Name: synthesis and structure determination of &#181;-conotoxin piiia isomers with different disulfide connectivities
Uploaded: 2018-10-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Synthesis and Structure Determination of Âµ-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities at JoVE.com

우리는 A. Resemann, F. J. 메이어, 관련 브루 GmbH 브레멘;에서 D. Suckau 감사 하 고 싶습니다. D. Tietze, A. A. Tietze, V. Schmidts 및 C. Thiele 다름슈타트 기술 대학교; FLI 예 나, 본의 대학에서 M. Engeser에서에서 O. Ohlenschläger K. Kramer, A. Harzen, 및 식물 번 식 연구, 쾰른;의 막스 플랑크 연구소에서 H. 仲 동물학, 쾰른; 연구소에서 수잔 Neupert 그리고 바이오 자기 공명 분광학의 시설 프랑크푸르트의 대학 기술에 대 한 지원, 교육 모듈, 악기에 대 한 액세스. 알았다면 하 본의 대학에 의해 재정 지원은 기꺼이 인정 했다.

참고: 여기서 사용 하는 모든 아미노산 L-구성에 있었다. 아미노산 및 아미노산 유도체의 약어 IUB의 전문 어 위원회 및 생 화 확 적인 전문 어에 IUPAC IUB 합동 위원회의 권장 사항에 따라 사용 되었다.
1. 단단한 단계 펩 티 드 합성 (SPPS)
참고: 단단한 단계 펩 티 드 합성기와 합성을 수행. ZRLCCGFOKSCRSRQCKOHRCC-NH2 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) 화학에 대 한 표?...

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방법 여기에 설명 된 시스테인 부유한 펩 티 드의 합성에 대 한 같은 µ-PIIIA 동일한 아미노산 시퀀스에서 이황화 결합이 성체를 선택적으로 생산 하는 가능성을 나타냅니다. 그러므로, Fmoc 기반 솔리드 같은 펩 티 드 합성18 단계 고 이황화 결합의 regioselective 형성에 대 한 정의 된 보호 그룹 전략 사용된16설립. 단단한 단계 펩 티 드 합성 자동된 합성을 통해 폴리?...

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Step 1.1.3 in the Protocol section was updated from:
Weigh the individual reagents (amino acids, HBTU (2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate)) according to the protocol and dissolve them in dimethylformamide (DMF) to a final concentration of 2.4 M (amino acids) and 0.6 M (HBTU), respectively.
to:
Weigh the individual reagents (amino acids, HBTU (2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate)) according to the protocol and dissolve them in dimethylformamide (DMF) to a final concentration of 0.6 M (amino acids) and 0.6 M (HBTU), respectively.
Step 1.2 in the Protocol section was updated from:
NOTE: The protocol applies to 100 mg of resin (loading: 0.28 mmol/g) added to one reaction column for 28 &#956;mol scale.
to:
NOTE: The standardized protocol usually applies to 100 mg of resin (loading: 0.53 mmol/g) added to one reaction column for 53 &#956;mol scale leading to the following equivalents: 5 eq. HBTU, 10 eq. NMM, 5 eq. amino acid. In case of PIIIA, however, a loading of 0.28 mmol/g (28 &#181;mol scale) is used, which results in the specified higher equivalents.
Step 1.2.3.1 in the Protocol section was updated from:
HBTU (450 &#181;L; 0.6 M in DMF; 270 &#181;mol; 9.6 eq.), NMM (125 &#181;L; 50% in DMF; 568 &#181;mol; 20 eq.), Fmoc-amino acid (420 &#181;L; 2.4 M in DMF; 1.01 mmol; 36 eq.).
to:
HBTU (415 &#181;L; 0.6 M in DMF; 249 &#181;mol; 9 eq.), NMM (112 &#181;L; 50% in DMF; 510 &#181;mol; 18 eq.), Fmoc-amino acid (420 &#181;L; 0.6 M in DMF; 252 &#181;mol; 9 eq.).
The first item in the Materials table was updated from:
<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fmoc Rink amide resin</td>
			<td>Novabiochem</td>
			<td>855001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
to:
<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PS PEG2000 Fmoc Rink-amide Resin</td>
			<td>Varian, Inc.</td>
			<td>PL3867-3764</td>
			<td>AmphiSpheres 40 RAM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

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Erratum: Synthesis and Structure Determination of &#181;-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities

제약 연구 및 개발에 생리 활성 펩 티 드를 사용 하 여 매우 그들은 특정 생물 학적 목표1에 대 한 강력 하 고 매우 선택적인 화합물을 대표 하기 때문에, 인식 된다. 그러나 그들의 bioactivity에 대 한, 3 차원 구조는 중요성의 구조 활동 관계 연구2,,34를 수행 하려면. 전체 구조에 영향을 미치는 기본 아미노산 시퀀스, 떨어져 이황화 결합 크게 시스테인 부유한 펩 티 드5의 구조를 안정화 합니다. 여러 개의 이황화 다리 펩 티 드 conotoxins µ-PIIIA의 순서로 6 시스테인 포함 Conus purpurascens 에서 같은 포함 됩니다. 이 높은 시스테인 콘텐츠는 이론적으로 15 이황화가 성체의 대형을 허용 한다. 올바른 이황화 연결 생물 학적 활동6,7에 대 한 매우 중요 하다. 그러나, 발생 하는 문제는 자연스럽 게 발생 펩 티 드의 경우, 그이 성체 중 가장 높은 생물 학적 활동을가지고 더 이상의 생리 구조 인지? Μ-conotoxins의 경우 생물 학적 목표 전압 개폐 나트륨 이온 채널, 그리고 μ-PIIIA 특히 하위 나V1.2, 나에 대 한 가장 강력한V1.4와 NaV1.73.
다양 한 방법을 사용 하 여 이황화 다리 펩 티 드의 종합을 얻을 수 있습니다. 펩 티 드 내의 이황화 결합의 대형을 위한 가장 편리한 방법은 소위 산화 자체 접는 방법입니다. 여기, 원하는 주기적인 펩 티 드의 선형 전조 먼저 고분자 지원에서 분열 산화 버퍼 시스템에 들어서는 후 단단한 단계 펩 티 드 종합을 사용 하 여 합성 됩니다. 감소와 산화 glutathione (GSH/GSSG) 같은 산화 활성 에이전트는 종종 이황화 결합의 형성을 촉진에 추가 됩니다. 폴딩 자체 버퍼 지원의 주요 단점은 이황화 결합 stepwise 방식에서 선택적으로 형성 하지는. 종종 하나의 특정 이황화 이성질체 설명, 네이티브 펩 티 드에 비해이 방법은8수많은 다른이 성체를 가능 하다. Μ-PIIIA 이미 적어도 3 개의 다르게 접힌된이 성체 자체는 이전 연구3폴딩 시에 결과를 보였다. 이러한 이성질체 혼합물의 분리는 컬럼에 정화 방법9을 사용 하는 경우 비슷한 보존 시간으로 인해 오히려 어렵습니다. 특정 이성질체의 타겟된 합성은 따라서 유리 하다. 정의 된 이황화 연결, 특별 한 전략으로 이성질체는 이황화는 채권에 필요한 구체적으로 생산 하는 연속적으로 닫힌다. 따라서, 개별 시스테인 쌍에 개별 보호 그룹을 들고 선형 전조 폴리머 지원에 합성 됩니다. 후 제거, 시스테인 쌍 개별적으로 연속적으로 deprotected 고 원하는 이황화 채권10,,1112,13, 를 생성 하는 산화 반응에 연결 14 , 15 , 16. 합성 반응 제품의 정화 후에, id 및 이황화 연결 확인에 필요한 적합 한 분석 방법. 수많은 분석 방법 기본 아미노산 순서, 예의 설명에 사용할 수 있습니다., MS/MS, 아 황산 연결의 결정 아직도 훨씬 적은 조사 남아 있는 동안. 이러한 여러 개의 이황화 결합 펩 티 드, 제품 관련 불순물의 복잡성은 그렇다 하 고 (예., 이황화 출 격에서), 때문에 샘플 준비 및 작업 업 수 더 복잡 하 게 분석. 이 논문에서는, 우리는 다른 분석 기술 조합의 사용은 명백 하 게 μ-PIIIA이 성체의 이황화 결합의 정체성을 명확히 하는 데 필요한 표시 됩니다. 우리 크로마 방법 질량 분석으로 결합 하 고 NMR 분광학에 동일한 샘플 제공. 매트릭스 보조 레이저 desorption/ionization(MALDI) MS/MS 분석, 우리는 불가능 하기 때문에 하향식 분석이 펩 티이 드에 대 한 부분적인 감소 및 iodoacetamide derivatization를 사용 하 여 이황화 채권 확인. 2 차원 NMR 실험은 각이 성체의 3 차원 구조를 얻기 위하여 수행 했다. 따라서, 결합 하 여 독특한 정교한 분석 방법, 그것은 명료 하 게 제대로 이황화 연결 및 복잡 한 3 차원 구조의 여러 이황화 결합 펩 티 드7수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:979px;" width="979">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Fmoc Rink amide resin</td>
			<td style="width:185px;">Novabiochem</td>
			<td style="width:191px;">855001</td>
			<td style="width:263px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Pyr(Boc)</td>
			<td style="width:185px;">Bachem</td>
			<td style="width:191px;">A-3850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Arg(Pbf)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FSC1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Asn(Trt)</td>
			<td style="width:185px;">Bachem</td>
			<td style="width:191px;">B-1785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Asp(tBu)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FSP1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Hyp(tBu)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FAA1627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Lys(Boc)</td>
			<td style="width:185px;">Bachem</td>
			<td style="width:191px;">B-1080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Ser(tBu)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FSC1190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Gln(Trt)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FSC1043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Glu(tBu)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FSP1045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Trp(Boc)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FSC1225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Tyr(tBu)</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">47623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Thr(tBu)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FSP1210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">His(Trt)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FDP1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">8510060</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">DMF</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:191px;">D119</td>
			<td>Flammable, Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">DCM</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td>D37</td>
			<td>Carcinogenic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Piperidine</td>
			<td style="width:185px;">Alfa Aesar</td>
			<td>A12442</td>
			<td>Flammable, Toxic, Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">N-Methyl-Morpholin</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">224286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Cys(Acm)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FAA1506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Cys(Trt)</td>
			<td style="width:185px;">Bachem</td>
			<td style="width:191px;">E-2495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Cys(tBu)</td>
			<td style="width:185px;">Bachem</td>
			<td style="width:191px;">B-1220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">trifluoruacetic acid</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">74564</td>
			<td>Toxic, Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">phenol</td>
			<td style="width:185px;">Merck</td>
			<td style="width:191px;">1002060</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">thioanisol</td>
			<td style="width:185px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:191px;">A14846</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">ethanedithiol</td>
			<td style="width:185px;">Fluka Analytical</td>
			<td style="width:191px;">2390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">diethyl ether</td>
			<td style="width:185px;">VWR</td>
			<td style="width:191px;">100,921</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">tert-butanol</td>
			<td style="width:185px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:191px;">L12338</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">acetonitrile</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:191px;">A998</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">water</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:191px;">W5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">isopropanol</td>
