Name: synthesis and structure determination of &#181;-conotoxin piiia isomers with different disulfide connectivities
Uploaded: 2018-10-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Synthesis and Structure Determination of Âµ-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities at JoVE.com

A. Resemann, F. J. Mayer ve ö. Suckau Bruker Daltonics GmbH Bremen dan teşekkür etmek istiyorum; Ö Tietze, A. A. Tietze, V. Schmidts ve C. Thiele Darmstadt Teknoloji Üniversitesi üzerinden; FLI Jena, M. Engeser Bonn Üniversitesi üzerinden O. Ohlenschläger; K. Kramer, A. Harzen ve H. Nakagami dan bitki ıslahı araştırmaları, Köln Max Planck Enstitüsü; Susanne Neupert Zooloji, Köln Enstitüsü'nden; ve biyomoleküler manyetik rezonans spektroskopi Frankfurt Üniversitesi için imkanlar teknik desteği, modüller, eğitim ve aletleri için erişim. University of Bonn için Dedektif tarafından mali destek minnetle kabul edilmektedir.

Not: Burada kullanılan tüm amino asit L-yapılandırmada vardı. Kısaltmalar amino asitleri ve amino asit türevleri IUB adlandırma Komitesi ve biyokimyasal adlandırma IUPAC-IUB Ortak Komisyonu önerileri göre kullanılmıştır.
1. katı faz peptid sentez (SPP'ler)
Not: Bir katı fazlı peptid synthesizer ile sentezi yürütmek. Genel sıra ZRLCCGFOKSCRSRQCKOHRCC-NH2 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) Kimya için standart bir protokol kullanarak do?...

<ol>
	<li>Fosgerau, K., Hoffmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+therapeutics:+Current+status+and+future+directions.">Peptide therapeutics: Current status and future directions.</a> Drug Discovery Today. 20 (1), 122-128 (2015).</li><li>Gongora-Ben&#237;tez, M., Tulla-Puche, J., Albericio, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifaceted+roles+of+disulfide+bonds.+peptides+as+therapeutics.">Multifaceted roles of disulfide bonds. peptides as therapeutics.</a> Chemical Reviews. 114 (2), 901-926 (2014).</li><li>Tietze, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structurally+diverse+&#181;-conotoxin+PIIIA+isomers+block+sodium+channel+NaV1.4.">Structurally diverse &#181;-conotoxin PIIIA isomers block sodium channel NaV1.4.</a> Angewandte Chemie - International Edition. 51 (17), 4058-4061 (2012).</li><li>Carstens, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-Activity+Studies+of+Cysteine-Rich+&#945;-Conotoxins+that+Inhibit+High-Voltage-Activated+Calcium+Channels+via+GABABReceptor+Activation+Reveal+a+Minimal+Functional+Motif.">Structure-Activity Studies of Cysteine-Rich &#945;-Conotoxins that Inhibit High-Voltage-Activated Calcium Channels via GABABReceptor Activation Reveal a Minimal Functional Motif.</a> Angewandte Chemie - International Edition. 55 (15), 4692-4696 (2016).</li><li>Zhang, Y., Schulten, K., Gruebele, M., Bansal, P. S., Wilson, D., Daly, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disulfide+bridges:+Bringing+together+frustrated+structure+in+a+bioactive+peptide.">Disulfide bridges: Bringing together frustrated structure in a bioactive peptide.</a> Biophysical Journal. 110 (8), 1744-1752 (2016).</li><li>Nielsen, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+structure+of+&#181;-conotoxin+PIIIA,+a+preferential+inhibitor+of+persistent+tetrodotoxin-sensitive+sodium+channels.">Solution structure of &#181;-conotoxin PIIIA, a preferential inhibitor of persistent tetrodotoxin-sensitive sodium channels.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (30), 27247-27255 (2002).</li><li>Heimer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+&#181;-Conotoxin+PIIIA+Isomers+Revisited:+Impact+of+Cysteine+Pairing+on+Disulfide-Bond+Assignment+and+Structure+Elucidation.">Conformational &#181;-Conotoxin PIIIA Isomers Revisited: Impact of Cysteine Pairing on Disulfide-Bond Assignment and Structure Elucidation.</a> Analytical Chemistry. 90 (5), 3321-3327 (2018).</li><li>Chang, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+pathways+of+oxidative+folding+of+disulfide+proteins:+Underlying+causes+and+folding+models.">Diverse pathways of oxidative folding of disulfide proteins: Underlying causes and folding models.</a> Biochemistry. 50 (17), 3414-3431 (2011).</li><li>B&#246;hm, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+insights+into+structure+and+function+of+factor+XIIIa-inhibitor+tridegin.">Novel insights into structure and function of factor XIIIa-inhibitor tridegin.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 57 (24), 10355-10365 (2014).</li><li>Postma, T. M., Albericio, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disulfide+Formation+Strategies+in+Peptide+Synthesis.">Disulfide Formation Strategies in Peptide Synthesis.</a> European Journal of Organic Chemistry. 2014 (17), 3519-3530 (2014).</li><li>Albericio, F., Isidro-llobet, A., Mercedes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+Acid-Protecting+Groups.">Amino Acid-Protecting Groups.</a> Chemical Reviews. 109 (6), 2455-2504 (2009).</li><li>Annis, I., Hargittai, B., Barany, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disulfide+bond+formation+in+peptides.">Disulfide bond formation in peptides.</a> Methods in Enzymology. 289 (1988), 198-221 (1997).</li><li>Kamber, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Synthesis+of+Cystine+Peptides+by+Iodine+Oxidation+of+S-Trityl-cysteine+and+S-Acetamidomethyl-cysteine+Peptides.">The Synthesis of Cystine Peptides by Iodine Oxidation of S-Trityl-cysteine and S-Acetamidomethyl-cysteine Peptides.</a> Helvetica Chimica Acta. 63 (4), 899-915 (1980).</li><li>Bosch, D. E., Zielinski, T., Lowery, R. G., Siderovski, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+Modulators+of+Regulator+of+G-Protein+Signaling+(RGS)+Proteins.">Evaluating Modulators of Regulator of G-Protein Signaling (RGS) Proteins.</a> Current Protocols in Pharmacology. 56 (2.8), 1-15 (2012).</li><li>Mochizuki, M., Tsuda, S., Tanimura, K., Nishiuchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regioselective+formation+of+multiple+disulfide+bonds+with+the+aid+of+postsynthetic+S-tritylation.">Regioselective formation of multiple disulfide bonds with the aid of postsynthetic S-tritylation.</a> Organic Letters. 17 (9), 2202-2205 (2015).</li><li>Peigneur, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#948;-conotoxins+synthesized+using+an+acid-cleavable+solubility+tag+approach+reveal+key+structural+determinants+for+NaV+subtype+selectivity.">&#948;-conotoxins synthesized using an acid-cleavable solubility tag approach reveal key structural determinants for NaV subtype selectivity.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (51), 35341-35350 (2014).</li><li>Heimer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Room-Temperature+Aprotic+and+Protic+Ionic+Liquids+for+Oxidative+Folding+of+Cysteine-Rich+Peptides.">Application of Room-Temperature Aprotic and Protic Ionic Liquids for Oxidative Folding of Cysteine-Rich Peptides.</a> ChemBioChem. 15 (18), 2754-2765 (2014).</li><li>Kates, S. A., Albericio, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Solid-Phase Synthesis: A Practical Guide. , (2000).</li><li>W&#252;thrich, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+studies+of+structure+and+function+of+biological+macromolecules+(Nobel+lecture).">NMR studies of structure and function of biological macromolecules (Nobel lecture).</a> Angewandte Chemie - International Edition. 42 (29), 3340-3363 (2003).</li></ol>

