Name: analysis of thylakoid membrane protein complexes by blue native gel electrophoresis
Uploaded: 2018-09-28T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis at JoVE.com

Denne forskning blev økonomisk støttet af Finlands Akademi (projektnumre 307335 og 303757) og solenergi i biomasse (SE2B) Marie Skłodowska-Curie tilskudsaftalen (675006). Protokollen er baseret på reference3.

1. forberedelse BN Gel1,2,3
<ol><li>Oprette gel hjul med 8 cm x 10 cm plader (rektangulære glas og indskåret alumina plade) ifølge producentens anvisninger ved hjælp af 0,75 mm spacere.</li>
	<li>Placer en gradient mixer på en røre pladen og forbinde den med den peristaltiske pumpe ved en slange. Vedhæfte en sprøjte nål til anden enden af slangen og Placer nålen mellem glas og alumin...

<ol>
	<li>Sch&#228;gger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form.">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Analytical Biochemistry. 199, 223-231 (1991).</li><li>K&#252;gler, M., J&#228;nsch, L., Kruft, V., Schmitz, U. K., Braun, H. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+chloroplast+protein+complexes+by+blue-native+polyacrylamide+gel+electrophoresis+(BN-PAGE).">Analysis of the chloroplast protein complexes by blue-native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE).</a> Photosynthesis Research. 53, 35-44 (1997).</li><li>J&#228;rvi, S., Suorsa, M., Paakkarinen, V., Aro, E. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+native+gel+systems+for+separation+of+thylakoid+protein+complexes:+novel+super-+and+mega-complexes.">Optimized native gel systems for separation of thylakoid protein complexes: novel super- and mega-complexes.</a> Biochemical Journal. 439, 207-214 (2011).</li><li>Strecker, V., Wumaier, Z., Wittig, I., Sch&#228;gger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+pore+gels+to+separate+mega+protein+complexes+larger+than+10+MDa+by+blue+native+electrophoresis:+Isolation+of+putative+respiratory+strings+or+patches.">Large pore gels to separate mega protein complexes larger than 10 MDa by blue native electrophoresis: Isolation of putative respiratory strings or patches.</a> Proteomics. 10, 3379-3387 (2010).</li><li>Porra, R. J., Thompson, W. A., Kriedemann, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+accurate+extinction+coefficients+and+simultaneous+equations+for+assaying+chlorophylls+a+and+b+extracted+with+four+different+solvents:+verification+of+the+concentration+of+chlorophyll+standards+by+atomic+absorption+spectroscopy.">Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. , 384-394 (1989).</li><li>Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+silver+staining+of+plant+proteins,+RNA+and+DNA+in+polyacrylamide+gels.">Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels.</a> Electrophoresis. 8, 93-99 (1987).</li><li>Aro, E. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+photosystem+II:+a+proteomic+approach+to+thylakoid+protein+complexes.">Dynamics of photosystem II: a proteomic approach to thylakoid protein complexes.</a> Journal of Experimental Botany. 56, 347-356 (2005).</li><li>Suorsa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+acclimation+involves+dynamic+re-organization+of+the+pigment-protein+megacomplexes+in+non-appressed+thylakoid+domains.">Light acclimation involves dynamic re-organization of the pigment-protein megacomplexes in non-appressed thylakoid domains.</a> The plant journal for cell and molecular biology. 84, 360-373 (2015).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+Structural+Proteins+during+the+Assembly+of+the+Head+of+Bacteriophage+T4.">Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li><li>Sch&#228;gger, H., Pfeiffer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supercomplexes+in+the+respiratory+chains+of+yeast+and+mammalian+mitochondria.">Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria.</a> The EMBO Journal. 19, 1777-1783 (2000).</li><li>Rantala, S., Tikkanen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation-induced+lateral+rearrangements+of+thylakoid+protein+complexes+upon+light+acclimation.">Phosphorylation-induced lateral rearrangements of thylakoid protein complexes upon light acclimation.</a> Plant Direct. 2, 1-12 (2018).</li><li>Rantala, M., Tikkanen, M., Aro, E. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+characterization+of+hierarchical+megacomplex+formation+in+Arabidopsis+thylakoid+membrane.">Proteomic characterization of hierarchical megacomplex formation in Arabidopsis thylakoid membrane.</a> Plant Journal. 92, 951-962 (2017).</li></ol>