			<td style="width:185px;">VWR</td>
			<td style="width:191px;">ACRO42383</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">sodium hydroxide</td>
			<td style="width:185px;">AppliChem</td>
			<td style="width:191px;">A6579,1000</td>
			<td>Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">iodoacetamide</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">I6125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">iodine</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">I0385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:185px;">Merck</td>
			<td style="width:191px;">110165</td>
			<td>Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">ascorbic acid</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">A4403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">diphenylsulfoxide</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">P35405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">anisol</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">96109</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">trichloromethylsilane</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">M85301</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sample dilution buffer</td>
			<td style="width:185px;">Laborservice Onken</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">sodium dihydrogen phosphate</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">106370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">disodium hydrogen phosphate</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">795410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">C4706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">citric acid</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">251275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">sodium citrate dihydrate</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">W302600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">tris-acetate</td>
			<td style="width:185px;">Carl Roth,&#160;</td>
			<td style="width:191px;">7125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">E26282&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">peptide calibration standard II</td>
			<td style="width:185px;">Bruker Daltonics GmbH</td>
			<td style="width:191px;">8222570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;"></td>
			<td style="width:185px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:185px;">Company</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">solid-phase peptide synthesizer</td>
			<td>Intavis Bioanalytical Instruments AG</td>
			<td style="width:191px;">EPS 221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:340px;">lyophilizer&#160;</td>
			<td>Martin Christ GmbH</td>
			<td style="width:191px;">&#160;Alpha 1-2 Ldplus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">semipreparative HPLC</td>
			<td>Jasco</td>
			<td style="width:191px;">system PV-987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Eurospher 100 C18 column (RP, 5 &#181;m particle size, 100 &#197; pore size, 250 x 32 mm)</td>
			<td style="width:185px;">Knauer</td>
			<td style="width:191px;">25QE181E2J</td>
			<td>purification of the linear peptide</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:340px;">Vydac 218TP1022 column (RP C18, 10 &#181;m particle size, 300 &#197; pore size, 250 x 22 mm)</td>
			<td>Hichrom-VWR</td>
			<td style="width:191px;">HICH218TP1022</td>
			<td>purification of the oxidized peptide</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:340px;">analytical HPLC&#160;</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td style="width:191px;">system LC-20AD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Vydac 218TP54 column (C18 RP, 5 &#181;m particle size, 300 &#197; pore size, 250 x 4.6 mm)&#160;</td>
			<td>Hichrom-VWR</td>
			<td style="width:191px;">HICH218TP54</td>
			<td>analytical column</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">ground steel target (MTP 384)</td>
			<td>Bruker Daltonics GmbH</td>
			<td style="width:191px;">NC0910436</td>
			<td>MALDI preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">C18-concentration filter (ZipTip)</td>
			<td style="width:185px;">Merck KGaA</td>
			<td style="width:191px;">ZTC18S096</td>
			<td>MALDI preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">MALDI mass spectrometer</td>
			<td style="width:185px;">Bruker Daltonics GmbH</td>
			<td style="width:191px;">ultraflex III TOF/TOF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">amino acid analyzer</td>
			<td>Eppendorf-Biotronik GmbH</td>
			<td style="width:191px;">LC 3000 system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">NMR spectrometer Bruker Avance III</td>
			<td>Bruker Daltonics GmbH</td>
			<td style="width:191px;">Bruker Avance III 600 MHz</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">computer program for molecular visualising</td>
			<td>YASARA Biosciences GmbH</td>
			<td style="width:191px;">Yasara structures</td>
			<td>NMR structure calculation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">computer program for MALDI data evaluation&#160;</td>
			<td>Bruker Daltonics GmbH</td>
			<td style="width:191px;">flexAnalysis, BioTools</td>
			<td>MS/MS fragmentation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">analog vortex mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td style="width:191px;">VM 3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td style="width:191px;">5410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Centrifuge</td>
			<td>Hettich</td>
			<td style="width:191px;">EBA 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Rotational vacuum concentrator</td>
			<td style="width:185px;">Christ</td>
			<td style="width:191px;">2-18 Cdplus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Analytical Balance</td>
			<td style="width:185px;">A&#38;D Instruments</td>
			<td style="width:191px;">GR-202-EC</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis and structure determination of &#181;-conotoxin piiia isomers with different disulfide connectivities