Μ-PIIIA seçerek disülfür bağ izomerler aynı amino asit dizisi üzerinden üretmek için bir olasılık temsil eder gibi sistein-zengin peptidler sentezi için burada açıklanan yöntemi. Bu nedenle, Fmoc tabanlı düz gibi yöntemleri peptid sentez18 faz ve disülfür bağları regioselective oluşumu için tanımlanmış bir koruma grubu strateji edildi kullanılan16kurdu. Katı faz peptid sentez otomatik sentezi ile polimer destek (reçine) amino asit dizileri üre...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/58368/synthesis-structure-determination-conotoxin-piiia-isomers-with">Synthesis and Structure Determination of &#181;-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities</a>. The Protocol and Materials sections were updated.
Step 1.1.3 in the Protocol section was updated from:
Weigh the individual reagents (amino acids, HBTU (2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate)) according to the protocol and dissolve them in dimethylformamide (DMF) to a final concentration of 2.4 M (amino acids) and 0.6 M (HBTU), respectively.
to:
Weigh the individual reagents (amino acids, HBTU (2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate)) according to the protocol and dissolve them in dimethylformamide (DMF) to a final concentration of 0.6 M (amino acids) and 0.6 M (HBTU), respectively.
Step 1.2 in the Protocol section was updated from:
NOTE: The protocol applies to 100 mg of resin (loading: 0.28 mmol/g) added to one reaction column for 28 &#956;mol scale.
to:
NOTE: The standardized protocol usually applies to 100 mg of resin (loading: 0.53 mmol/g) added to one reaction column for 53 &#956;mol scale leading to the following equivalents: 5 eq. HBTU, 10 eq. NMM, 5 eq. amino acid. In case of PIIIA, however, a loading of 0.28 mmol/g (28 &#181;mol scale) is used, which results in the specified higher equivalents.
Step 1.2.3.1 in the Protocol section was updated from:
HBTU (450 &#181;L; 0.6 M in DMF; 270 &#181;mol; 9.6 eq.), NMM (125 &#181;L; 50% in DMF; 568 &#181;mol; 20 eq.), Fmoc-amino acid (420 &#181;L; 2.4 M in DMF; 1.01 mmol; 36 eq.).
to:
HBTU (415 &#181;L; 0.6 M in DMF; 249 &#181;mol; 9 eq.), NMM (112 &#181;L; 50% in DMF; 510 &#181;mol; 18 eq.), Fmoc-amino acid (420 &#181;L; 0.6 M in DMF; 252 &#181;mol; 9 eq.).
The first item in the Materials table was updated from:
<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fmoc Rink amide resin</td>
			<td>Novabiochem</td>
			<td>855001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
to:
<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PS PEG2000 Fmoc Rink-amide Resin</td>
			<td>Varian, Inc.</td>
			<td>PL3867-3764</td>
			<td>AmphiSpheres 40 RAM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/58368/synthesis-structure-determination-conotoxin-piiia-isomers-with">Synthesis and Structure Determination of &#181;-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities</a>. The Protocol and Materials sections were updated.