Fotosyntetiserende energi konvertering maskiner er sammensat af store multisubunit proteinkomplekser, som er indlejret i tylakoid membran. Denne protokol beskriver en grundlæggende metode til analyse af planten tylakoid proteinkomplekser fra Arabidopsis thaliana med BN-side kombineret med 2D-SDS-PAGE. Protokollen er også velegnet til analyse af tylakoid proteinkomplekser fra tobak og spinat tylakoiderne, men kan kræve mindre justeringer.
Til oploesning af membran proteinkomplekser,...

Store multisubunit protein komplekser photosystem PSI og PSII, Cyt b6f og ATPase koordinere produktionen af NADPH og ATP i fotosyntetiske lys reaktioner. I højere plante grønkorn ligger komplekser i tylakoid membran, der er et strukturelt heterogen membran struktur, bestående af appressed grana og ikke-appressed stroma tylakoiderne. Blå indfødte polyacrylamid gelelektroforese (BN-side) er en flittigt brugt metoden i analysen af store multisubunit proteinkomplekser i deres native og biologisk aktive form. Metoden blev etableret for dissektion af mitokondrielle membran protein komplekser1, men er senere blevet tilpasset til adskillelsen mellem proteinkomplekser tylakoid membran netværk3. Metoden er egnet (i) til rensning af individuelle tylakoid proteinkomplekser for strukturel analyse, (ii) til bestemmelse af indfødte interaktioner mellem proteinkomplekser og (iii) til analyse af overordnede organisation af proteinkomplekser efter skiftende miljø stikord.
Før adskillelse er proteinkomplekser isoleret fra membran med nøje udvalgte nonionisk rengøringsmidler, som er generelt milde og bevare den oprindelige struktur af proteinkomplekser. Vaskemidler indeholder hydrofobe og hydrofile websteder og form stabile micelles over en vis koncentration, kaldet en kritisk micellar koncentration (CMC). Øger vaskemiddel koncentrationen over CMC resultaterne i afbrydelse af lipid-lipid interaktioner og i oploesning af proteinkomplekser. Valget af vaskemiddel afhænger af stabiliteten af protein kompleks af interesse og oploesning kapacitet af vaskemiddel. Rutinemæssigt anvendes rengøringsmidler omfatter α/β-dodecyl-maltoside og digitonin. Efter oploesning af proteinkomplekser i deres hjemstat uopløselige materiale fjernes ved centrifugering. I højere planter, tylakoid membran er meget heterogenic i struktur og nogle vaskemidler (f.eks. digitonin) solubilize selektivt kun en bestemt brøkdel af membran3. For at karakterisere protein kompleks organisation eller interaktioner mellem proteinkomplekser, er det derfor afgørende at altid bestemme oploesning kapacitet af den valgte vaskemiddel ved bestemmelse af indhold af klorofyl og klorofyl a/b forholdet mellem supernatanten at vurdere udbyttet og repræsenterede tylakoid (sub) domæne, henholdsvis i den solubilized brøk. Klorofyl a/b-forhold i intakt tylakoiderne vækst-lys akklimatiseret planter er typisk omkring 3, mens chl en / b værdi af tylakoid fraktioner beriget enten i grana eller stroma tylakoiderne falder under (~ 2,5) eller overstiger (~ 4,5) værdien af samlet Tylakoider, henholdsvis.
For at give negativ ladning til proteinkomplekser, tilføjes Coomassie strålende blå (CBB) farvestof solubilized prøven. På grund af Skift afgift proteinkomplekser vandrer mod anoden og er adskilt på en acrylamid (AA) gradient ifølge deres molekylmasse og form. Effektiv og høj opløsning adskillelse er opnået ved hjælp af en lineær acrylamid koncentration gradient. Under elektroforese overflytte proteinkomplekser mod anoden, indtil de når deres størrelse-afhængige pore-størrelse grænse. Porestørrelse polyacrylamid gel afhænger af (i) den samlede acrylamid /bis- acrylamid koncentration (T) og (ii) på tværs linker bis- acrylamid monomer koncentration (C) i forhold til den samlede monomerer4. Efter separation med BN-side, kan proteinkomplekser yderligere opdeles i deres individuelle protein-underenheder af anden-dimension (2D) - SDS - PAGE. Her beskriver vi en detaljeret protokol til analyse af tylakoid membran proteinkomplekser af BN-PAGE/2D-SDS-PAGE.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-aminocaproic acid (ACA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BisTris</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide (AA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9099</td>
			<td>Caution: Neurotoxic!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-dodecyl-&#946;-D-maltoside</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>442444H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28877.292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>7044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Fluoride (NaF)</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>3688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>1073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>300410</td>
			<td>Caution:Toxic!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pefabloc SC</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11585916001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serva Coomassie Blue G</td>
			<td>Serva</td>
			<td>35050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APS (Ammonium persulfate)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED (Tetramethylethylenediamine)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(N,N&#39;-Methylene)-Bis-Acrylamide</td>
			<td>Omnipur</td>
			<td>2610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>G0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prestained Protein Marker, Broad Range (7-175 kDa)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P7708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon, Conical Centrifuge Tubes 15 ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual gel caster with 10 x 8 cm plates</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SE215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gradient maker SG5</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.75 mm T-spacers</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SE2119T-2-.75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample gel comb, 0.75 mm</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SE211A-10-.75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mighty Small SE250 vertical electrophoresis system</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SE250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPC-pump</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply, PowerPac HV</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>164-5097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocker-Shaker</td>
			<td>Biosan</td>
			<td>BS-010130-AAI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td> 
			PROTEAN II xi Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1651813</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of thylakoid membrane protein complexes by blue native gel electrophoresis