펩 티 드 시스테인의 높은 숫자는 일반적으로 영향을 3 차원 구조에 관한 그들의 이황화 연결. 따라서 펩 티 드 종합, 동안 원치 않는 이황화 유대 형성을 피하기 위해 매우 중요 한 완전히 다른 펩 티 드 구조 될 수 있기 때문에 고 따라서 bioactivity를 변경. 그러나, 여러 개의 이황화 결합 펩 티 드의 올바른 형성 여러 이황화 연결 형성 될 수 있기 때문에 기존의 버퍼 산화 프로토콜 등 표준 자체 접는 방법을 사용 하 여 얻을 수 어렵습니다. 이 프로토콜은 여러 개의 이황화 다리 펩 티 드의 높은 품질과 수량에 버퍼 산화를 통해 종합 될 수 없는 어떤 대상된 합성에 필요한 고급 전략을 나타냅니다. 연구 타겟 방식에서 µ-conotoxin PIIIA의 모든 가능한 3 이황화 결합 펩 티 드가 성체의 합성에 대 한 뚜렷한 보호 그룹 전략의 응용 프로그램을 보여 줍니다. 펩 티 드 Fmoc 기반 단단한 단계 펩 티 드 종합 보호 그룹 전략을 사용 하 여 정의 된 이황화 결합 형성에 대 한에 의해 준비가 되어 있습니다. 시스테인의 각각 쌍 trityl (Trt), acetamidomethyl (Acm)와 tert보호-있는지 확인 하는 모든 산화 단계 동안 필요한 시스테인은 deprotected 연결 그룹 부 틸 (t부) 보호. 대상된 종합 뿐만 아니라 여러 분석 방법의 조합이 올바른 병풍을 원하는 펩 티 드 구조의 세대를 명확 하 게 사용 됩니다. 다른 3 이황화 결합이 성체의 비교가 나타냅니다 이황화 연결의 3 차원 구조 계산 및 생물학의 해석에 대 한 지식과 정확한 결정의 중요성 펩 티 드가 성체의 활동입니다. 분석 특성 포함 적응된 프로토콜을 제작한 그대로 펩 티 드가 성체의 부분적으로 감소 하 고 alkylated 파생 상품으로 수행 되는 탠덤 질량 분석 (MS/MS) 분석을 통해 정확한 이황화 본드 설명 합니다. 또한, 펩 티 드 구조는 2 차원 핵 자기 공명 (NMR) 실험 및 MS/MS 분석에서 얻은 지식을 사용 하 여 결정 됩니다.

다른이 15 µ-conotoxin PIIIA 이황화 다리 성체는 종합 하 고 자세히 (그림 1) 특징. 이황화 결합은 부분적인 감소 및 이후 MS/MS 분석 (그림 2)에 의해 식별 됩니다. 다른이 성체의 NMR 분석 (그림 3) 개별 펩 티 드 구조를 나타내기 위해 수행 됩니다. 특히, 라인란트 HPLC, MS/MS 조각화 및 NMR 분석의 결합은 아 황산 연결...

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Synthesis and Structure Determination of &#181;-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities

시스테인 부유한 펩 티 드 그들의 이황화 연결에 따라 고유한 3 차원 구조로 접어. 개별 이황화가 성체의 타겟된 합성 필요한 때 버퍼 산화 원하는 이황화 연결 리드 하지 않습니다. 프로토콜 선택 합성 펩 티 드 3 이황화 결합 그리고 NMR 및 MS/MS를 사용 하 여 그들의 구조 분석을 다루고 있다.

합성 및 다른 아 황산 연결 된 μ-Conotoxin PIIIA이 성체의 구조 결정

Peptides with a high number of cysteines are usually influenced regarding the three-dimensional structure by their disulfide connectivity. It is thus ...

이 방법은 디설파이드 풍부한 펩티드를 합성하고 해당 이황화물 교량 패턴을 결정하는 것과 같은 펩티드 합성 분야에서 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있다. 이 기술의 주요 장점은 상이한 이황화물 본드 엔드 펩타이드 이소머스와 후속 화학 및 구조적 특성의 선택적 합성을 허용한다는 것입니다. 일반적으로 이 방법에 새로운 개인 각 이황파이드 풍부한 펩티드는 다르게 행동하기 때문에 투쟁할 것입니다.합성 및 분석은 개별 펩타이드 또는 단백질에 부분적으로 최적화되어야 할 수도 있다. 텍스트 프로토콜에 나열된 시약을 해당 용기로 옮기고 고체 위상 펩타이드 신디사이저의 적절한 라켓에 배치한다. 그런 다음 반응 컬럼에 100 밀리그램의 마른 수지를 추가하고 신디사이저의 라켓에 넣습니다.텍스트 프로토콜에 상세한 대로 고형 펩티드 합성을 시작합니다. 합성이 완료된 후, 하룻밤 동안 수지를 lyophilized. 이제 수지에서 펩티드를 갈라서 측면 사슬의 깊은 보호를 수행합니다.이렇게하려면 12 밀리 리터 튜브에 말린 수지와 얼음에 섭씨 0도로 냉각합니다. 먼저, 150 마이크로리터를 스캐빈저 혼합물을 추가한 다음 수지 100밀리그램당 95%의 트리플루오로아세트산 1밀리리터를 추가합니다. 혼합물을 실온에서 3시간 동안 부드럽게 흔들어 둡니다.이제 유리 프릿을 통해 혼합물을 필터링합니다. 디틸 에테르 8~10밀리리터당 골짜기 혼합물 1밀리리터에서 얼음-차가운 디틸 에테르로 개별적으로 채워진 튜브의 여과물을 수집합니다. 펩타이드는 백색 고체로서 침전됩니다.텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 튜브를 헹구고 원심분리한 후 펩티드를 동결건조시한다. 반 전구체를 반 전구체로 정화하기 위해 15 밀리리터 튜브에 약 70 밀리그램의 조펩티드를 첨가한다. 그런 다음 원유 펩티드를 0.1%TFA및 일대일 아세토닐릴로 용해하여 물에 녹입니다.분당 10 밀리리터의 유량으로 120분 이상 0~50%의 Eluent B의 그라데이션을 사용하여 펩티드 혼합물을 분리한다. 개별 튜브의 분획을 수집하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 질량 분광및 HPLC 분석을 위해 선택한 분획을 준비합니다. 분획을 동결건조하고 피어 분획을 결합합니다.첫 번째 산화를 수행하여 이황화물 결합의 선택적 형성을 시작합니다. 이렇게하려면 동결 건조 선형 펩타이드 15 밀리그램을 이소프로판올 물 혼합물의 105 밀리리터에 녹입니다. 12~48시간 동안 기본 조건하에서 혼합물을 공기 에 둡니다.단계별 산화 절차는 매우 중요합니다. 반응 제어는 개별 이황화증이 풍부한 형성을 보장하기 위해 세 가지 산화 단계에서 모두 촬영됩니다. 제 3 산화는 최적의 반응 시간을 초과할 때 이황화물 스크램블링이 발생할 수 있기 때문에 가장 중요합니다.이제 두 번째 산화를 수행합니다. 동결 건조 펩타이드 15밀리그램을 이소프로판올 물 105밀리리터, 1개의 어금니 염산 혼합물에 녹입니다. 0.1 개의 어금니 요오드 용액의 158 마이크로 리터를 메탄올에 추가합니다.산화가 완료될 때까지 실온에서 반응을 저어줍니다. 그런 다음 물에 하나의 어금니 아스코르브 산의 79 마이크로 리터를 추가하여 반응을 중지합니다. 마지막으로 세 번째 산화를 수행합니다.폐기제 혼합물을 함유한 TFA의 5.5 밀리리터에 동결 건조 펩티드 15밀리그램을 녹입니다. 펩티드를 디틸 에테르 8~10밀리리터당 1밀리리터의 반응 용액에서 차가운 디틸 에테르를 함유한 튜브로 침전시한다. 15 밀리리터 튜브에 동결 건조 된 원유 제품의 15 밀리그램에서 펩티드 정제를 수행합니다.0.1%TFA와 1대 1의 아세토나이트를 물에 혼합하여 HPLC 샘플 루프의 부피에서 원유 제품을 용해하십시오. 완전한 용해될 때까지 소용돌이를 피한 후, 원심분리기는 3400배G.에서 1분에서 3.6 밀리리터 혼합물을 5 밀리리터 주사기로 끌어올려 주입 루프에 기포없이 샘플을 주입한다. HPLC 시스템에 주입을 시작합니다.분당 10 밀리리터의 유량으로 120분 이상 0~50%의 Eluent B의 그라데이션을 사용하여 펩티드 혼합물을 정화합니다. 개별 튜브의 분획을 수집합니다. 실행이 완료되면 텍스트에 설명된 대로 MS 및 HPLC 분석에 대해 선택한 분수를 준비합니다.모든 분획을 동결건조하고 영하 20도에 보관하십시오. 분석 HPLC를 수행하기 위해 펩티드 분획 또는 반응 컨트롤의 샘플을 HPLC 바이알로 전송하고 1 대 1 의 아세토나이트에 0.1 %TFA의 혼합물에 용해하십시오. 각 샘플의 250 마이크로리터를 주입하도록 설정된 분석 역위 HPLC세트의 자동 샘플러에 HPLC 바이알을 배치합니다.Eluent B.as Acetonitrile에서 0.1%TFA로 물에 0.1%TFA의 그라데이션 용출 시스템을 사용 하 여 10%에서 40%의 기울기를 사용하여 펩티드를 분당 1.0 밀리리터의 유량으로 30분 이상 분석한다. 아미노산 분석을 수행하기 위해 순수 펩타이드 100마이크로그램을 1.5밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기고 6개의 어금니 HCL의 200마이크로리터에 분말을 용해한다. 용액을 유리 앰뮬레로 옮은 후, 분젠 버너 불꽃으로 목을 가열하여 앰펠을 닫습니다.그런 다음 암페어를 가열 블록에 담근 유리 튜브를 가수 분해를 위해 섭씨 110도에서 24 시간 동안 가열 블록에 놓습니다. 24시간 후 앰프를 열고 용액을 2밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브로 옮킨다. 원심 분리는 섭씨 60도에서 6시간, 회전 진공 농축기에서 210배 G로 솔루션을 제공합니다.그런 다음 샘플링된 희석 버퍼의 192마이크로리터에서 가수분해된 제품을 용해하고 용액을 마이크로 원심 필터로 옮킨다. 2300회 G에서 1분 동안 시료를 원심분리한 후, 100마이크로리터의 여과를 아미노산 분석 샘플 튜브로 옮긴다. 튜브를 아미노산 분석기에 넣고 분석을 시작합니다.이 과거 환원 프로토콜 동안, 대량 분석법을 통해 후속 디황화 분석에 필수적인 카파 미도 메틸화 종을 두 번 또는 4배 획득하기 위해 여러 반응 조절을 하는 것이 중요합니다. 먼저 TCEP를 함유한 0.05 개의 해선화 완충제의 1.2 밀리리터에 순수 펩티드 600 마이크로그램을 용해합니다. 0에서 30 분에 이르는 몇 가지 100 마이크로 리터 반응 제어 샘플을 복용 실온에서 혼합물을 배양.1.5 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 300 마이크로리터의 알킬화 버퍼에 샘플을 혼합하여 반응을 멈추고 무료 티올 그룹의 카보닐 메틸화를 수행합니다. 10%TFA와 물의 100 마이크로리터를 추가하여 5분 후에 반응을 멈추고 샘플을 드라이 아이스에 저장합니다. 이제 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 샘플에서 HPLC를 수행합니다.산화 된 형태의 MS / MS 분석을 위해 1.5 밀리리터 미세 원심 분리 튜브로 수집 된 각 분획의 소량을 전송합니다. 남은 펩티드를 물에 0.1%TFA로 녹이고 100밀리머 TCEP 용액에 적절한 부피를 추가하여 최종 TCEP 농도10 밀리머를 얻습니다. 이 시점에서, 선택적 시스테인 알킬레이션은 펩타이드 시퀀싱을 통해 확인할 수 있다.중간에 두 펩티드를 사용하면 이황화물 교량 패턴의 결정이 가능합니다. 상이한 이소종의 NMR 분석은 개별 펩티드 구조를 드러내기 위해 수행된다. 에너지가 가장 낮은 20개의 구조물과 다른 이소마의 이황화 연결이 표시됩니다.특히, 이황화 연결의 명확한 식별을 위해 반전 단계 HPLC MS/MS 단편화 및 NMR 분석의 조합이 필요합니다. 루트 평균 제곱 편차 값의 비교는 강성 펩타이드가 주로 더 나은 NMR 구조로 이어진다는 것을 명확히 했다. 이 비디오는 당신에게 원하는 이황화물 결합 패턴으로 펩티드를 선택적으로 합성하는 방법을 예를 제공해야합니다.또한 부드러운 질량 분광법을 통해 올바른 이황화 연결을 확인하고 NMR 분광법을 통해 3차원 구조를 얻을 수 있는 가능성을 보여줍니다. 개발 후, 이 기술은 펩티드 합성 분야의 연구자들이 3차원 구조에 대한 이황화물 결합 패턴의 중요성을 탐구하고 결과적으로 이러한 펩티드 이소머스의 활성을 탐구하는 길을 열어주었다. 이 절차에 이어, 활성 ASAS와 같은 다른 방법은 특정 생물학적 표적에서 상이한 펩타이드 이소머스의 구조 활성 관계에 대한 통찰력을 얻기 위해 수행될 수 있다.이 방법은 코노톡신의 합성 및 분석에 대한 통찰력을 제공 할 수 있지만, 또한 펜젠, 이황파이드 풍부한 동물 독소 및 분자를 포함하는 다른 다중 시스테인과 같은 다른 디설파이드 브리지 펩티드 및 단백질에 적용 될 수있다.

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Synthesis of Graphene Nanofluids with Controllable Flake Size Distributions

제어 가능한 플레이크 크기 분포를 가진 그래 핀 나노 유체의 합성

A method for synthesizing graphene nanofluids with controllable flake size distributions is presented. Graphene nanoflakes can be obtained by the ...

Organic Structure-directing Agent-free Synthesis for *BEA-type Zeolite Membrane

유기 구조 지시 에이전트 무료 합성 *BEA 형 제올라이트 멤브레인

Membrane separation has drawn attention as a novel-energy saving separation process. Zeolite membranes have great potential for hydrocarbon separation in ...