Erratum: Synthesis and Structure Determination of &#181;-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities

Biyolojik hedefler1için güçlü ve çok seçici bileşikleri gösterdiğinden ilaç araştırma ve geliştirme biyoaktif peptidler kullanımı son derece kabul edilmektedir. Kendi bioactivity için ancak, üç boyutlu yapısı yapısı-faaliyet ilişki çalışmaları2,3,4gerçekleştirmek için büyük önem taşıyor. Genel uyum etkileyen birincil amino asit dizini dışında disülfür bağları önemli ölçüde sistein-zengin peptidler5yapısını stabilize. Birden çok disülfür köprü peptidler µ-PIIIA altı katıldı onun sırayla içeren Conus purpurascens üzerinden gibi conotoxins içerir. Bu yüksek sistein içerik teorik olarak 15 disülfür izomerler oluşumunu sağlar. Doğru disülfür bağlantı biyolojik aktivitesi6,7için çok önemlidir. Ancak, doğal olarak meydana gelen peptidler ve bu yüzden, bu izomerler hangisinin en yüksek biyolojik aktivitesi sahiptir Eğer birden fazla biyoaktif biçimi olup doğar soru nedir? Μ-conotoxins söz konusu olduğunda, biyolojik hedefler voltaj kapılı Sodyum iyon kanalları ve μ-PIIIA özellikle için alt NaV1.2, Na en güçlüV1.4 ve NaV1.73.
Disülfür köprü peptidler sentezi çeşitli yöntemler kullanılarak elde edilebilir. Disülfür bağları bir peptid içinde oluşumu için en uygun yöntem olarak adlandırılan oksidatif kendi kendine katlanır yaklaşımdır. Burada, istenen döngüsel peptid doğrusal habercisi ilk bölünme polimer destek oksidasyon bir tampon sistemi tabi sonra olan katı fazlı peptid sentez kullanarak sentezlenir. Redoks aktif ajanlar azaltılmış ve okside glutatyon (GSH/GSSG) gibi sık sık disülfür bağları oluşumu tanıtmak için eklenir. Arabellek desteklenen kendi kendine katlama ana dezavantajı disülfür bağları seçmeli olarak kademeli bir biçimde oluşturulur değil olmasıdır. Kendisi için çoğunlukla belirli tek disülfit izomer tanımlanır, yerel peptid için karşılaştırıldığında bu yaklaşım8ile çok sayıda izomerler elde etmek mümkündür. Μ-PIIIA zaten bir önceki çalışmada3' te kendi kendine katlanır üzerine en az üç farklı şekilde katlanmış izomerler neden olduğu gösterilmiştir. Böyle bir izomer karışımı ayrılması kromatografik arıtma yöntemleri9kullanıyorsanız benzer saklama kez nedeniyle oldukça zordur. Belirli bir izomer hedeflenen sentezi bu nedenle avantajlıdır. Özellikle hangi disülfür bağları bir izomer ile tanımlanmış disülfür connectivity, özel bir strateji gerekli üretmek için sırayla kapalı. Bu nedenle, farklı koruma grupları bireysel sistein çiftleri taşıyan doğrusal habercisi polimer destek sentezlenir. Eleme sonra sistein çiftleri ayrı ayrı ve sırayla deprotected ve istenen disülfür bağları10,11,12,13, vermeye bir oksidasyon reaksiyonu bağlı 14 , 15 , 16. bir sentez ve reaksiyon ürünü arıtma sonra bu kimliği ve disülfür bağlantı onaylamak için uygun analitik yöntemler tarafından gerekli. Çok sayıda analitik yöntemleri birincil amino asit dizisi, e.gaydınlatma için kullanılabilir., MS/MS, disülfür bağlantı belirlenmesi hala daha az incelenen kalırken. Böyle birden çok disülfür bağ peptidler, ürünle ilgili yabancı maddelerin karmaşıklığı dışında (Örneğin., disülfür çabalıyorlar üzerinden), örnek nedeniyle hazırlık ve iş-up daha fazla analiz karmaşık hale getirebilir. Bu yazıda, farklı analitik teknikleri bir arada kullanımı tümden µ-PIIIA izomerler disülfür bağları kimliğini açıklamak için gerekli olduğunu göstereceğiz. Biz kromatografik yöntemler kütle spektrometresi ile kombine ve NMR spektroskopisi için aynı örnekleri verilmektedir. Matris yardımlı lazer desorption/ionization(MALDI) MS/MS analiz, biz yukarıdan aşağıya doğru analiz için bu peptid mümkün değildir çünkü kısmi azaltma ve iodoacetamide derivatization kullanarak disülfür bağları tespit. 2D NMR deneyler her izomer üç boyutlu yapısını elde etmek için yapıldı. Böylece, farklı karmaşık analitik yöntemleri birleştirerek, bu düzgün disülfür bağlantı ve karmaşık üç boyutlu yapısı birden çok disülfür bağ peptidler7aydınlatmak mümkündür.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:979px;" width="979">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Fmoc Rink amide resin</td>
			<td style="width:185px;">Novabiochem</td>
			<td style="width:191px;">855001</td>
			<td style="width:263px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Pyr(Boc)</td>
			<td style="width:185px;">Bachem</td>
			<td style="width:191px;">A-3850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Arg(Pbf)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FSC1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Asn(Trt)</td>
			<td style="width:185px;">Bachem</td>
			<td style="width:191px;">B-1785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Asp(tBu)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FSP1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Hyp(tBu)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FAA1627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Lys(Boc)</td>
			<td style="width:185px;">Bachem</td>
			<td style="width:191px;">B-1080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Ser(tBu)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FSC1190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Gln(Trt)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FSC1043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Glu(tBu)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FSP1045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Trp(Boc)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FSC1225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Tyr(tBu)</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">47623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Thr(tBu)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FSP1210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">His(Trt)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FDP1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">8510060</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">DMF</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:191px;">D119</td>
			<td>Flammable, Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">DCM</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td>D37</td>
			<td>Carcinogenic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Piperidine</td>
			<td style="width:185px;">Alfa Aesar</td>
			<td>A12442</td>
			<td>Flammable, Toxic, Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">N-Methyl-Morpholin</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">224286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Cys(Acm)</td>
			<td style="width:185px;">Iris Biotech</td>
			<td style="width:191px;">FAA1506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Cys(Trt)</td>
			<td style="width:185px;">Bachem</td>
			<td style="width:191px;">E-2495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Cys(tBu)</td>
			<td style="width:185px;">Bachem</td>
			<td style="width:191px;">B-1220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">trifluoruacetic acid</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">74564</td>
			<td>Toxic, Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">phenol</td>