Fotosyntetiserende elektron overførsel kæde (osv) omdanner solenergi til kemisk energi i form af NADPH og ATP. Fire store proteinkomplekser indlejret i tylakoid membran høst solenergi til at køre elektroner fra vand til NADP+ via to bannersystem, og brug den oprettede proton graduering for produktion af ATP. Photosystem PSII, PSI, cytokrom b6f (Cyt b6f) og ATPase er alle multiprotein komplekser med særskilt orientering og dynamik i tylakoid membran. Værdifulde oplysninger om sammensætning og interaktioner af proteinkomplekser i tylakoid membran kan fås ved solubilizing komplekser fra membran integriteten af milde rengøringsmidler efterfulgt af indfødte gel elektroforese adskillelse af de komplekser. Blå indfødte polyacrylamid gelelektroforese (BN-side) er en analytisk metode anvendes til adskillelse af proteinkomplekser i deres native og funktionelle form. Metoden kan bruges til protein kompleks rensning for mere detaljerede strukturel analyse, men det giver også et værktøj til at dissekere de dynamiske interaktioner mellem proteinkomplekser. Metoden har blev udviklet til analyse af mitokondriel respiratorisk proteinkomplekser, men siden blevet optimeret og forbedret for dissektion af tylakoid proteinkomplekser. Her give vi en detaljeret up-to-date protokol for analyse af labile fotosyntetiske proteinkomplekser og deres vekselvirkninger i Arabidopsis thaliana.

En repræsentativ 2D-BN/SDS-PAGE system i figur 1 viser adskillelse af digitonin og β-DM-solubilized tylakoid proteinkomplekser og deres detaljerede protein-underenheder sammensætning. Protein komplekse mønster af digitonin solubilized Tylakoider (vandret gel på toppen på toppen figur 1A) indeholder PSII-LHCII-PSI megacomplex, to store PSII-LHCII supercomplexes (sc), PSI-LHCII supercomplex, PSI monomer (m), PSII m/Cyt b...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis at JoVE.com

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

En protokol til udredning af plante tylakoid protein kompleks organisation og sammensætning med blå indfødte polyacrylamid gel elektroforese (BN-side) og 2D-SDS-PAGE er beskrevet. Protokollen er optimeret til Arabidopsis thaliana, , men kan bruges til andre plantearter med mindre ændringer.

