بذلك الجمع بين الراتنج المجفف في أنبوب 12 ملليلتر وتبريده إلى الصفر درجة مئوية على الجليد. أولا، إضافة 150 ميكرولترات من خليط زبال، ثم إضافة ملليلتر واحد من 95٪ حمض ثلاثي الفلوراستيك لكل 100 ملليغرام من الراتنج. اترك الخليط يرتجف بلطف لمدة ثلاث ساعات في درجة حرارة الغرفة.الآن، تصفية الخليط من خلال frit الزجاج. جمع الترشيح في أنابيب، مملوءة بشكل فردي مع الإيثر ديثيل الجليد الباردة في ملليلتر واحد من خليط الانقسام لكل ثمانية إلى 10 ملليلتر من الإيثر ديثيل. الببتيد يترسب كما الصلبة البيضاء.بعد الشطف و طاردة الأنابيب كما هو موضح في بروتوكول النص، تجميد الجافة الببتيدات. لتنقية السلائف الخطية مع الكروماتوغرافيا نصف المعد إضافة ما يقرب من 70 ملليغرام من الببتيد الخام إلى أنبوب 15 ملليلتر. ثم قم بحل الببتيد الخام في 0.1٪ TFA وAcetonitrile واحد إلى واحد إلى الماء.فصل خليط الببتيد باستخدام تدرج من صفر إلى 50٪ الوينت B أكثر من 120 دقيقة بمعدل تدفق 10 ملليلتر في الدقيقة. جمع الكسور في أنابيب فردية كما تظهر وإعداد الكسور المحددة لقياس الطيف الشامل وتحليل HPLC كما هو موضح في بروتوكول النص. تجميد الجافة الكسور والجمع بين الكسور الأقران.بدء التشكيل الانتقائي للسندات كبريتيد من خلال تنفيذ الأكسدة الأولى. للقيام بذلك، قم بحل 15 ملليغرام من الببتيد الخطي المجفف بالتجميد في 105 ملليلتر من خليط ماء الإيزوبروبانول. اترك الخليط مع التحريك على الهواء في ظل الظروف الأساسية لمدة 12 إلى 48 ساعة.الإجراء أكسدة الخطوة خطوة حرجة جدا. يتم اتخاذ ضوابط رد الفعل في جميع خطوات الأكسدة الثلاث لضمان تكوين غنية بالتكفد الفردية. الأكسدة الثالثة هي الأكثر أهمية لأن الهرولة من كبريتيد يمكن أن تحدث عندما يتم تجاوز وقت التفاعل الأمثل.الآن أداء الأكسدة الثانية. تذوب 15 ملليغرام من الببتيد المجفف بالتجميد في 105 ملليلتر من ماء ايزوبروبانول ، خليط حمض الهيدروكلوريك المولر. إضافة 158 ميكرولترات من محلول اليود 0.1 المولر في الميثانول إلى الحل.يُحرّك التفاعل في درجة حرارة الغرفة حتى تكتمل الأكسدة. ثم وقف رد الفعل عن طريق إضافة 79 ميكرولترات من حمض الأسكوربيك الضرس واحد في الماء. وأخيراً إجراء الأكسدة الثالثة.حل 15 ملليغرام من الببتيد المجفف بالتجميد في 5.5 ملليلتر من TFA تحتوي على خليط زبال. عجل الببتيد في أنابيب تحتوي على الإيثر ثنائي الإيثيل البارد في ملليلتر واحد من حل التفاعل لكل ثمانية إلى عشرة ملليلترات من الإيثر ديثيل. لأداء تنقية الببتيد في 15 ملليغرام من المنتج الخام تجميد المجففة إلى أنبوب 15 ملليلتر.قم بإذابة المنتج الخام في حجم حلقة عينة HPLC باستخدام خليط من 0.1٪ TFA وواحد إلى واحد الأسيتريتريل إلى الماء. بعد دوامة حتى حل كامل، الطرد المركزي الحل من دقيقة واحدة في 3400 مرات G.Draw حتى خليط 3.6 ملليلتر في حقنة 5 ملليلتر وحقن العينة دون أي فقاعات الهواء في حلقة الحقن. بدء الحقن في نظام HPLC.تنقية خليط الببتيد باستخدام تدرج من صفر إلى 50٪ الوينت B أكثر من 120 دقيقة بمعدل تدفق 10 ملليلتر في الدقيقة. جمع الكسور في أنابيب الفردية كما تظهر. بعد اكتمال التشغيل، قم بإعداد الكسور المحددة لتحليل MS و HPLC كما هو موضح في النص.تجميد الجافة جميع الكسور وتخزينها في ناقص 20 درجة مئوية. لتنفيذ HPLC التحليلية, نقل عينات من الكسور الببتيد أو عناصر التحكم في التفاعل في قارورة HPLC وتذوب في خليط من 0.1٪ TFA في واحد إلى واحد الأسيتريتريل إلى الماء. ضع قارورة HPLC في العينات التلقائية للمرحلة التحليلية التي تم تعيينها HPLC لضخ 250 ميكرولترات من كل عينة.استخدام نظام الانحدار elution من 0.1 ٪ TFA في الماء كما Eluent A في 0.1 ٪ TFA في الأسيتونتريل كما الوينت B.تحليل الببتيد باستخدام تدرج من 10 ٪ إلى 40 ٪ Eluent B أكثر من 30 دقيقة بمعدل تدفق 1.0 ملليلتر في الدقيقة. لإجراء تحليل الأحماض الأمينية، نقل 100 ميكروغرام من الببتيد النقي إلى أنبوب 1.5 ملليلتر أجهزة الطرد المركزي الصغيرة وحل المسحوق في 200 ميكرولترات من ستة مولور HCL. بعد نقل الحل إلى أمبول زجاجي ، أغلق أمبول عن طريق تسخين الرقبة بهب ونسخ bunsen.ثم ضع أنبوب زجاجي يحمل أمبول في كتلة التدفئة لمدة 24 ساعة في 110 درجة مئوية للتحلل. بعد 24 ساعة، افتح أمبول ونقل المحلول إلى أنبوب جهاز طرد مركزي صغير ميليلتر. الطرد المركزي الحل لمدة ست ساعات في ستين درجة مئوية و 210 مرات G في فراغ التناوب المكثف.ثم قم بحل المنتج المتحلل في 192 ميكرولترات من العازلة التخفيف العينة ونقل الحل إلى مرشح الطرد المركزي الجزئي. بعد الطرد المركزي للعينة لمدة دقيقة واحدة في 2300 مرات G، نقل 100 ميكرولترات من الترشيح إلى أنبوب عينة تحليل الأحماض الأمينية. ضع الأنبوب في محلل الأحماض الأمينية وابدأ التحليل.وخلال هذا البروتوكول السابق للحد من التحلل، من الأهمية بمكان أن تتخذ عدة ضوابط رد فعل من أجل الحصول على مرتين أو أربع مرات الأنواع الميثيلات الكابا التي لا غنى عنها لتحليل كبريتيد لاحقا عن طريق قياس الطيف الشامل. أول حل 600 ميكروغرام من الببتيد النقي في 1.2 ملليلتر من 0.05 عازلة citrate ضرس تحتوي على TCEP. احتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة أخذ عدة 100 ميكرولتر عينات التحكم في التفاعل تتراوح بين صفر إلى 30 دقيقة.اخلط العينات في أنبوب أجهزة طرد مركزي صغير 1.5 ملليلتر مع 300 ميكرولترات من عازلة الألكيل لوقف التفاعل وإجراء ميثيل الكربونيل لمجموعات الثيول الحرة. وقف رد الفعل بعد خمس دقائق عن طريق إضافة 100 ميكرولترات من 10٪ TFA والمياه وتخزين العينات على الجليد الجاف. الآن تنفيذ HPLC على العينات كما هو مفصل في بروتوكول النص.نقل كمية صغيرة من كل كسر تم جمعها إلى أنبوب أجهزة طرد مركزي صغيرة 1.5 ملليلتر لتحليل MS/MS للأشكال المؤكدة. قم بحل الببتيد المتبقي في 0.1٪ TFA في الماء وإضافة حجم مناسب على 100 ميل TCEP 10 ملليمولار للحصول على تركيز TCEP النهائي من 10 ملليمولار. عند هذه النقطة، يمكن فحص الألكيلية السيستين انتقائية عن طريق تسلسل الببتيد.مع الببتيدات اثنين في الوسط، وتحديد نمط جسر ثنائي الكبريتيد ممكن. يتم إجراء تحليل NMR من الأيزومرات المختلفة للكشف عن هياكل الببتيد الفردية. وتظهر الهياكل العشرين ذات الطاقات الدنيا وكذلك الربط بالتكريد من الأيزومرات المختلفة.وتجدر الإشارة إلى أن الجمع بين تجزئة HPLC MS/MS وتحليل الـ NMR في المرحلة المعكوسة مطلوب لتحديد اتصال ثنائي الكبريتيد بشكل لا لبس فيه. أوضحت المقارنة بين قيمة الانحراف التربيعي لقيمة الجذر أن الببتيد الجامد يؤدي في الغالب إلى بنية NMR محسّلة. هذا الفيديو يجب أن تعطيك مثالا كيفية توليف انتقائي الببتيدات مع نمط السندات ثاني كبريتيد المطلوب.كما يظهر إمكانية التحقق من الاتصال الصحيح بالفكريد عن طريق قياس الطيف الكتلي الطري والحصول على بنية ثلاثية الأبعاد عن طريق التحليل الطيفي للـ NMR. بعد تطورها، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال تخليق الببتيد لاستكشاف أهمية أنماط السندات من ثاني كبريتيد للهيكل ثلاثي الأبعاد وبالتالي نشاط أيزومرات الببتيد هذه. بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل ASAS النشاط من أجل الحصول على نظرة ثاقبة في علاقات نشاط هيكل من ايزومرات الببتيد المختلفة في الهدف البيولوجي المحدد.على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة في تركيب وتحليل كونوكسيثان، فإنه يمكن أيضا أن تطبق على غيرها من الببتيدات جسر كبريتيد والبروتينات مثل fenzens، السموم الحيوانية الغنية بالكبريتيد وغيرها من الجزيئات التي تحتوي على السيستين المتعددة.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Organic Chemistry

Chemistry

Unit 1

Stereoisomerism

SCIENTISTS IN ACTION

Production of Disulfide-stabilized Transmembrane Peptide Complexes for Structural Studies

إنتاج ثاني كبريتيد استقرت مجمعات الببتيد عبر الغشاء الدراسات الإنشائية

Physical  interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane  proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane ...

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox ...

From Constructs to Crystals &#8211; Towards Structure Determination of &#946;-barrel Outer Membrane Proteins

من التركيبات لبلورات - نحو تحديد هيكل β برميل الخارجي بروتينات الغشاء

Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% ...

X-ray Powder Diffraction in Conservation Science: Towards Routine Crystal Structure Determination of Corrosion Products on Heritage Art Objects

حيود الأشعة السينية مسحوق في علوم الحفظ: نحو روتيني البنية البلورية تحديد التآكل المنتجات على كائنات التراث الفن

The crystal structure determination and refinement process of corrosion products on historic art objects using laboratory high-resolution X-ray powder ...

Synthesis and Characterization of Fe-doped Aluminosilicate Nanotubes with Enhanced Electron Conductive Properties

توليف وتوصيف مخدر الحديد ألومينوسيليكات الأنابيب النانوية مع خصائص موصل الكترون المحسن

The goal of the protocol is to synthesize Fe-doped aluminosilicate nanotubes of the imogolite type with the formula (OH)3Al2-xFexO3SiOH. Doping with Fe ...

Probing the Structure and Dynamics of Interfacial Water with Scanning Tunneling Microscopy and Spectroscopy

سبر بنية وديناميات مياه السطح البيني مع مسح نفق مجهر والتحليل الطيفي

Water/solid interfaces are ubiquitous and play a key role in many environmental, biophysical, and technological processes. Resolving the internal ...

Fabricating High-viscosity Droplets using Microfluidic Capillary Device with Phase-inversion Co-flow Structure

اختﻻق قطرات اللزوجة عالية باستخدام "جهاز الشعرية موائع جزيئية" مع "هيكل تدفق" المشارك عكس المرحلة

The generation of monodisperse droplets with high viscosity has always been a challenge in droplet microfluidics. Here, we demonstrate a phase-inversion ...

Synthesis of Substrate-Bound Au Nanowires Via an Active Surface Growth Mechanism

تركيب أسلاك الاتحاد الأفريقي الركازة زمنياً عبر إليه نمو نشط السطح

Advancing synthetic capabilities is important for the development of nanoscience and nanotechnology. The synthesis of nanowires has always been a ...

Synthesis of Graphene Nanofluids with Controllable Flake Size Distributions

تركيب نانوفلويدات الجرافين مع توزيعات حجم رقائق يمكن التحكم فيها

A method for synthesizing graphene nanofluids with controllable flake size distributions is presented. Graphene nanoflakes can be obtained by the ...

Organic Structure-directing Agent-free Synthesis for *BEA-type Zeolite Membrane

الهيكل العضوي توجيه وكيل خالية من التوليف ل * BEA من نوع غشاء زيوليت

Membrane separation has drawn attention as a novel-energy saving separation process. Zeolite membranes have great potential for hydrocarbon separation in ...