			<td style="width:185px;">Merck</td>
			<td style="width:191px;">1002060</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">thioanisol</td>
			<td style="width:185px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:191px;">A14846</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">ethanedithiol</td>
			<td style="width:185px;">Fluka Analytical</td>
			<td style="width:191px;">2390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">diethyl ether</td>
			<td style="width:185px;">VWR</td>
			<td style="width:191px;">100,921</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">tert-butanol</td>
			<td style="width:185px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:191px;">L12338</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">acetonitrile</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:191px;">A998</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">water</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:191px;">W5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">isopropanol</td>
			<td style="width:185px;">VWR</td>
			<td style="width:191px;">ACRO42383</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">sodium hydroxide</td>
			<td style="width:185px;">AppliChem</td>
			<td style="width:191px;">A6579,1000</td>
			<td>Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">iodoacetamide</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">I6125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">iodine</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">I0385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:185px;">Merck</td>
			<td style="width:191px;">110165</td>
			<td>Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">ascorbic acid</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">A4403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">diphenylsulfoxide</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">P35405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">anisol</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">96109</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">trichloromethylsilane</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">M85301</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sample dilution buffer</td>
			<td style="width:185px;">Laborservice Onken</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">sodium dihydrogen phosphate</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">106370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">disodium hydrogen phosphate</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">795410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">C4706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">citric acid</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">251275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">sodium citrate dihydrate</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">W302600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">tris-acetate</td>
			<td style="width:185px;">Carl Roth,&#160;</td>
			<td style="width:191px;">7125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">E26282&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">peptide calibration standard II</td>
			<td style="width:185px;">Bruker Daltonics GmbH</td>
			<td style="width:191px;">8222570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;"></td>
			<td style="width:185px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:185px;">Company</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">solid-phase peptide synthesizer</td>
			<td>Intavis Bioanalytical Instruments AG</td>
			<td style="width:191px;">EPS 221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:340px;">lyophilizer&#160;</td>
			<td>Martin Christ GmbH</td>
			<td style="width:191px;">&#160;Alpha 1-2 Ldplus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">semipreparative HPLC</td>
			<td>Jasco</td>
			<td style="width:191px;">system PV-987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Eurospher 100 C18 column (RP, 5 &#181;m particle size, 100 &#197; pore size, 250 x 32 mm)</td>
			<td style="width:185px;">Knauer</td>
			<td style="width:191px;">25QE181E2J</td>
			<td>purification of the linear peptide</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:340px;">Vydac 218TP1022 column (RP C18, 10 &#181;m particle size, 300 &#197; pore size, 250 x 22 mm)</td>
			<td>Hichrom-VWR</td>
			<td style="width:191px;">HICH218TP1022</td>
			<td>purification of the oxidized peptide</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:340px;">analytical HPLC&#160;</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td style="width:191px;">system LC-20AD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Vydac 218TP54 column (C18 RP, 5 &#181;m particle size, 300 &#197; pore size, 250 x 4.6 mm)&#160;</td>
			<td>Hichrom-VWR</td>
			<td style="width:191px;">HICH218TP54</td>
			<td>analytical column</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">ground steel target (MTP 384)</td>
			<td>Bruker Daltonics GmbH</td>
			<td style="width:191px;">NC0910436</td>
			<td>MALDI preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">C18-concentration filter (ZipTip)</td>
			<td style="width:185px;">Merck KGaA</td>
			<td style="width:191px;">ZTC18S096</td>
			<td>MALDI preparation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">MALDI mass spectrometer</td>
			<td style="width:185px;">Bruker Daltonics GmbH</td>
			<td style="width:191px;">ultraflex III TOF/TOF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">amino acid analyzer</td>
			<td>Eppendorf-Biotronik GmbH</td>
			<td style="width:191px;">LC 3000 system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">NMR spectrometer Bruker Avance III</td>
			<td>Bruker Daltonics GmbH</td>
			<td style="width:191px;">Bruker Avance III 600 MHz</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">computer program for molecular visualising</td>
			<td>YASARA Biosciences GmbH</td>
			<td style="width:191px;">Yasara structures</td>
			<td>NMR structure calculation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">computer program for MALDI data evaluation&#160;</td>
			<td>Bruker Daltonics GmbH</td>
			<td style="width:191px;">flexAnalysis, BioTools</td>
			<td>MS/MS fragmentation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">analog vortex mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td style="width:191px;">VM 3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td style="width:191px;">5410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Centrifuge</td>
			<td>Hettich</td>
			<td style="width:191px;">EBA 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Rotational vacuum concentrator</td>
			<td style="width:185px;">Christ</td>
			<td style="width:191px;">2-18 Cdplus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Analytical Balance</td>
			<td style="width:185px;">A&#38;D Instruments</td>
			<td style="width:191px;">GR-202-EC</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis and structure determination of &#181;-conotoxin piiia isomers with different disulfide connectivities

Peptidler katıldı yüksek sayıda genellikle üç boyutlu yapısı ile ilgili olarak onların disülfür bağlantısı tarafından etkilenmiştir. Bu tamamen farklı peptid yapısında neden olabilir çünkü böylece istenmeyen disülfit bağı oluşumu sırasında peptid sentez, önlemek son derece önemlidir ve sonuç olarak bioactivity değişmiş. Ancak, birden çok disülfür bağları bir peptid içinde doğru oluşumu birkaç disülfür connectivities oluşturulması mümkündür çünkü geleneksel arabellek oksidasyon iletişim kuralları gibi standart kendi kendine katlama yöntemleri kullanarak elde etmek zordur. Bu iletişim kuralının gelişmiş bir strateji hangi arabellek oksidasyon yüksek kalite ve miktar üzerinden sentezlenmiş değil birden fazla disülfür köprü peptidler hedeflenen sentezi için gerekli temsil etmektedir. Çalışma uygulamasının bir stratejinin farklı koruma grubu µ-conotoxin PIIIA, tüm olası peptid 3 disülfür bağ izomerler sentezi için hedeflenen bir şekilde gösterir. Peptidler tanımlanmış disülfit bağı oluşumu için bir koruma grubu strateji kullanarak katı faz Fmoc tabanlı peptid sentez tarafından hazırlanır. Katıldı ilgili çift trityl (Trt), acetamidomethyl (Acm) ve tertile korunmaktadır-bütil (tBu) koruma grupları her oksidasyon adımı sırasında yalnızca gerekli katıldı deprotected bağlı ve emin olmak için. Hedeflenen sentez yanı sıra çeşitli analitik yöntemlerin bileşimini doğru katlanır ve istenen peptit yapılarının üretimi açıklamak için kullanılır. Farklı 3 disülfür bağ izomerler karşılaştırılması disülfür bağlantısı üç boyutlu yapısı hesaplanması için ve biyolojik yorumlanması için bilgi ve doğru belirlenmesi önemi gösterir peptid izomerler faaliyet. Analitik karakterizasyonu adapte bir iletişim kuralı tarafından üretilen sağlam peptid izomer kısmen azaltılmış ve alkylated türevleri ile gerçekleştirilen tandem kütle spektrometresi (MS/MS) analizi ile tam disülfür bağ aydınlatma içerir. Ayrıca, peptit yapılarının 2D nükleer manyetik rezonans (NMR) deneyleri ve MS/MS analizinden elde edilen bilgi kullanılarak belirlenir.

15 farklı disülfür köprü izomerler µ-conotoxin PIIIA, sentez ve ayrıntılı olarak (Şekil 1) ile karakterizedir. Disülfür bağları kısmi azaltma ve daha sonraki MS/MS Analiz (Şekil 2) tarafından tanımlanır. Farklı izomerler NMR Analizi (bireysel peptid yapıları ortaya çıkarmak içinŞekil 3) yapılır. Özellikle, RP HPLC, MS/MS parçalanma ve NMR Analizi bir arada disülfür ba?...

Watch this Scientific Journal Video about Synthesis and Structure Determination of Âµ-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities at JoVE.com

Synthesis and Structure Determination of &#181;-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities

Sistein-zengin peptidler onların disülfür bağlantısı bağlı olarak farklı üç boyutlu yapılar içine katlayın. Arabellek oksidasyon istenen disülfür bağlantı yol değil tek tek disülfit izomerler hedeflenen sentezi gereklidir. Protokol ile 3 disülfür bağ peptidler ve NMR ve MS/MS çalışmaları kullanarak onların yapısal analiz sentez seçici fırsatlar.

Sentez ve μ-Conotoxin PIIIA izomerler farklı disülfür Connectivities ile yapı belirlenmesi

Peptides with a high number of cysteines are usually influenced regarding the three-dimensional structure by their disulfide connectivity. It is thus ...

Bu yöntem, disülfür zengin peptidlerin sentezlenmesi ve buna karşılık gelen disülfür köprü deseninin belirlenmesi gibi peptid sentezi alanındaki temel soruların yanıtlandırılmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, farklı disülfür bondend peptid izomerlerinin seçici sentezine ve sonraki kimyasal ve yapısal karakterizasyonuna olanak sağlamasıdır. Her disülfür zengin peptid farklı davrandığını, çünkü genellikle bireylerin bu yönteme yeni mücadele edecek.Sentez ve analiz kısmen bireysel peptid veya protein için optimize edilmesi gerekebilir. Metin protokolünde listelenen reaktifleri ilgili damarlara aktarın ve katı faz peptid sentezleyicisinin uygun raketlerine yerleştirin. Daha sonra reaksiyon sütunlarına 100 miligram kuru rezorin ekleyin ve sentezleyicinin raketine koyun.Metin protokolünde ayrıntılı olarak katı faz peptid sentezini başlatın. Sentez tamamlandıktan sonra, bir gecede resenin liyofilize. Şimdi reçinden peptid cleave ve yan zincirleri derin koruma gerçekleştirmek.Bunu yapmak için kurutulmuş resini 12 mililitrelik bir tüpte birleştirin ve buz üzerinde sıfır santigrat dereceye kadar soğutun. İlk olarak, bir çöpçü karışımı 150 mikrolitre ekleyin, sonra reçin 100 miligram başına% 95 trifloroasetik asit bir mililitre ekleyin. Karışımı oda sıcaklığında üç saat hafifçe sallayarak bırakın.Şimdi, karışımı cam frit'ten süzün. Sekiz ila 10 mililitre dietil eter başına bir mililitre dekolte karışımında buz gibi dietil eterle ayrı ayrı doldurulan tüplerdeki filtratları toplayın. Peptit beyaz bir katı olarak çökelti.Metin protokolünde açıklandığı gibi tüpleri durulayıp santrifüj ettikten sonra peptidleri dondurun-kurulayın. Yarı preparatif kromatografi ile doğrusal öncül arındırmak için 15 mililitrelik bir tüp ham peptit yaklaşık 70 miligram ekleyin. Sonra su için% 0.1 TFA ve bire bir Asetonitil ham peptid eritin.Dakikada 10 mililitre lik bir akış hızında 120 dakika içinde sıfır ila %50 Eluent B degradesi kullanarak peptit karışımını ayırın. Metin protokolünde açıklandığı gibi kütle spektrometresi ve HPLC analizi için seçilen kesirleri hazırlayın ve göründükleri gibi tek tek tüplerdeki kesirleri toplayın. Kesirleri dondurun-kurulayın ve eş kesirlerini birleştirin.İlk oksidasyonu gerçekleştirerek disülfür bağlarının seçici oluşumunu başlatın. Bunu yapmak için, bir isopropanol su karışımı 105 mililitre dondurularak kurutulmuş lineer peptid 15 miligram çözün. Karışımı temel koşullar altında havada 12-48 saat bekletin.Adım adım oksidasyon prosedürü çok önemlidir. Reaksiyon kontrolleri bireysel disülfür zengin oluşumunu sağlamak için her üç oksidasyon adımda alınır. Üçüncü oksidasyon en önemli olandır, çünkü en uygun reaksiyon süresi aşıldığında disülfür karıştırma oluşabilir.Şimdi ikinci oksidasyonu gerçekleştirin. Bir isopropanol su, bir azı hidroklorik asit karışımı 105 mililitre dondurularak kurutulmuş peptid 15 miligram çözün. Çözeltiye metanolde 0,1 molar iyot çözeltisi 158 mikrolitre ekleyin.Oksidasyon tamamlanana kadar oda sıcaklığında reaksiyonu karıştırın. Daha sonra suya bir azı azı lı askorbik asit79 mikrolitre ekleyerek reaksiyonu durdurun. Son olarak üçüncü oksidasyonu gerçekleştirin.Bir çöpçü karışımı içeren TFA 5,5 mililitre dondurulmuş kurutulmuş peptit 15 miligram çözünür. Diethyl eter sekiz ila on mililitre başına reaksiyon çözeltisi bir mililitre soğuk dietil eter içeren tüpler içine peptid çökeltmek. 15 mililitrelik bir tüp için dondurulmuş ham ürün 15 miligram peptit arıtma gerçekleştirmek için.Ham ürünü % 0,1 TFA ve suya bire bir Asetonitil karışımı nı kullanarak HPLC numune halkasının hacminde çözün. Tam çözünme kadar girdap sonra, 3400 kez G.5 mililitreşşile 3.6 mililitrekarışımı çizin ve enjeksiyon döngüsü içine herhangi bir hava kabarcıkları olmadan örnek enjekte bir dakikadan çözelti santrifüj. HPLC sistemine enjeksiyonuyguluyoruz.Dakikada 10 mililitre lik bir akış hızında 120 dakika içinde sıfır ila %50 Eluent B degradesi kullanarak peptit karışımını arındırın. Göründükleri gibi tek tek tüplerde kesirleri toplayın. Çalışma tamamlandıktan sonra, metinde açıklandığı gibi MS ve HPLC çözümlemesi için seçilen kesirleri hazırlayın.Tüm kesirleri dondurun-kurutun ve eksi 20 derecede saklayın. Analitik HPLC gerçekleştirmek için, peptit fraksiyonları veya reaksiyon kontrolleri örneklerini bir HPLC şişesine aktarın ve suya bire bir Asetonitril%0,1 TFA karışımında çözün. HPLC şişesini, her numuneden 250 mikrolitre enjekte etmek üzere ayarlanmış analitik ters faz HPLC'nin otomatik örnekleyicisine yerleştirin.Asetonitile %0,1 TFA olarak suda %0,1 TFA'lık bir degrade elüsyon sistemi kullanın. Amino asit analizi yapmak için, 100 mikrogram saf peptidi 1,5 mililitrelik mikro-santrifüj tüpüne aktarın ve altı molar HCL'nin 200 mikrolitresinde tozu çözün. Çözeltiyi cam ampule aktardıktan sonra, boynunu bunsen brülör alevi ile ısıtarak ampulü kapatın.Daha sonra hidroliz için 110 santigrat derecede 24 saat boyunca bir ısıtma bloğunda ampul tutan bir cam tüp yerleştirin. 24 saat sonra ampulu açın ve çözeltiyi iki mililitrelik mikro santrifüj tüpüne aktarın. Çözeltiyi altmış derecede altı saat ve bir rotasyonel vakum konsantratöründe 210 kez G'de santrifüj edin.Daha sonra hidrolize ürünü numunelenmiş seyreltme tamponunun 192 mikrolitresinde çözün ve çözeltiyi mikro santrifüj süzgecinden geçirilmesi. Numuneyi 2300 kez G'de bir dakika santrifüj ettikten sonra, 100 mikrolitre filtratı bir amino asit analiz örnek tüpüne aktarın. Tüpü amino asit analizörüne yerleştirin ve analize başlayın.Bu geçmiş azaltma protokolü sırasında, kütle spektrometresi ile sonraki disülfür analizi için vazgeçilmez olan kappa mido metillenmiş türlerin iki veya dört kat Elde edilmesi için çeşitli reaksiyon kontrolleri yapmak çok önemlidir. İlk olarak 600 mikrogram saf peptidin 0,05 molar sitrat tamponunun 1,2 mililitreiçinde TCEP içeren çözünür. Karışımı oda sıcaklığında, sıfırdan 30 dakikaya kadar değişen birkaç 100 mikrolitrelik reaksiyon kontrol numunesi alarak kuluçkaya yatırın.Reaksiyonu durdurmak ve serbest tiyol gruplarının karbonil metilasyonunu gerçekleştirmek için numuneleri 1,5 mililitrelik mikro-santrifüj tüpünde 300 mikrolitre alkillenme tamponuyla karıştırın. %10 TFA ve su 100 mikrolitre ekleyerek beş dakika sonra reaksiyonu durdurun ve kuru buz üzerinde örnekleri saklayın. Şimdi metin protokolünde ayrıntılı olarak örnekler üzerinde HPLC gerçekleştirin.Oksitlenmiş formların MS/MS analizi için toplanan her fraksiyonun küçük bir miktarını 1,5 mililitrelik mikro-santrifüj tüpüne aktarın. Kalan peptiti suda %0.1 TFA olarak çözün ve 10 milimolar son TCEP konsantrasyonu elde etmek için 100 milimolar TCEP çözeltisi üzerinde uygun bir hacim ekleyin. Bu noktada, selektif sistein alkilasyonu peptit dizilimi ile kontrol edilebilir.Ortada iki peptid ile disülfür köprü deseninin belirlenmesi mümkündür. Farklı izomerlerin NMR analizi bireysel peptit yapılarını ortaya çıkarmak için yapılır. En düşük enerjiye sahip 20 yapı ve farklı izomerlerin disülfür bağlantısı gösterilmiştir.Özellikle, disülfit bağlantısının kesin olarak tanımlanması için ters fazlı HPLC MS/MS parçalanması ve NMR analizi nin bir kombinasyonu gereklidir. Kök ortalama kare sapma değerinin karşılaştırılması, katı bir peptidin çoğunlukla daha iyi çözülmüş bir NMR yapısına yol açtığını açıklığa kavuşturmuştur. Bu video, istenilen disülfür bağı deseni ile peptidleri seçici olarak nasıl sentezlediğinize bir örnek verecektir.Ayrıca ihale kütle spektrometresi ile doğru disülfür bağlantısını kontrol etme ve NMR spektroskopisi ile üç boyutlu bir yapı elde etme imkanı nı gösterir. Bu teknik, geliştirilmesinden sonra, peptid sentezi alanında araştırmacıların disülfür bağı desenlerinin üç boyutlu yapı için önemini ve dolayısıyla bu tür peptid izomerlerinin etkinliğini keşfetmelerinin önünü açmıştır. Bu prosedürü takiben, belirli biyolojik hedefte farklı peptid izomerlerinin yapı aktivitesi ilişkilerine ışık almak için ASAS aktivitesi gibi diğer yöntemler de uygulanabilmektedir.Bu yöntem conotoxins sentezi ve analizi içine fikir sağlayabilir rağmen, aynı zamanda diğer disülfür köprü peptidler ve fenzenler gibi proteinler uygulanabilir, disülfür açısından zengin hayvan toksinleri ve diğer çoklu sistein içeren moleküller.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Organic Chemistry

Chemistry

Unit 1

Stereoisomerism

SCIENTISTS IN ACTION

Production of Disulfide-stabilized Transmembrane Peptide Complexes for Structural Studies

Yapısal Çalışmaları üretimi disülfid stabilize Transmembran Peptit Kompleksi

Physical  interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane  proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane ...

Kimya

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox ...

From Constructs to Crystals &#8211; Towards Structure Determination of &#946;-barrel Outer Membrane Proteins

β-varil Dış Membran Proteinleri Yapı Tayini Doğru - Yapıların itibaren Crystals

Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% ...

X-ray Powder Diffraction in Conservation Science: Towards Routine Crystal Structure Determination of Corrosion Products on Heritage Art Objects

Koruma Bilimi X-ışını Toz Kırınım: Miras Sanat Objects Korozyon Ürünleri Rutin Kristal Yapı Tayini Doğru

The crystal structure determination and refinement process of corrosion products on historic art objects using laboratory high-resolution X-ray powder ...

Synthesis and Characterization of Fe-doped Aluminosilicate Nanotubes with Enhanced Electron Conductive Properties

Geliştirilmiş Elektron İletken özellikleri ile Fe-katkılı Alüminosilikat Nanotüpler Sentezi ve Karakterizasyonu

The goal of the protocol is to synthesize Fe-doped aluminosilicate nanotubes of the imogolite type with the formula (OH)3Al2-xFexO3SiOH. Doping with Fe ...

Probing the Structure and Dynamics of Interfacial Water with Scanning Tunneling Microscopy and Spectroscopy

Tarama tünelleme mikroskobu ve spektroskopi ile Interfacial su dinamiği ve yapısını sondalama

Water/solid interfaces are ubiquitous and play a key role in many environmental, biophysical, and technological processes. Resolving the internal ...

Fabricating High-viscosity Droplets using Microfluidic Capillary Device with Phase-inversion Co-flow Structure

Faz-inversiyon ortak akış yapısıyla mikrosıvısal kapiller aygıtı kullanarak yüksek viskozite damlacıkları imalatı

The generation of monodisperse droplets with high viscosity has always been a challenge in droplet microfluidics. Here, we demonstrate a phase-inversion ...

Synthesis of Substrate-Bound Au Nanowires Via an Active Surface Growth Mechanism

Substrat bağlı Au Nanowires bir aktif yüzey büyüme mekanizması yoluyla sentezi

Advancing synthetic capabilities is important for the development of nanoscience and nanotechnology. The synthesis of nanowires has always been a ...

Synthesis of Graphene Nanofluids with Controllable Flake Size Distributions

Kontrol edilebilir Flake boyutu dağılımları ile Graphene Nanofluids sentezi

A method for synthesizing graphene nanofluids with controllable flake size distributions is presented. Graphene nanoflakes can be obtained by the ...

Organic Structure-directing Agent-free Synthesis for *BEA-type Zeolite Membrane

*BEA tipi Zeolit Membranı için Organik Yapı Yönelimli Ajansız Sentez

Membrane separation has drawn attention as a novel-energy saving separation process. Zeolite membranes have great potential for hydrocarbon separation in ...