Analyse af tylakoid membran proteinkomplekser af blå indfødte gelelektroforese

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål om sammensætningen og den dynamiske organisering af de fotosyntetiske proteinkomplekser i plant thylakoidmembran. Den største fordel ved denne teknik er, at det giver mulighed for analyse af funktionelle interaktioner mellem indfødte protein komplekser og belyser plasticitet af protein kompleks organisation i forskellige miljømæssige forhold. Opsætning gel hjul otte centimeter med 10-centimeter plader i henhold til producentens anvisninger ved hjælp af 0,75-millimeter afstandsbejler.Placer en gradient mixer på en røre plade og forbinde den med peristaltiske pumpe ved slange. Fastgør en sprøjtenål til den anden ende af slangen, og placer nålen mellem glasset og aluminiumspladen. Angær en magnetisk omrører i det tunge kammer.Forbered 3,5% og 12,5% acrylamidopløsninger i 15-milliliter koniske centrifugerør som beskrevet i tekstprotokollen, så de kan bruges til separationsgelgradienten. For at forhindre utidelig polymerisering skal centrifugerørene på isen forberedes. Tilføj 5% APS og TEMED lige før pippetting løsningerne til gradient mixer.Pipette de 12,5% løsninger til det tunge kammer. Fjern luftbobler fra den kanal, der forbinder det lette og tunge kammer, ved at åbne ventilen, der forbinder de to kamre, så opløsningen kan komme ind i lyskammeret. Luk ventilen og pipette spor af opløsning tilbage til den tunge kammer.Endelig pipette 3,5%-opløsningen til lyskammeret. Tænd for magnetomrøreren. Åbn ventilerne, og tænd for den peristaltiske pumpe.Lad gelopløsningerne flyde mellem glasset og aluminiumspladen med en strømningshastighed på ca. 0,5 milliliter i minuttet. Nålen skal altid være over væsken. Når de tunge og lette kamre er tømt fylde dem med ultrarent vand.Og lad vandet forsigtigt overlejre geloverfladen. Gel polymerisering tager omkring en til to timer ved stuetemperatur. Forbered 3%acrylamid opløsningen til stablingsgelen ved stuetemperatur.Pipette stabling gel på toppen af polymeriseret adskillelse gel og placere en prøve gel kam mellem glas og aluminium plade undgå luftbobler. Efter at gelen er blevet polymeriseret i 30 til 60 minutter ved stuetemperatur, skal du fjerne kammen forsigtigt under ultrarent vand. På dette tidspunkt gelen kan opbevares ved positive fire grader Celsius i fugtige forhold i et par dage.Isolerede thylakoider fortyndes med iskold 25BTH20G-buffer til en endelig klorofylkoncentration på 1 milligram pr. milliliter. Forbered to rør til hver thylakoid prøve til at udføre både beta-DM og digitonin opløselighed. Tilføj nu en tilsvarende mængde vaskemiddelbuffer.Bland vaskemiddel og thylakoid prøve forsigtigt med en pipette og undgå at gøre luftbobler. Opløse thylakoider i to minutter på is til beta-DM opløselighed. Eller 10 minutter ved stuetemperatur med kontinuerlig skånsom blanding på en rocker eller shaker til digitoninoplubilisering.Efter inkubation fjernes det uopløselige materiale ved centrifugering ved 18.000 g i 20 minutter ved positive fire grader Celsius. Overfør supernatanten til et nyt 1,5 milliliterrør og tilsæt 1/10 volumen af Coomassie strålende blå buffer til prøven. Sæt gelen op i et lodret elektroforesesystem.Fyld det øverste bufferkammer med blå katodebuffer, og hæld anodebufferen til det nederste bufferkammer. Læg thylakoidprøverne i brøndene. Start elektroforese og gradvist øge spændingen som anført i tekstprotokollen.Kør gelen ved positive fire grader Celsius enten ved hjælp af et koldt rum eller justering af geltemperaturen med et kølesystem. Skift den blå katodebuffer til en klar katodebuffer, når prøvefronten har migreret ca. 1/3 af gelen. Efter den elektroforetiske køre scanne gelen med en fotoscanner til billedarkivering.For at udføre 2-SDS PAGE samle den lodrette elektroforese system ved hjælp af en millimeter afstandsbefængte. Forbered en standard SDS-gel med en 2D-kam som beskrevet i tekstprotokollen. Skær banen fra BN gel og læg den i en fem-milliliter rør.Derefter tilsættes to milliliter Laemmli buffer og inkubere strimlen i 45 minutter med blid omrystning ved stuetemperatur. Placer banen ved hjælp af en afstandsfra gelen undgå luftbobler. Pipette fem mikroliter af molekylvægt markør på et smalt stykke filterpapir og placere papiret i standard godt.For at forsegle BN gel strip og markørpapir hæld en 0,5%agarose i kører buffer på toppen af gel strip og lad det størkne. Udfør elektroforese i henhold til standardprotokoller. Efter den elektroforetiske køre visualisere proteiner med SUPRO Ruby plet eller sølv farvning.Repræsentative resultater af thylakoid protein komplekse mønstre af beta-DM og digitonin-opløselige prøver er vist her. De små komplekser vandrer hurtigere under det elektroforetiske løb og er derfor i den nederste del af gelen. Mens de store komplekser er i den øverste del af gelen.Digitonin generelt bevarer protein komplekser i større forsamlinger, mens beta DM forstyrrer labile protein-protein interaktioner mellem komplekser. Underenhedens sammensætning af proteinkomplekser af beta-DM og digitonin-opløselige thylakoider præsenteres her. Underenhederne for hvert kompleks findes fra den lodrette linje under det justerede kompleks.I princippet repræsenterer hvert sted i 2D-gelen et individuelt protein. Men i praksis kan flere proteiner af samme molekylmasse være til stede på et enkelt sted. Identifikationen af pletterne er baseret på massespektrometrianalyse.Efter anvendelse af denne procedure kan man fortsætte med andre metoder som elektronmikroskopi og enkelt partikelanalyse af proteinkomplekserne eluted fra den blå indfødte gel for at få strukturel indsigt i proteinkomplekserne. For at identificere ukendte protein underenheder de enkelte protein pletter fra to-dimensionelle SDS SIDE kan analyseres med masse spec. Glem ikke, at arbejde med acrylamid og digitonin kan være yderst skadeligt og forholdsregler såsom iført beskyttelseshandsker bør altid tages, mens du udfører denne procedure.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Characterization of Multi-subunit Protein Complexes of Human MxA Using Non-denaturing Polyacrylamide Gel-electrophoresis

Karakterisering af Multi-subunit proteinkomplekser af menneskelig MxA Brug ikke-denaturering Polyacrylamid Gel-elektroforese

The formation of oligomeric complexes is a crucial prerequisite for the proper structure and function of many proteins. The interferon-induced antiviral ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Brug Stillads Liposomer at Rekonstituer Lipid-proksimal protein-protein interaktioner<em&gt; In vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Løsning affinitetsrensede proteinkomplekser ved Blå Native PAGE og protein Korrelation Profilering

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for the Analysis of the N6-threonylcarbamoyladenosine TcdA Function

Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for the Analysis of the N6-threonylcarbamoyladenosine TcdA Function

Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for Analysen af<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -threonylcarbamoyladenosin TcdA-funktion

We demonstrate methods for the expression and purification of tRNA(UUU) in Escherichia coli and the analysis by gel retardation assays of the binding of ...

Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution

Analyse af superkomplekser af den mitokondrieelektron transportkæde med indfødte elektroforese, in-gel analyser og elektrolysering

The mitochondrial electron transport chain (ETC) transduces the energy derived from the breakdown of various fuels into the bioenergetic currency of the ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

Horisontal gelelektroforese til forbedret påvisning af protein-RNA-komplekser

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

DNA Polymerase aktivitet Assay ved hjælp af nær-infrarødt fluorescerende mærket DNA visualiseret af acrylamid Gel elektroforese

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID — Proteom analyse af kontekst-specifik proteinkomplekser i deres Native cellulære miljø

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 i 1: et-trins affinitet rensning for den parallelle analyse af Protein-Protein og Protein-metabolit komplekser

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Analysis of AtHIRD11 Intrinsic Disorder and Binding Towards Metal Ions by Capillary Gel Electrophoresis and Affinity Capillary Electrophoresis

Analyse af AtHIRD11 iboende lidelse og bindende mod metalioner af kapillar gelelektroforese og affinitet kapillær elektroforese

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve ...